Name: Visualisation de la mort des cellules lytiques de Macrophage pendant linfection mycobactérienne dans les embryons de poisson zèbre par lintermédiaire de la microscopie intravitale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Découvrez la visualisation de la mort cellulaire lytique des macrophages pendant l'infection mycobactérienne chez les embryons de poisson zèbre par microscopie intravitale. Cette méthode permet d'observer les comportements cellulaires in vivo avec une grande précision.

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Nous remercions le Dr Zilong Wen d'avoir partagé des souches de poissons zèbres, le Dr Stefan Oehlers et le Dr David Tobin pour le partage des ressources liées à M. marinum, Yuepeng He pour son aide dans la préparation des chiffres. Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (81801977) (B.Y.), l'Outstanding Youth Training Program de la Shanghai Municipal Health Commission (2018YQ54) (B.Y.), Shanghai Sailing Program (18YF1420400) (B.Y.), et Open Fund of Shanghai Key Laboratory of Tuberculosis (2018KF02) (B.Y.).

Le poisson zèbre a été élevé dans des conditions standard conformément aux directives sur les animaux de laboratoire pour l'examen éthique du bien-être animal (GB/T 35823-2018). Toutes les expériences de poisson zèbre dans cette étude ont été approuvées (2019-A016-01) et menées au Centre clinique de santé publique de Shanghai, Université Fudan.
1. M. marinum Single Cell Inoculum Preparation (Figure 1)
<ol><li>Décongeler le stock de glycérol De Cerulean-fluorescent M. marinum à partir de -80 oC et inoculer une plaque d'agar de 7H10 avec 10 % (v/v) OADC, 0,25 % de glycérol et 50 g/mL d'hygromycine. Incuber la plaque à 32 oC pendant environ 10 jours.</li>
	<li>Sélectionnez une colonie exprimant une fluorescence positive et inoculer 3 mL de 7H9 milieu avec 10% OADC, 0,5% de glycérol, et 50 'g/mL d'hygromycine.<ol>
<li>Incuber l'inoculation à 32 oC et 100 tours par minute (rpm) pendant 4 à 6 jours jusqu'à ce que la culture atteigne la phase logarithmique (OD600 à 0,6 à 1,0).</li>
		<li>Sous-culture (1:100) dans 30 ml de milieu frais 7H9 avec 10% OADC, 0,5% de glycérol, 0,05% Tween-80, et 50 g/mL jusqu'à ce que l'OD600 atteigne 1,0. REMARQUE: Pour la plus haute qualité de culture, une étape de sous-culture est recommandée à ce stade. D'après notre expérience, l'ajout du clone directement à un grand volume de milieu entraînera la formation d'amas bactériens.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recueillir les cellules M. marinum comme décrit ci-dessous.<ol>
<li>Centrifugeuse à 3 000 x g pendant 10 min pour recueillir le M. marinum comme granule. Jetez tous les sauf 300 L du supernatant et utilisez-le pour resuspendre le granule.</li>
		<li>Ajouter 3 mL de 7H9 moyen avec 10% de glycérol pour resuspendre davantage la pastille, puis sonicate la suspension dans un bain d'eau à 100 W à 15 s ON, 15 s OFF pour un total de 2 min. REMARQUE: Le but de la sonication est d'atteindre un homogénéisme cellulaire unique pour l'inoculum, ce qui permettra d'éviter le blocage de l'aiguille microinjection.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transférer la suspension bactérienne sur une seringue de 10 ml, puis passer à travers un filtre de 5 m pour enlever les amas bactériens.</li>
	<li>Mesurez la densité optique (OD) de la suspension à l'aide d'un spectrophotomètre et diluez-la à l'OD600 à 1,0 avec un support 7H9 contenant 10 % de glycérol. Divisez la suspension en 10 aliquots ll et entreposez-la à -80 oC de congélateur pour une utilisation future.</li>
	<li>Confirmer la concentration bactérienne de l'inoculum (cfu/mL) par dilution en série et placage du stock bactérien sur une plaque d'agar 7H10 contenant 10 % (v/v) d'OADC, 0,5 % de glycérol et 50 g/mL d'hygromycine.</li>
</ol>2. Préparation d'embryons de poisson zèbre
<ol><li>Un jour avant le frai, installez des couples reproducteurs de poissons zèbres dans la chambre de reproduction. REMARQUE : Ajoutez une seule paire à chaque chambre de reproduction.</li>
	<li>Recueillir les embryons le lendemain matin dans un délai de 1 h après la fécondation (hpf). Lavez soigneusement les embryons avec de l'eau distillée et transférez jusqu'à 100 embryons dans un plat Petri de 100 mm contenant 30 ml de milieu E3. Incuber à 28,5 oC.</li>
	<li>Après 12 h, observez au microscope et jetez les œufs non fécondés ou endommagés.</li>
	<li>À 24 hpf, changer le milieu Moyen à frais e3 avec N-phénylthiourea (PTU, 0,2 nM concentration finale) pour empêcher le développement du pigment. Incuber les embryons à 28,5 oC jusqu'à ce que les embryons soient prêts pour la microinjection.</li>
</ol>3. Infection par microinjection bactérienne
<ol><li>Préparer des aiguilles d'injection microcapillaires en verre borosilicate telles que décrites précédemment dans la référence13.</li>
	<li>Embryons de poisson zèbre s'élevant pour l'infection<ol>
<li>Micro-ondes 100 ml de 1 % (w/v) et 100 ml de 0,5 % (w/v) faible fusion agarose dans un milieu E3 autoclaved jusqu'à ce que l'agarose soit complètement fondue. Diviser en tubes aliquot de 1 ml et conserver à 4 oC pour une utilisation future.</li>
		<li>Avant de l'utiliser, chauffer l'agarose dans un bloc de chauffage de 95 oC jusqu'à ce qu'il soit complètement fondu. Maintenir l'agarose sous forme liquide en la plaçant dans un bloc de chauffage de 45 oC (figure 2).</li>
		<li>Montage pour infection intramusculaire dans la région du tronc<ol>
<li>Créez la couche inférieure d'agarose en versant 0,5 ml de 1 % (w/v) agarose uniformément sur une lame de verre. Placer sur une glacière ou une surface froide pendant 3 min pour se solidifier.</li>
			<li>Anesthésiez les embryons de poissons zèbres (48 à 72 hpf) dans l'eau des œufs avec de la tricaine (200 g/mL) et du PTU pendant 5 min avant le montage. Placez jusqu'à 60 embryons de poissons zèbres sur la couche inférieure d'agarose et étalez-les soigneusement en deux rangées (Figure 2B).</li>
			<li>Enlever toute l'eau restante sur la couche inférieure d'agarose avec du papier de soie avant d'ajouter 0,3 ml d'agarose de 0,5 % (w/v) pour créer la couche supérieure. Assurez-vous que les embryons sont complètement intégrés dans l'agarose. Remettre la glissière en verre dans la glacière à nouveau pour solidifier l'agarose et prévenir la déshydratation.</li>
			<li>Gardez la couche supérieure d'agarose humide en recouvrant la surface avec de l'eau d'oeuf s'écoulant e3.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Montage pour l'infection de midbrain<ol>
<li>Couvrir la rainure d'une seule glissière de microscopie en verre de concavité avec 1% (w/v) agarose, puis transférer les 4-6 embryons anesthésiés tricaine dans l'agarose.</li>
			<li>Placez soigneusement la tête de chaque embryon vers le haut à l'avance à l'avance avec une aiguille de 10 G (figure 2C).</li>
			<li>Une fois que les positions de tous les embryons sont fixées, transférez la glissière de verre dans une glacière ou une surface froide pour laisser l'agarose se solidifier. REMARQUE : Évitez la dilution de l'agarose faible ment en minimisant le volume de transfert d'eau d'oeuf avec les embryons.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation des bactéries à l'infection<ol>
<li>Ajouter 1 l de rouge phénol filtré stérile (10x) à un aliquot de 10 l de bouillon bactérien (fait à l'étape 1) et mélanger brièvement en vortexant. REMARQUE : La concentration finale peut être ajustée à l'aide de PBS stérile.</li>
		<li>Sonicate la préparation en utilisant 100 W à 10 s ON, 10 s OFF pendant 1 min pour briser les amas qui peuvent avoir formé14.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infection par microinjection<ol>
<li>Ajuster le micro-injecteur et le micromanipulateur à la position appropriée et le réglage pour la microinjection comme précédemment rapporté13.</li>
		<li>Transférer 3 ll de la préparation bactérienne à l'aide d'une micro chargeuse dans l'aiguille préparée (voir l'étape 3.1). Pipette lentement et soigneusement pour éviter de former des bulles d'air.</li>
		<li>Pour l'infection de la région du tronc, injecter 100 cfu dans la région du tronc (Figure 3A). Évitez d'injecter des bactéries dans le notochord. REMARQUE : Le cfu pour l'injection est estimé par la formule cfu - concentration bactérienne de stock x facteur de dilution x volume de gouttelette d'injection. Le cfu réel est confirmé par le placage d'une goutte d'inoculum bactérien sur une plaque d'agar 7H10 contenant 10% (v/v) d'OADC, 0,5% de glycérol et 50 g/mL d'hygromycine.</li>
		<li>Pour l'infection du cerveau moyen, injecter environ 500 cfu dans la région du cerveau moyen (Figure 3B).</li>
		<li>Après la microinjection, rincer soigneusement les embryons de poisson zèbre dans l'eau fraîche des œufs avec une pipette en plastique. REMARQUE : Montez les embryons dans le plat de fond en verre dès que possible pour couvrir l'observation de la réponse immunitaire innée très tôt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Imagerie en direct de l'infection
<ol><li>Montage de poissons pour l'imagerie en direct<ol>
<li>Transférer jusqu'à 10 embryons anesthésiés par tricaïne au milieu d'un plat de 35 mm en verre. Jeter le milieu E3 supplémentaire.</li>
		<li>Couvrir le plat d'une aagarose à faible point de fusion de 1 % et orienter soigneusement les embryons de poisson zèbre à l'aide d'une aiguille de 10 G. Incuber le plat en verre sur la glace pendant 10 s pour solidifier l'agarose. REMARQUE : Pour l'injection de mi-cerveaux, les embryons doivent être montés dans l'agarose avec la tête dirigée vers le haut (figure 4A). Pour l'infection intramusculaire de la région du tronc, les embryons doivent être montés latéralement dans l'agarose (figure 4B).</li>
		<li>Une fois qu'il a complètement solidifié, couvrir l'agarose avec une couche d'eau d'oeuf (plus 1 x tricaine et PTU).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Microscopie confocale de laps de temps haute résolution tricolore REMARQUE : Les étapes suivantes sont actionnées sur une microscopie confocale équipée d'une lentille objective UV de 63,0x 1,40 huile.<ol>
<li>Fixer la température de la chambre de l'environnement à 28,5 oC. Placez un peu de papier de soie humide à l'intérieur de la chambre pour fournir de l'humidité et prévenir l'évaporation de l'eau des œufs (Figure supplémentaire 1).</li>
		<li>Placer le plat en verre de 35 mm avec le poisson zèbre dans la chambre environnementale.</li>
		<li>Ouvrez le logiciel confocal et initialisez la scène. Passez à l'objectif UV d'huile 63.0 x 1.40, et localisez le poisson zèbre à l'aide du canal de champ lumineux avec un filtre différentiel de contraste d'interférence (DIC).</li>
		<li>Ouvrez le laser 405 Diode, Argon (20% de puissance) et DPSS 561 nm. Configurez la puissance laser et les paramètres de spectre appropriés. REMARQUE : Voici les paramètres du spectre pour Cerulean (excitation 405 nm; émission 456 à 499 nm), eGFP (excitation 488 nm; émission de 500 à 550 nm), DsRed2 (excitation 561 nm ; émission 575 à 645 nm)(Figure supplémentaire 2B).</li>
		<li>Choisissez le mode d'acquisition "XYZ" "Sequential Scan" et fixez le format d'images à "512 x 512 pixels" (Figure 2A).</li>
		<li>Passez à "Live Data Mode". Ciblez la position du premier poisson zèbre et marquez la position «Begin» et «End» Z. Répétez ce processus pour chacun des embryons restants. Un "Pause" peut être ajouté à la fin du programme (Figure supplémentaire 2C).</li>
		<li>Définir la boucle et le cycle du programme.</li>
		<li>Enregistrer le fichier.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Irradiation UV à cellule unique pour induire l'apoptose et l'imagerie en direct
<ol><li>Poisson de montagne tel que décrit à l'étape 4.1.</li>
	<li>Imagerie de la région du cerveau moyen de 3 jours après la fécondation (dpf) macrophage spécifique transgénique Tg (mfap4-eGFP) embryon15
</li>
	<li>Sélectionnez la région d'intérêt d'un seul macrophage étiqueté fluorescent et numérisez à une vitesse de 400 Hz et 6 % de puissance laser UV pour 50 s. REMARQUE : La vitesse et le temps de balayage doivent être optimisés en fonction du microscope individuel. Le temps de numérisation doit être optimisé pour causer les dommages importants d'ADN qui causeront plus tard l'apoptose de cellules cibles, mais pas photobleach la cellule entière.</li>
	<li>Répétez l'étape ci-dessus pour irradier plus de cellules cibles.</li>
	<li>Effectuer l'imagerie de laps de temps de la région de midbrain comme décrit dans la section 4.</li>
</ol>6. Traitement d'image
<ol><li>Effectuer "Maximum Projection" pour les images acquises.</li>
	<li>Trouvez et marquez la position et l'heure XY des cellules cibles sous la vue «Projection maximale».</li>
	<li>Revenez à la vue standard pour trouver et marquer la position Z des cellules cibles.</li>
	<li>Recadrez l'image d'une seule couche des cellules cibles.</li>
	<li>Exporter le canal de la rebandement et le champ lumineux comme des vidéos en format AVI.</li>
	<li>Recadrez la zone d'intérêt du canal de la reition et du champ lumineux dans ImageJ.</li>
	<li>Combinez les deux vidéos dans la dernière étape verticalement et enregistrez-la sous la forme d'une vidéo format AVI dans ImageJ.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Ce protocole décrit la visualisation de la mort de macrophage pendant l'infection mycobactérienne. Basé sur des facteurs tels que l'intégrité de la membrane cellulaire, la mort cellulaire induite par l'infection peut être divisée en apoptose et la mort des cellules lytiques24,25. La mort cellulaire lytique est plus stressante pour l'organisme que l'apoptose, car elle déclenche une forte réponse inflammatoire 24,<sup class="xref"...

L'infection mycobactérienne a été démontrée pour causer la mort de cellules immunitaires d'hôte1. Par exemple, une souche atténuée déclenchera l'apoptose dans les macrophages et contiendra l'infection. Cependant, une souche virulente déclenchera la mort des cellules lytiques, provoquant la dissémination bactérienne1,2. Compte tenu de l'impact de ces différents types de mort cellulaire ont sur la réponse antimycobactérienne hôte, une observation détaillée de la mort des cellules macrophages pendant l'infection mycobactérienne in vivo est nécessaire.
Les méthodes conventionnelles pour mesurer la mort cellulaire sont d'utiliser des taches de cellules mortes, telles que Annnexin V, TUNEL, ou acridine orange / propidium iodide coloration3,4,5. Cependant, ces méthodes sont incapables de faire la lumière sur le processus dynamique de la mort cellulaire in vivo. L'observation de la mort cellulaire in vitro a déjà été facilitée par l'imagerie en direct6. Cependant, si les résultats imitent avec précision les conditions physiologiques reste peu clair.
Le poisson zèbre a été un excellent modèle pour étudier les réponses anti-mycobacterium hôte. Il a un système immunitaire très conservé semblable à celui des humains, un génome facilement manipulé, et les premiers embryons sont transparents, ce qui permet l'imagerie en direct7,8,9. Après l'infection par M. marinum, le poisson zèbre adulte forme des structures granulomes matures typiques, et le poisson zèbre embryonnaire forme un granulome précoce comme les structures9,10. Le processus dynamique de l'interaction immunisée innée de cellules-bactéries a été exploré précédemment dans le modèle d'infection de M. marinum de poissons-zèbres11,12. Cependant, en raison de l'exigence de résolution spatio-temporelle élevée, les détails entourant la mort des cellules immunitaires innées restent en grande partie indéfinis.
Ici nous décrivons comment visualiser le processus de la mort de cellules lytiques de macrophage déclenchée par l'infection mycobactérienne in vivo. Ce protocole peut également être appliqué à la visualisation du comportement cellulaire in vivo pendant le développement et l'inflammation.

<table><tbody><tr><td>0,05 % Tween-80</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Seringue 10 mL</td><td>Solarbio</td><td>YA0552</td><td></td></tr><tr><td>10 % OADC</td><td>BD</td><td>211886</td><td></td></tr><tr><td>Acide 3-aminobenzoïque</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>5 &mu ; m filtre</td><td>Mille X</td><td>SLSV025LS</td><td></td></tr><tr><td>50 &mu ; l/ml hygromycine</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600230</td><td></td></tr><tr><td>7H10</td><td>BD</td><td>262710</td><td></td></tr><tr><td>7H9</td><td>BD</td><td>262310</td><td></td></tr><tr><td>A fond en verre Plat de 35 mm</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D35-10-0-N</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sangon Biotech</td><td>A60015</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Leica</td><td>TCS SP5 II</td><td></td></tr><tr><td>Chambre environnementale</td><td>Pecon</td><td>temp control 37-2 microchargeur numérique</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>No.5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Lame de microscope en verre</td><td>Bioland Scientific LLC</td><td>7105P</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100854</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Keelrein</td><td>PH-140(A)</td><td></td></tr><tr><td>M.marinum</td><td></td><td></td><td>ATCC BAA-535</td></tr><tr><td>Aiguille de micro-injection</td><td>World Precision Instruments</td><td>IB100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Microinjecteur</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>NARISHIGE</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>msp12 :cerulean</td><td></td><td></td><td>Réf. : PMID 25470057 ; 27760340</td></tr><tr><td>Rouge phénol</td><td>Sigma</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>PTU</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Lame de microscope en verre à concavité unique</td><td>Sail Brand</td><td>7103</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>SCICNTZ</td><td>JY92-IIDN</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre (OD600)</td><td>Eppendorf AG</td><td>22331 Hamburg</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Microscope</td><td>OLYMPUS</td><td>SZX10</td><td></td></tr><tr><td>Tg(mfap4 :eGFP)</td><td></td><td></td><td>Ref. : PMID 30742890</td></tr><tr><td>Tg(coro1a :eGFP ; lyzDsRed2)</td><td></td><td></td><td>Ref. : PMID 31278008</td></tr><tr><td>Tg(mpeg1 :LRLG ; lyz :eGFP)</td><td></td><td></td><td>Ref. : PMID 27424497 ; 17477879</td></tr></tbody></table>

visualisation de la mort des cellules lytiques de macrophage pendant l'infection mycobactérienne dans les embryons de poisson zèbre par l'intermédiaire de la microscopie intravitale

Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy

Zebrafish est un excellent organisme modèle pour étudier le comportement inné des cellules immunitaires en raison de sa nature transparente et la dépendance uniquement sur son système immunitaire inné au cours du développement précoce. Le modèle d'infection du poisson zèbre Mycobacterium marinum (M. marinum) a été bien établi dans l'étude de la réponse immunitaire de l'hôte contre l'infection mycobactérienne. Il a été suggéré que différents types de décès de cellules de macrophage mèneront aux résultats divers de l'infection mycobactérienne. Ici nous décrivons un protocole utilisant la microscopie intravitale pour observer la mort de cellules de macrophage dans les embryons de poisson zèbre suivant l'infection de M. marinum. Les lignées transgéniques de poisson zèbre qui étiquetent spécifiquement les macrophages et les neutrophiles sont infectées par microinjection intramusculaire de M. marinum étiqueté fluorescent dans le cerveau moyen ou le tronc. Les embryons de poissons zèbres infectés sont ensuite montés sur une faible fonte de l'agarose et observés par microscopie confocale dans les dimensions X-Y-Z-T. Parce que l'imagerie en direct à long terme nécessite l'utilisation d'une faible puissance laser pour éviter le blanchiment photo et la phototoxicité, un transgénique fortement exprimant est fortement recommandé. Ce protocole facilite la visualisation des processus dynamiques in vivo, y compris la migration des cellules immunitaires, l'interaction des agents pathogènes hôtes et la mort cellulaire.

L'infection à mycobactère peut déclencher différentes réponses de l'hôte en fonction des voies d'infection. Dans ce protocole, les embryons de poissons zèbres sont infectés par une microinjection intramusculaire de bactéries étiquetées fluorescentes dans le cerveau ou le tronc(figure 3) et observés par imagerie vivante confocale. L'infection par ces deux voies limitera localement l'infection causant le recrutement inné de cellules immunitaires et la mort cellulaire suivante.
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Ce protocole décrit une technique pour visualiser le comportement et la mort de macrophage dans le poisson zèbre embryonnaire pendant l'infection de marinum de Mycobacterium. Des étapes pour la préparation des bactéries, l'infection des embryons et la microscopie intravitale sont incluses. Cette technique peut être appliquée à l'observation du comportement cellulaire et de la mort dans des scénarios similaires impliquant une infection ou une inflammation stérile.

Visualisation de la mort des cellules lytiques de Macrophage pendant l'infection mycobactérienne dans les embryons de poisson zèbre par l'intermédiaire de la microscopie intravitale

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune ...

Ce protocole peut clairement différencier les modes de mort cellulaire de macrophage pendant l’infection mycobactérienne. En observant plusieurs embryons en parallèle, il augmente considérablement la probabilité de capturer l’ensemble du processus de mort des cellules lytiques macrophages. Ce protocole peut également être appliqué à l’observation de la mort cellulaire et d’autres comportements cellulaires dans des scénarios similaires impliquant une infection ou une inflammation stérile.Pendant l’imagerie en direct prolongée, il est très important de maintenir l’intensité du laser aussi bas que possible pour éviter le photobleaching et la toxicité. Après inoculation selon le manuscrit, centrifuger la culture à 3000 fois G pendant 10 minutes pour recueillir le marinum Mycobacterium comme une pastille. Jetez tous les microlitres du supernatant sauf 300 et suspendez la pastille.Ajouter trois millilitres de milieu 7H9 avec 10% de glycérol pour suspendre davantage la pastille, puis sonifier la suspension dans un bain d’eau à 100 watts, avec 15 secondes sur et 15 secondes de congé, pour un total de deux minutes pour atteindre un homogénéité cellulaire unique. Transférer la suspension bactérienne dans une seringue de 10 millilitres et passer à travers un filtre de cinq microns pour enlever les touffes bactériennes. À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurez la densité optique de la suspension et diluez-la avec des supports 7H9 contenant 10 % de glycérol à 600 OD à un.Divisez la suspension en 10 aliquots de microlitre, et stockez au congélateur négatif de 80 degrés Celsius pour une utilisation plus supplémentaire. Tout d’abord, chauffer l’agarose dans un bloc chauffant de 95 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit complètement fondu. Maintenez l’agarose sous forme liquide en le plaçant dans un bloc chauffant de 45 degrés Celsius.Pour monter pour l’infection intramusculaire dans la région du tronc, créer la couche agarose inférieure en versant 0,5 millilitres de poids de 1% par volume agarose uniformément sur une glissière en verre. Placez la glissade sur une glacière ou une surface froide pendant trois minutes pour la solidifier. Après avoir anesthésié les embryons de poisson zèbre, placez jusqu’à 60 embryons de poisson zèbre sur la couche d’agarose inférieure et ez-les soigneusement en deux rangées.Enlever le reste de l’eau sur la couche d’agarose inférieure avec du papier de soie, avant d’ajouter 0,3 millilitres de poids de 0,5 % en volume agarose pour créer la couche supérieure. Assurez-vous que les embryons sont complètement intégrés dans l’agarose. Remettre la glissade de verre dans la glacière pour solidifier l’agarose.Gardez la couche supérieure de l’agarose humide en couvrant la surface avec de l’eau d’oeuf E3 supplémentaire. Ensuite, réglez le microinjecteur et le micromanipulateur à la position et au réglage appropriés pour la microinjection. Transférer trois microlitres de culture bactérienne préparée dans l’aiguille préparée à l’aide d’un microchargeur.Pipette lentement et soigneusement pour éviter de former des bulles d’air. Injecter 100 CFU dans la région du tronc. Après microinjection, rincer soigneusement les embryons de poisson zèbre dans l’eau des œufs frais à l’aide d’une pipette en plastique.Pour monter pour l’infection de midbrain, employer une pipette en plastique pour transférer les quatre à six embryons tricaine-anesthésiés dans l’agarose. Placez soigneusement la tête de chaque embryon vers le haut à l’aide d’une aiguille de calibre 10. Une fois que toutes les positions des embryons sont fixées, transférer la glissade de verre dans une glacière ou une surface froide pour laisser l’agarose se solidifier.Injecter 500 CFU dans le midbrain. Après microinjection, rincer soigneusement les embryons de poisson zèbre dans l’eau des œufs frais à l’aide d’une pipette en plastique. Une fois que l’agarose s’est complètement solidifiée, recouvrez l’agarose d’une couche d’eau d’œuf.Après avoir mis en place la chambre environnementale, placez le plat de fond en verre de 35 millimètres avec le poisson zèbre dans la chambre environnementale. Ouvrez la diode 405, l’argon à 20% de puissance, et le laser DPSS 561 nanomètre. Configurer la puissance laser appropriée dans les paramètres du spectre.Choisissez le mode d’acquisition d’analyse séquentielle XYZ et définissez le format des images à 512 par 512 pixels. Passez en mode données en direct, ciblez la position du premier poisson zèbre et marquez la position Z de début et de fin. Répétez ce processus pour chacun des embryons restants.Ajouter une pause à la fin du programme. Définissez la boucle et le cycle du programme et enregistrez le fichier. Dans cette étude, nous avons utilisé le coro1a transgénique précédemment rapporté :eGFP;lyzDsRed2, et mpeg1loxP transgénique;DsRed:loxPeGFP;lyz:eGFP, pour distinguer les macrophages et les neutrophiles in vivo.Un macrophage fortement engorgé avec des bactéries est devenu rond et a montré la motilité réduite, avec le gonflement cytoplasmique éventuel, la rupture de la membrane cellulaire, et la diffusion rapide de la teneur cytoplasmique. Les macrophages UV-irradiés ont montré les phénotypes typiques de cellules apoptotiques tels que le rétrécissement cellulaire, la fragmentation nucléaire, et la condensation de chromatine. On l’a également observé les macrophages activement phagocytosed et diffusé M.merinum.Cependant, les neutrophiles ont eu la capacité phagocytic limitée, et ont rapidement subi la mort lytique de cellules sans engorgement bactérien évident. Combiné à de puissants outils d’édition génétique, ce protocole peut fournir une plate-forme efficace pour mieux comprendre l’effet d’une variété de facteurs sur l’interaction hôte-pathogène in vivo.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Embryons de poisson zèbre transparent ont prouvé hôtes modèle utile pour visualiser et les interactions entre l'étude fonctionnellement les cellules immunitaires innées et bactéries pathogènes intracellulaires, tels...

L&#39;infection des embryons de poisson zèbre avec bactéries pathogènes intracellulaires

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Préparation d’un inoculum bactérien unicellulaire

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Découvrez la visualisation de la mort cellulaire lytique des macrophages pendant l'infection mycobactérienne chez les embryons de poisson zèbre par microscopie intravitale. Cette méthode permet d'observer les comportements cellulaires in vivo avec une grande précision.

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Visualisation de la mort des cellules lytiques de Macrophage pendant l'infection mycobactérienne dans les embryons de poisson zèbre par l'intermédiaire de la microscopie intravitale

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