Visualisation de la mort des cellules lytiques de Macrophage pendant l'infection mycobactérienne dans les embryons de poisson zèbre par l'intermédiaire de la microscopie intravitale

Ce protocole peut clairement différencier les modes de mort cellulaire de macrophage pendant l’infection mycobactérienne. En observant plusieurs embryons en parallèle, il augmente considérablement la probabilité de capturer l’ensemble du processus de mort des cellules lytiques macrophages. Ce protocole peut également être appliqué à l’observation de la mort cellulaire et d’autres comportements cellulaires dans des scénarios similaires impliquant une infection ou une inflammation stérile.

Pendant l’imagerie en direct prolongée, il est très important de maintenir l’intensité du laser aussi bas que possible pour éviter le photobleaching et la toxicité. Après inoculation selon le manuscrit, centrifuger la culture à 3000 fois G pendant 10 minutes pour recueillir le marinum Mycobacterium comme une pastille. Jetez tous les microlitres du supernatant sauf 300 et suspendez la pastille.

Ajouter trois millilitres de milieu 7H9 avec 10% de glycérol pour suspendre davantage la pastille, puis sonifier la suspension dans un bain d’eau à 100 watts, avec 15 secondes sur et 15 secondes de congé, pour un total de deux minutes pour atteindre un homogénéité cellulaire unique. Transférer la suspension bactérienne dans une seringue de 10 millilitres et passer à travers un filtre de cinq microns pour enlever les touffes bactériennes. À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurez la densité optique de la suspension et diluez-la avec des supports 7H9 contenant 10 % de glycérol à 600 OD à un.

Divisez la suspension en 10 aliquots de microlitre, et stockez au congélateur négatif de 80 degrés Celsius pour une utilisation plus supplémentaire. Tout d’abord, chauffer l’agarose dans un bloc chauffant de 95 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit complètement fondu. Maintenez l’agarose sous forme liquide en le plaçant dans un bloc chauffant de 45 degrés Celsius.

Pour monter pour l’infection intramusculaire dans la région du tronc, créer la couche agarose inférieure en versant 0,5 millilitres de poids de 1% par volume agarose uniformément sur une glissière en verre. Placez la glissade sur une glacière ou une surface froide pendant trois minutes pour la solidifier. Après avoir anesthésié les embryons de poisson zèbre, placez jusqu’à 60 embryons de poisson zèbre sur la couche d’agarose inférieure et ez-les soigneusement en deux rangées.

Enlever le reste de l’eau sur la couche d’agarose inférieure avec du papier de soie, avant d’ajouter 0,3 millilitres de poids de 0,5 % en volume agarose pour créer la couche supérieure. Assurez-vous que les embryons sont complètement intégrés dans l’agarose. Remettre la glissade de verre dans la glacière pour solidifier l’agarose.

Gardez la couche supérieure de l’agarose humide en couvrant la surface avec de l’eau d’oeuf E3 supplémentaire. Ensuite, réglez le microinjecteur et le micromanipulateur à la position et au réglage appropriés pour la microinjection. Transférer trois microlitres de culture bactérienne préparée dans l’aiguille préparée à l’aide d’un microchargeur.

Pipette lentement et soigneusement pour éviter de former des bulles d’air. Injecter 100 CFU dans la région du tronc. Après microinjection, rincer soigneusement les embryons de poisson zèbre dans l’eau des œufs frais à l’aide d’une pipette en plastique.

Pour monter pour l’infection de midbrain, employer une pipette en plastique pour transférer les quatre à six embryons tricaine-anesthésiés dans l’agarose. Placez soigneusement la tête de chaque embryon vers le haut à l’aide d’une aiguille de calibre 10. Une fois que toutes les positions des embryons sont fixées, transférer la glissade de verre dans une glacière ou une surface froide pour laisser l’agarose se solidifier.

Injecter 500 CFU dans le midbrain. Après microinjection, rincer soigneusement les embryons de poisson zèbre dans l’eau des œufs frais à l’aide d’une pipette en plastique. Une fois que l’agarose s’est complètement solidifiée, recouvrez l’agarose d’une couche d’eau d’œuf.

Après avoir mis en place la chambre environnementale, placez le plat de fond en verre de 35 millimètres avec le poisson zèbre dans la chambre environnementale. Ouvrez la diode 405, l’argon à 20% de puissance, et le laser DPSS 561 nanomètre. Configurer la puissance laser appropriée dans les paramètres du spectre.

Choisissez le mode d’acquisition d’analyse séquentielle XYZ et définissez le format des images à 512 par 512 pixels. Passez en mode données en direct, ciblez la position du premier poisson zèbre et marquez la position Z de début et de fin. Répétez ce processus pour chacun des embryons restants.

Ajouter une pause à la fin du programme. Définissez la boucle et le cycle du programme et enregistrez le fichier. Dans cette étude, nous avons utilisé le coro1a transgénique précédemment rapporté :eGFP;lyzDsRed2, et mpeg1loxP transgénique;DsRed:loxPeGFP;lyz:eGFP, pour distinguer les macrophages et les neutrophiles in vivo.

Un macrophage fortement engorgé avec des bactéries est devenu rond et a montré la motilité réduite, avec le gonflement cytoplasmique éventuel, la rupture de la membrane cellulaire, et la diffusion rapide de la teneur cytoplasmique. Les macrophages UV-irradiés ont montré les phénotypes typiques de cellules apoptotiques tels que le rétrécissement cellulaire, la fragmentation nucléaire, et la condensation de chromatine. On l’a également observé les macrophages activement phagocytosed et diffusé M.merinum.

Cependant, les neutrophiles ont eu la capacité phagocytic limitée, et ont rapidement subi la mort lytique de cellules sans engorgement bactérien évident. Combiné à de puissants outils d’édition génétique, ce protocole peut fournir une plate-forme efficace pour mieux comprendre l’effet d’une variété de facteurs sur l’interaction hôte-pathogène in vivo.