Combiner des dispositifs fluides avec la microscopie et la cytométrie de débit pour étudier le transport microbien dans les médias poreux à travers les échelles spatiales

L’étude du transport des bactéries dans les systèmes poreux est importante en ce qui concerne la contamination, la propagation des maladies et la biorémédiation. Pour ces expériences dans des modèles mathématiques fonctionnant à la cellule unique, la population et le niveau de la communauté microbienne sont nécessaires. Nous présentons ici des outils pour étudier le transport bactérien à l’aide de dispositifs microfluidiques et de microscopie, ainsi que de plus grands dispositifs en combinaison avec la cytométrie du flux.

La combinaison de dispositifs microfluidiques avec microscopie et cytométrie d’écoulement offre une gamme de possibilités d’étudier les phénomènes de transport bactérien à différentes échelles spatiales. Afin d’explorer pleinement ce protocole, il est suggéré d’avoir une expérience antérieure dans la microscopie, le traitement d’image de base, la conception d’appareils microfluidiques, et la maîtrise de la cytométrie du flux. Cette vidéo décrit deux méthodes pour étudier le transport bactérien à différentes échelles spatiales.

La première méthode, basée sur des dispositifs microfluidiques, repose sur la microscopie pour compter les cellules individuelles. Ce système peut être utilisé pour étudier le transport bactérien à plusieurs échelles spatiales, du pore à l’échelle du système poreux entier. La deuxième méthode, utilisant de plus grands dispositifs fluidiques couplés à un distributeur automatisé et à une cytométrie d’écoulement, peut être utilisée pour étudier le phénomène de transport bactérien à l’échelle de systèmes poreux entiers.

Ces méthodes peuvent également être déployées dans le cadre d’études de colonnes à l’échelle de laboratoire, ainsi que de petites études sur le terrain. Pour commencer, concevez la géométrie poreuse désirée qui se compose d’une matrice de cercles. Basé sur la géométrie choisie, préparez un moule à l’aide de la photolithographie SU-8 standard.

Préparer 50 grammes de PDMS en ajoutant 90% de l’élastomer à 10% de l’agent de séchage à 90% de l’élastomer par poids dans un récipient jetable propre et mélanger les deux réaccente avec un outil propre. Appliquer un aspirateur de 100 millibar pendant 30 minutes pour éliminer l’air dissous et les bulles. Placez le moule dans une boîte de Pétri et versez le PDMS sur le moule à la hauteur désirée entre deux et cinq millimètres.

Couvrir la boîte de Pétri d’un couvercle et la garder à 60 degrés Celsius pendant au moins quatre heures. Après cela, laisser refroidir le dispositif microfluidique à température ambiante. Une fois refroidi, retirer délicatement la partie désirée de PDMS avec un scalpel.

Sceller temporairement le fond du canal PDMS avec du ruban adhésif. Avec un poinçonneur de 0,5 millimètre de diamètre, percer les canaux pour créer une entrée et une prise. Retirez la bande du canal PDMS et placez le canal avec le côté poreux orienté vers le haut.

Traitez la glissière de verre et les surfaces PDMS avec du plasma pendant environ 45 secondes chacune à température ambiante. Placez le canal PDMS prétraité sur la toboggan en verre prétraité et chauffez à 100 degrés Celsius pendant 30 minutes sur une plaque chauffante, puis retirez le dispositif microfluidique de la plaque chaude et refroidissez-le à température ambiante. Appliquer l’aspirateur pendant 30 minutes pour retirer l’air du PDMS.

Pour produire la base contenant le compartiment poreux, utilisez un micro fraisage de haute précision pour retirer 0,5 millimètre de la couche PMMA de base et moudre une rainure de la taille de 1,1 par 1,1 millimètre pour un anneau O en caoutchouc. Percer deux trous filetés pour une entrée et une sortie dans la partie supérieure de l’appareil fluidique et 12 trous pour les vis. Cela sert de couvercle de l’appareil fluide.

Après avoir nettoyé l’appareil fluide, vissez la base et le couvercle ensemble à l’aide des 12 trous filetés. Retirer le microfluidique du vide et le placer au microscope. Utilisez la pompe à seringues pour la saturer avec un tampon de motilité.

À l’aide de la microscopie Brightfield ou du contraste de phase, ajustez le grossissement pour visualiser les cellules bactériennes individuelles et concentrez-vous sur le centre du canal d’observation. Passez les paramètres du chemin lumineux à la microscopie par fluorescence. Réglez la mise au point à travers un décalage et le temps d’exposition de la caméra pour résoudre les cellules bactériennes individuelles.

Dans ce cas, 100 millisecondes. Ensuite, insérez le tube d’entrée dans un tube de deux millilitres contenant la suspension bactérienne. Inverser la direction de la pompe et commencer à retirer la suspension à un débit d’un microlitre par minute.

Scannez la section transversale de l’ensemble du canal d’observation, en enregistrant une image chaque minute. Importer des images sur une plate-forme logicielle souhaitée. Enregistrez l’arrière-plan comme la moyenne des premières images lorsqu’aucune particule n’a été enregistrée.

Soustrayez l’arrière-plan de chaque image pour supprimer le bruit de la caméra et l’aberration optique. Recadrer les images dans une région d’intérêt. Identifier une valeur seuil égale à l’intensité des pixels de fluorescence cellulaire de sorte que les valeurs supérieures au seuil incluent les cellules bactériennes.

Utilisez le traitement d’image pour soustraire la valeur seuil de chaque image. Binarize l’image résultante de sorte que les cellules bactériennes prennent une valeur d’un, tandis que l’arrière-plan prend une valeur de zéro. Retirez les grappes de pixels avec une zone plus petite que la plus petite taille de cellules bactériennes en pixels.

Sum l’image binariée pour obtenir le nombre total de pixels des clusters restants. Divisez le nombre de pixels par la taille moyenne d’une cellule bactérienne en pixels pour obtenir une estimation du nombre de cellules. Transformez les dénombrements en concentration en particules par millilitre.

Pour identifier la concentration de la suspension bactérienne injectée, injectez la suspension bactérienne dans le canal d’observation d’un dispositif microfluidique propre avec une seringue. Enregistrez l’image et calculez la concentration bactérienne influente telle qu’indiquée précédemment. Visualiser les courbes révolutionnaires en normalisant la concentration bactérienne des effluents C avec la concentration bactérienne influente C0 et en traçant C au-dessus de C0 par rapport au temps.

Afin d’analyser les vitesses locales et les trajectoires des bactéries transportées à travers la matrice poreuse, déplacez le stade du microscope vers une région d’intérêt et ajustez l’accent au centre du dispositif microfluidique. Réglez la configuration optique en microscopie de contraste de phase ou de fluorescence. Enregistrez des images en accéléré et un temps d’exposition suffisamment court pour capturer le déplacement bactérien.

Dans ce cas, 50 millisecondes. Enregistrez des images sur une quantité suffisante de temps, par exemple trois minutes. Pour supprimer le bruit de chaque image, soustrayez l’arrière-plan, qui est la moyenne de la somme de toutes les images enregistrées.

Déterminez le module du gradient numérique et normalisez-le par sa valeur maximale. Trouvez et enregistrez les coordonnées bactériennes et l’heure de l’acquisition d’images dans un fichier à trois colonnes. Effectuez une analyse de suivi des particules pour traiter les données enregistrées et calculer les trajectoires.

Pour obtenir des profils de dépôt, enregistrez une image composite de l’ensemble du canal poreux avant, c’est-à-dire l’arrière-plan, et après injection de la suspension bactérienne par le dispositif microfluidique. Retirez l’arrière-plan des images enregistrées après l’injection bactérienne. Calculer le profil de dépôt D comme la somme du signal de fluorescence bactérienne le long des sections transversales de la longueur x du canal poreux.

Visualisez le profil de dépôt comme le signal local de fluorescence par rapport à la longueur poreuse du canal. Pour installer le distributeur automatisé, placez le distributeur robotique près de l’appareil fluidique. Connectez le distributeur robotique à l’ordinateur en cours d’exécution BCNC et d’identifier le port com correcte.

En BCNC, cliquez sur le bouton d’accueil pour remettre le distributeur robotique à la position de la maison. Connectez la pompe périssaltique à l’entrée à l’aide d’un tube de 50 centimètres de long, d’un millimètre de diamètre intérieur et de l’écoulement avec le distributeur automatisé à l’aide du même tube. Pomper le milieu de culture à travers le dispositif fluide.

Notez l’arrivée du milieu à la tuyauterie de sortie fixée au distributeur robotique et placez une plaque de 96 puits qui recueillera l’écoulement. Dans le même temps, activez le distributeur robotique et injectez la suspension bactérienne par l’intermédiaire de l’appareil fluide PMMA à un débit de 0,2 millilitres par minute. Injecter une suspension bactérienne équivalente à plusieurs volumes de pores.

Par exemple, 30 fois le volume de l’appareil fluide. Après injection, passer au milieu de culture stérile jusqu’à la fin de l’expérience. Une fois qu’une plaque de 96 puits est terminée, couvrez la plaque et stockez à quatre degrés Celsius jusqu’à l’analyse de cytométrie du débit.

Analyser les échantillons avec la cytométrie du débit et visualiser les courbes de percée en normalisant la concentration bactérienne des effluents C avec la concentration bactérienne influente C0 et en traçant C au-dessus de C0 par rapport au temps. Dans cette étude, utilisant à la fois motile et non motile Pseudomonas putida KT2440, des expériences séquentielles ont été réalisées dans des dispositifs microfluidiques PDMS avec un éventail aléatoire de piliers. Des courbes de percée normalisées à la concentration des cellules injectées, aussi bien que des trajectoires bactériennes à l’échelle de pore sont montrées ici.

Des expériences avec des dispositifs fluidiques à grande échelle usinés à partir de PMMA ont également été réalisées. Motile et non-motile Pseudomonas putida KT2440 ont été injectés dans une matrice poreuse régulièrement espacée. Étonnamment, dans un environnement poreux dépourvu de biofilm, motile et non motile Pseudomonas putida KT2440 a montré un comportement de transport nettement différent basé sur des courbes révolutionnaires.

Dans une matrice poreuse colonisée pendant 48 heures avec une communauté complexe de biofilms de flux, ces différences dans les courbes révolutionnaires entre pseudomonas motiles et non motiles putida KT2440 ont disparu. Nous utilisons ce système pour étudier le transport bactérien dans les cours d’eau, mais ces outils peuvent être facilement ajustés pour étudier les phénomènes de transport bactérien dans d’autres systèmes conçus et environnementaux. Le transport bactérien par des médias poreux hydratés encapsule les processus sur plusieurs échelles spatiales.

La méthodologie présentée ici permet de relier le déplacement local des bactéries à l’échelle des pores au transport microscopique à l’ensemble du milieu poreux.