Protocole d’électroporation universel et efficace pour le génie génétique des organoïdes gastro-intestinaux

Cette méthode permet une transfection efficace des cultures cellulaires 3D telles que les organoïdes. Diverses applications du génie génétique peuvent être facilitées. Le protocole est universel et peut être exécuté en une seule journée.

Il n’a pas besoin d’une préparation approfondie ou de tampons d’électroporation spéciaux et coûteux. Cette méthode de transfection a été démontrée dans la tumeur et les organoïdes sains, mais elle peut être ajustée aux sphéroïdes et à la culture cellulaire 2D, aussi. Si vous exécutez ce protocole pour la première fois, il est important de manipuler les organoïdes avec soin en raison de leur prolifération individuelle et de leur réaction à la dissociation.

Surveillez-les au microscope pendant toute la procédure. Commencez par préchawarer des plaques de 48 puits à 37 degrés Celsius pour l’ensemencement post-électroporation, puis préparez des médiums basaux et organoïdes spécifiques à la culture selon les directives manuscrites. Cultiver cinq puits d’organoïdes par échantillon d’électroporation dans une assiette de 48 puits, préparer 230 microlitres de réaccentation de dissociation avec 10 micromolaires Y-27632 par puits.

Surveillez les organoïdes au microscope. Retirer le milieu de culture des puits et dissocier mécaniquement les organoïdes dans le mélange de dissociation préparé. Mettre en commun cinq puits par échantillon d’électroporation dans un tube de 15 millilitres.

Mélanger le contenu du tube par vortex et l’incuber pendant cinq à 15 minutes à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que des grappes de 10 à 15 cellules se produisent, en vérifiant la dissociation avec un microscope. Arrêtez la digestion en ajoutant jusqu’à 10 millilitres de milieu basal sans antibiotiques. Centrifuger le tube à 450 fois g pendant cinq minutes, jeter le supernatant, et laver les cellules deux fois avec quatre millilitres de tampon d’électroporation.

Centrifugeuse et jeter le supernatant après chaque lavage. Après les lavages, resuspendez la pastille organoïde dans 100 microlitres de tampon d’électroporation avec 30 microgrammes d’ADN plasmide. Distribuez le mélange ADN-organoïde complet dans une cuvette d’électroporation.

Assurez-vous d’éviter les bulles d’air. Définissez les paramètres d’électroporation tels que décrits dans le manuscrit du texte et appuyez sur la cuvette avec un doigt pour mélanger délicatement les cellules. Placez la cuvette dans la chambre de cuvette et appuyez sur le bouton d’impédance sur l’électroporateur pour prendre note de la valeur d’impédance.

Appuyez sur le bouton Démarrer pour lancer le programme d’électroporation et contrôler les valeurs des courants, des tensions et des énergies affichées. Après l’électroporation, ajouter immédiatement 500 microlitres de milieu de culture sans antibiotiques aux cellules et mélanger en pipetting de haut en bas. Transférer l’échantillon dans un nouveau tube de 15 millilitres et rincer la cuvette avec un milieu basal pour recueillir les cellules restantes, puis incuber les cellules à température ambiante pendant 40 minutes.

Centrifuger les cellules à 450 fois g pendant cinq minutes et jeter le supernatant. Resuspendez la pastille dans 100 microlitres de matrice de sous-sol et de graines de 20 microlitres gouttes dans une plaque préchauffée de 48 puits. Incuber la plaque pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius pour la polymérisation et ajouter 250 microlitres de culture moyenne complétée par Y-27632 et CHIR99021 par puits.

Pour déterminer l’efficacité de la transfection, vérifiez la fluorescence dans le contrôle de la transfection au microscope après 24 à 48 heures. Pour l’analyse facs, récolter les cellules comme précédemment décrit et digérer pendant 10 à 20 minutes jusqu’à ce que les cellules simples sont présentes. Ajouter jusqu’à 10 millilitres de PBS et centrifuger les cellules à 450 fois g pendant cinq minutes, puis aspirer et jeter le supernatant.

Pour discriminer les cellules vivantes, resuspendez la pastille en un millilitre de PBS et ajoutez un anticorps approprié ou un iodure de propidium. Mélanger délicatement les cellules en tapant et en les incubant à température ambiante pendant 30 minutes dans l’obscurité. Après l’incubation, laver les cellules avec 10 millilitres de PBS, puis centrifugeuses et jeter le supernatant.

Resuspendez la pastille cellulaire dans 200 microlitres de PBS et filtrez la suspension à travers une passoire de 100 micromètres dans un tube FACS. Analyser les cellules à l’aide d’une machine FACS à l’aide de la stratégie de gating appropriée et déterminer l’efficacité de la transfection. Les organoïdes de quatre entités cancéreuses différentes ont été électroporés au moins trois fois à l’aide de 30 microgrammes d’un petit plasmide ou d’un grand plasmide.

Ils ont été analysés avec la cytométrie de flux 48 heures après électroporation et gated pour la forme de cellules, les cellules simples, les cellules vivantes, et l’expression d’eGFP. Dans chacun des quatre entités organoïdes, le petit plasmide a été transfecté avec une efficacité plus élevée que le plus grand. La transfection la plus efficace du petit plasmide a été atteinte chez les organoïdes PDAC avec 92,1% de cellules GFP-positives, tandis que le grand plasmide a été transfecté avec une efficacité de 46,7%Le plasmide plus grand a été plus efficacement transfecté en organoïdes de CRC avec une efficacité moyenne de 53,4%, tandis que le petit plasmide a été transfecté avec une efficacité moyenne de 84,3%L’entité la plus difficile à transfecter étaient organoïdes gastriques de cancer , qui a démontré l’efficacité de transfection la plus basse pour les deux plasmides.

Comme preuve de concept, les organoïdes normaux humains d’estomac ont été électroporés avec un codage plasmide pour Cas9, GFP, et 2sgRNAs ciblant TP53. Les clones ont été sélectionnés par l’administration Nutlin3 et le KO TP53 a été confirmé par séquençage des allèles. Comme nous l’avons démontré avec les organoïdes de l’estomac humain, l’électroporation efficace permet diverses manipulations de base CRISPR Cas9 des cultures organoïdes, telles que ko ou knockins, de sorte que différentes maladies peuvent être modélisées.