Analyse de méthylation LINE-1 dans les cellules souches mésenchymales traitées avec des vésicules extracellulaires dérivées de l'ostéosarcome

La méthylation de l’ADN est l’une des signatures épigénétiques les plus étudiées. De nombreux cancers sont caractérisés par des changements dans les niveaux de méthylation de l’ADN, qui sont associés à l’expression aberrante des gènes et à d’autres anomalies génomiques. Les longs éléments nucléaires entrecoupés sont des séquences génomiques transposables répétitives qui ont normalement des niveaux élevés de méthylation.

Cependant, ils deviennent souvent hyperméthylés dans le cancer, qui ont comme conséquence leur activation et mènent à l’instabilité chromosomique. Dans cette étude, nous avons traité les cellules souches mésenchymales avec des vésicules extracellulaires ostéosarcome-dérivées pour voir si les VE de cancer peuvent affecter la méthylation LINE-1 dans les MECs. Le sérum bovin fœtal, qui fait partie intégrante des médias de culture cellulaire des mammifères, contient un grand nombre de VE d’origine bovine.

Ces Evs interféreront avec l’analyse d’Evs à partir de cellules de notre intérêt, par conséquent, lors de la croissance des cellules pour l’isolement ev, il est important d’utiliser EV appauvri FBS. Prenez FBS dans des tubes d’ultracentrifugeuse et placez-les dans des seaux d’ultracentrifugeuses. Équilibrez les seaux à moins de 10 milligrammes l’un de l’autre avant de les charger sur un rotor oscurant.

Placez le rotor dans l’ultracentrifugeuse et courez à 100 000 G pendant 19 heures à quatre degrés Celsius. Après la course, recueillir soigneusement la couche supérieure de couleur claire du supernatant et le transférer dans un tube de 50 millilitres. Ne pas déranger ou pipet la pastille brun foncé car il contient des VE de FBS.

Passez le supernatant à travers un filtre de 0,22 micron dans un nouveau tube de 50 millilitres. Ce FBS stérilisé par filtre et appauvri en EV peut maintenant être ajouté aux médias de culture cellulaire lors de la croissance de cellules pour l’isolement des EV. Recueillir les supports conditionnés des cellules d’ostéosarcome cultivées dans les médias appauvris en EV.

Pour enlever les cellules et les débris cellulaires, centrifugez le média conditionné à 2500 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Transférer le supernatant dans des tubes d’ultracentrifugeuse et les équilibrer comme précédemment. Centrifugeuse les tubes à 100 000 G pendant deux heures à quatre degrés Celsius.

Jetez soigneusement le supernatant en laissant environ un millilitre au fond. Ajouter environ 20 millilitres de PBS au tube et pipet doucement afin de laver et de suspendre à nouveau la pastille EV. Équilibrez les tubes et effectuez un autre tour d’ultracentrifugation avec les mêmes réglages.

Retirez soigneusement le supernatant et suspendez la pastille EV dans 200 microlitres de PBS par pipetting doux. Rangez les VE dans des tubes à faible fixation. Les VE purifiés sont caractérisés par des ballonnements occidentaux, une analyse de suivi des nanoparticules et une microscopie électronique de transmission.

Plaque 15 000 MSC par puits dans une assiette de 24 puits. Après 24 heures, retirez les vieux supports, lavez les cellules avec du PBS et changez en médias appauvris en EV. Traiter les cellules avec des OS-EVs aux points d’heure prévus.

Après avoir arrêté le traitement ev, extraire l’ADN des cellules en utilisant une méthode appropriée. Pour l’analyse de méthylation, nous avons utilisé une méthode d’amplification de sonde spécifique à la méthylation sur mesure. Concevez les sondes LINE-1 personnalisées, comme cela a été fait précédemment, par Pavicic et d’autres.

Pour les sondes de méthylation, sélectionnez trois séquences contenant le site de restriction HhaI dans la région promoteur. Pour les sondes de commande, sélectionnez sept séquences dépourvues du site de restriction HhaI du reste de la séquence LINE-1. Diluer 70 nanogrammes d’échantillon d’ADN dans le tampon TE à cinq microlitres.

Chauffer les échantillons pendant 10 minutes à 98 degrés Celsius puis laisser refroidir à 25 degrés Celsius. Ajoutez trois microlitres de mélange d’hybridation de sonde à chaque échantillon et exécutez le thermocycleur pour permettre aux sondes de s’hybrider à l’ADN. À température ambiante, ajouter 30 microlitres de mélange post-hybridation à chaque échantillon.

Transférer 10 microlitres dans un deuxième tube. Placez les deux ensembles de tubes dans le thermocycleur et incubez à 48 degrés Celsius pendant au moins une minute. Alors que les échantillons sont à 48 degrés Celsius, ajouter 10 microlitres de mélange de ligature à la première série de tubes et 10 microlitres de mélange ligature-digestion à la deuxième série de tubes.

Exécutez le prochain programme thermocylcer. Ensuite, faites tourner les tubes et réglez simultanément le thermocycleur à 72 degrés Celsius. Ajouter cinq microlitres de mélange de polymésase à chaque tube et placer les tubes dans le thermocycleur.

Exécutez le programme PCR. Pendant que le programme PCR est en cours d’exécution, préparez une solution d’un formamide millilitre contenant 2,5 microlitres de taille standard. Pipet 10 microlitres de cette solution à chaque rangée d’une plaque optique de puits 96.

Après pcr, diluer les échantillons non digérés et digérés à un à cent et un à deux cents, respectivement dans de l’eau ultra pure. Ajouter deux microlitres de produit PCR dilué à la plaque de puits 96. Centrifuger la plaque à 200 G pendant 15 à 20 secondes pour enlever les bulles d’air.

Effectuer l’analyse de fragments d’échantillons par électrophorèse capillaire. Ouvrez l’électrophoresis capillaire se traduit par un logiciel d’analyse d’électrophéogramme. Sélectionnez un échantillon et réglez le panneau en MLPA dans le menu.

Cliquez sur le panneau et le contrôle de presse D pour appliquer ce paramètre à tous les échantillons. De la même manière, définissez la méthode d’analyse en microsatellite par défaut pour tous les échantillons. Sélectionnez tous les échantillons et cliquez sur le bouton de lecture vert pour exécuter l’analyse, puis sélectionnez tous les échantillons et cliquez sur le bouton graphique pour visualiser les pics de sonde.

Zoomez sur la région de pointe pour une résolution plus élevée des pics individuels. Assurez-vous que les 10 pics correspondant aux sondes du mélange de sonde LINE-1 sont étiquetés. Dans l’onglet génotypes, exportez les résultats dans le format CSV.

Ouvrez le fichier CSV dans un logiciel d’analyse de données et triez les données en colonnes. Étiquetez les trois pics du site de méthylation en fonction de leur taille. Les sept autres pics correspondent aux sondes de commande.

Ici, nous utilisons les pics de sonde LINE-1 2M qui ont une taille d’environ 117 paires de base. Pour chaque échantillon, calculer la superficie maximale de la somme des sept pics de contrôle. Divisez la zone de pointe de chaque sonde LINE-1 par cette somme.

Pour chaque échantillon, divisez la valeur de l’échantillon digéré par celle de l’échantillon non digéré pour obtenir le rapport posologique de méthylation. L’analyse occidentale de ballonnement a confirmé la présence d’OS-EVs avec des signaux observés pour TSG101, HSP70, et CD63. L’absence de signal de calnexine indiquait que l’échantillon de ve était pur.

Une indication supplémentaire de pureté a été observée avec TEM avec des vésicules intactes de différentes tailles présentes dans l’échantillon d’OS-EV. La concentration et la distribution de la taille des particules OS-EV ont été mesurées par NTA. 80% des VE étaient de la taille de 50 à 200 nanomètres.

Ici, nous pouvons voir les rapports de dosage de méthylation de LINE-1 à partir de MSCs à différents moments du traitement ev. La ligne grise représente le niveau de méthylation de base à partir du point de temps zéro. Au point trois de temps, il y a une diminution du rapport moyen de dosage de méthylation après administration des VE, indiquant de ce fait l’hyperméthylation.

Cet effet hyperméthylique des VE est moins prononcé à l’époque point sept. Ici, nous avons montré une technique simple, très sensible et robuste pour l’analyse de méthylation. Il nécessite une faible quantité d’ADN sans conversion de bisulfite impliquée et il convient également à l’ADN isolé à partir d’échantillons incorporés par la paraffine.

L’ensemble de la méthode, avec les parties expérimentales et analytiques, prend environ deux jours. En raison d’un nombre élevé de copies de LINE-1 dans le génome, la méthylation de base de LINE-1 est élevée dans les échantillons normaux. Par conséquent, les différences dans les niveaux de méthylation des échantillons, comme observé avec cette méthode, peuvent être subtiles.