Name: 3D Multicolor DNA FISH Outil pour étudier larchitecture nucléaire dans les cellules primaires humaines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Apprenez la technique 3D multicolor DNA FISH pour visualiser les loci génomiques dans les cellules primaires humaines. Cette méthode permet d'étudier l'architecture nucléaire et les interactions chromosomiques à l'échelle cellulaire.

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Les auteurs reconnaissent l'assistance technique de l'INSTALLATION d'imagerie INGM (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi" (INGM), Milan, Italie), en particulier C. Cordiglieri, pour l'assistance lors des images 3D multicolor DNA FISH Achat. Ce travail a été soutenu par les subventions suivantes à B.B.: EPIGEN programme phare italien, Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon, subvention nr 18754) et Giovani Ricercatori, ministère italien de la Santé (GR-2011-02349383). Ce travail a été soutenu par la subvention suivante à F.M.: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, subvention nr 2018-0321).

1. Procédures de préparation et d'étiquetage de la sonde d'ADN avec traduction de pseudo
<ol><li>Purifiez et nettifiez les chromosomes artificiels bactériens (BAC), les plasmides ou les produits PCR avec des kits spécifiques (Table of Materials), resuspend in ddH2O, vérifier par électrophorèse sur un gel agarose et quantifier.</li>
	<li>Effectuer une traduction de pseudo sur 1,5 à 2 g d'ADN à partir de l'étape 1.1 dans un volume final de 50 L en mélangeant tous les réactifs dans un tube d'ADN liant de 0,5 mL bas selon le tableau 1. REMARQUE : Les sondes directement étiquetées peuvent améliorer le rapport signal/bruit. Des kits pour produire des sondes indirectement et directement étiquetées avec divers fluorochromes Alexa par traduction de pseudo sont disponibles dans le commerce.</li>
	<li>Incuber le mélange de traduction de pseudo dans un mélangeur thermique à 16 oC pendant un certain temps en fonction de la longueur du matériel d'ADN de départ : 45 min pour les produits PCR (un pool de produits PCR de 2 000 bp chacun) et jusqu'à 4 h pour l'ADN BAC et les plasmides.</li>
	<li>Vérifiez la taille des sondes produites à l'étape 1.3 par électrophoresis sur un gel agarose de 2,2%. REMARQUE : La taille optimale de la sonde est de 200 pb(figure 1A).<ol>
<li>Si l'ADN n'est pas assez digéré, ajoutez 5 U de polymérase d'ADN I et 0,05 U de DNase I à la réaction et incubez pendant 1 à 2 h à 16 oC et vérifiez par la suite. Arrêtez la réaction avec 0.5 mM EDTA (concentration finale). Stocker les sondes à -20 oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour chaque expérience DNA FISH, précipitez les quantités suivantes de sondes en fonction du matériel d'ADN de départ à partir duquel les sondes sont produites : 200 ng de produits PCR traduits en pseudo, 100 ng de BAC traduits en pseudo, ou 300 ng de pseudo traduit plasmide. Ajouter ddH2O jusqu'à 150 O, 20 g d'ADN de sperme de saumon non étiqueté, 3,5 g d'ADN Cot-1 spécifique à l'espèce, 3 volumes de 100 % EtOH et 1/10 volume de 3 M d'acétate de sodium pH 5,2. Précipitation à -80 oC pendant 1 h.</li>
	<li>Centrifugeàeur à vitesse maximale pendant 1 h à 4 oC et jetez le supernatant. Laver la pastille deux fois avec 70% EtOH.</li>
	<li>Resuspendre la pastille en 2 l de 100% de pH 7.0 formamide, secouer à 40 oC pendant 30 minutes (peut prendre jusqu'à quelques heures) puis ajouter un volume égal de 4x de citrate saline-sodium (SSC)/20% de sulfate de dextran.<ol>
<li>Préparer 20x SSC en mélangeant 175,3 g de NaCl et 88,2 g de citrate de sodium dans un volume final de 1 L de H2O. Autoclave, filtrer et préparer les aliquots. REMARQUE: Pour l'ADN multicolore FISH, les différentes sondes peuvent être précipitées ensemble, sauf pour les sondes qui peuvent annexer les uns avec les autres. Dans ces cas spécifiques, traitez-les séparément, précipitez et suspendez de nouveau les sondes divisant les réactifs mentionnés dans les étapes 1.5-1.7 en ce qui concerne le nombre de sondes. Pool les sondes seulement après la résuspension dans formamide. Si des couvercles en verre de plus de 10 mm ou moins de 10 mm sont utilisés, augmenter/descendre le volume des réactifs utilisés dans les étapes 1,5 à 1,7 proportionnellement à la taille de la glissière. Les sondes d'hybridation peuvent être stockées à -20 oC pendant une longue période (jusqu'à deux mois).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fixation cellulaire, prétraitement et perméabilisation
REMARQUE : Les passages de perméabilisation et de déprotéinisation sont des étapes cruciales. Le temps de réaction et de concentration des réactifs dépend fortement du type de cellule, de l'abondance du cytoplasme et de la morphologie nucléaire.
<ol><li>Fixation cellulaire, prétraitement et perméabilisation pour les lymphocytes T primaires humains REMARQUE: Ce protocole est adapté pour les petites cellules, avec de petits noyaux et une faible quantité de cytoplasme.<ol>
<li>Utilisez des couvercles en verre (10 mm, épaisseur No. 1.5H).</li>
		<li>Laver le verre avec ddH2O, puis avec 70% EtOH et les laisser sécher. Utilisez un verre pour chaque puits d'une assiette de 24 puits.</li>
		<li>Ajouter 200 l de 0,1 % de polylysine (w/v)(tableau des matériaux)directement sur le verre pour former une goutte. Faites attention car la goutte doit rester sur la surface de verre sans toucher le puits pendant 2 à 5 min. Laissez la goutte soigneusement, et laissez le verre sécher pendant 30 min.</li>
		<li>Effectuez l'étape 2.1.3 deux fois plus.</li>
		<li>Mettre 200 l de cellules de suspension (2 x 106/mL, suspension PBS des lymphocytes T primaires ex vivo) directement sur le verre, permettent aux cellules de semer à température ambiante (RT) pendant 30 min.</li>
		<li>Retirez rapidement la goutte. Ajouter le PFA fraîchement préparé à 4 % (préparé en PBS/0,1 % TWEEN 20, pH 7,0, filtré) pendant 10 min et fixer les cellules ensemoit à RT.</li>
		<li>Laver trois fois pendant 5 min chacun avec 0,05% Triton X-100/PBS (TPBS) à RT. Permeabilize avec 0,5% TPBS pour 10 min à RT.</li>
		<li>Effectuer le traitement de RNase en ajoutant 2,5 l de cocktail RNase(Table of Materials) dans 250 'L de PBS/puits dans une assiette de 24 puits pendant 1 h à 37 oC.</li>
		<li>Rincer dans le PBS, ajouter 20 % de glycérol/PBS et couver toute la nuit (ON) à 4 oC. REMARQUE: Cette étape peut varier de 1 h à ON. Les glissières peuvent être conservées dans 20 % de glycérol/PBS à 4 oC jusqu'à 7 jours.</li>
		<li>Congeler sur de la glace sèche (15 à 30 s), décongeler graduellement à rt et tremper dans 20 % de glycérol/PBS. Répétez l'étape 2.1.9 encore trois fois.</li>
		<li>Laver en TPBS de 0,5 % pendant 5 min à RT. Wash en 0,05 % TPBS, deux fois pendant 5 min à RT. Incubate en 0.1 N HCl pendant 12 min à RT. Rinse en 2x SSC.</li>
		<li>Incubate dans 50% formamide pH 7.0/2x SSC ON à RT. REMARQUE : Le temps d'incubation peut être optimisé et éventuellement réduit. Les glissières peuvent être conservées dans 50% formamide/2x SSC pendant plusieurs jours.</li>
	</ol></li>
	<li>Fixation cellulaire, prétraitement et perméabilisation des myoblastes primaires humains REMARQUE: Ce protocole est adapté pour les grandes cellules, avec une grande quantité de cytoplasme.<ol>
<li>Cultivez les myoblastes primaires humains directement sur les verres de couverture dans des plaques de 24 puits dans le milieu de croissance (le milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM), 20% de sérum bovin foetal (FBS), le facteur de croissance de fibroblaste de 25 ng/mL (FGF), le facteur épidermique de 10 ng/mL (EGF), l'insuline humaine de 10 g/mL, 1x glutamine, 1x pénicilline/streptomycine) pendant au moins 24 h (atteignant 50 à 70% de la confluence). REMARQUE : Pour faciliter l'adhérence, la gélatine ou le collagène ou la poly-l-lysine peuvent être utilisés pour enrober le bordereau avant l'ensemencement.</li>
		<li>Rincer les cellules dans les changements de 2 à 3 de PBS. Ajouter fraîchement fait 4% PFA et fixer les cellules pendant 10 min à RT.</li>
		<li>Laver trois fois pendant 3 min chacun en 0,01% TPBS à RT. Permeabilize en 0,5% TPBS pour 10 min à RT.</li>
		<li>Effectuer le traitement de RNase en ajoutant 2,5 l de cocktail RNase(Table of Materials) dans 250 'L de PBS/puits dans une assiette de 24 puits pendant 1 h à 37 oC.</li>
		<li>Rincer dans PBS, ajouter 20% de glycérol/PBS, et incuber ON à RT. REMARQUE: Cette étape peut varier de 1 h à ON. Les glissières peuvent être conservées dans 20 % de glycérol/PBS à 4 oC jusqu'à 7 jours.</li>
		<li>Congeler sur de la glace sèche (15 à 30 s), décongeler graduellement à rt et tremper dans 20 % de glycérol/PBS. Répétez cette étape trois fois.</li>
		<li>Laver trois fois pendant 10 min chacun en PBS. Incuber en 0.1 N HCl pendant 5 min à RT. Rinse en 2x SSC.</li>
		<li>Incubate dans 50% formamide pH 7.0/2x SSC ON à RT. REMARQUE : Le temps d'incubation peut être optimisé et éventuellement réduit. Les glissières peuvent être conservées dans 50% formamide/2x SSC pendant plusieurs jours.</li>
		<li>Diapositives d'équilibre (maintenues dans 50% formamide/2x SSC) en 2x SSC pendant 2 min. Ensuite, équilibrez en PBS pendant 3 min.</li>
		<li>Traiter avec 0,01 N HCl/0.0025% pepsine de quelques secondes jusqu'à 5 min, selon le type de cellule. Au cours de cette étape, observez les cellules sous un microscope optique et arrêtez la réaction (étape 2.2.11) dès que les noyaux sont exempts du cytoplasme, tout en maintenant leur structure intacte (par exemple, les nucléoles sont encore visibles et intacts).</li>
		<li>Inactiver la pepsine en lavant deux fois pendant 5 min chacun e en 50 mM MgCl2/PBS.</li>
		<li>Post-fixer dans 1% PFA/PBS pendant 1 min. Laver pendant 5 min en PBS. Laver deux fois pendant 5 min chacun en 2x SSC, puis ajouter 50% formamide/2x SSC pendant au moins 30 min.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Hybridation 3D multicolorE D'ADN FISH
<ol><li>Dénaturer les sondes à 80 oC pendant 5 min, puis les mettre rapidement sur la glace.</li>
	<li>Chargez les sondes d'hybridation sur une lame de microscope propre. Tournez le bordereau avec des cellules à l'envers sur la goutte de sondes d'hybridation.</li>
	<li>Scellez la glissière de couverture avec du ciment en caoutchouc. Laisser sécher complètement le ciment en caoutchouc. Ensuite, placez les glissières sur un bloc de chauffage et dénaturez à 75 oC pendant 4 min. REMARQUE : Le moment de la dénaturation et la température de la dénaturation peuvent être augmentés, jusqu'à 80 oC.</li>
	<li>Hybrider à 37 oC ON dans une boîte métallique flottant dans un bain d'eau. REMARQUE : Pour améliorer le rapport signal/bruit, la température d'hybridation peut aller jusqu'à 42 oC.</li>
	<li>Épluchez le ciment en caoutchouc, immerger les lames dans 2x SCC, dépouiller le bordereau en verre et le transférer à 2x SSC dans une assiette de 6 puits.</li>
	<li>Laver en 2x SSC trois fois pendant 5 min chacun à 37 oC, en secouant à 90 tr/min dans un shaker d'incubateur. Laver en 0,1x SSC trois fois pendant 5 min chacun à 60 oC, en secouant à 90 tr/min dans un shaker d'incubateur. Rincer brièvement dans 4x SSC/0.2% TWEEN 20.</li>
</ol>4. Détection 3D multicolore d'ADN FISH
REMARQUE : Pour les sondes directement étiquetées, sautez les étapes 4.1 et 4.2.
<ol><li>Bloquer dans 4x SSC/0.2% TWEEN 20/4% d'albumine de sérum bovin (BSA) pendant 20 min à 37 oC dans une assiette de 24 puits, en secouant à 20 tr/min dans un shaker d'incubateur.</li>
	<li>Incuber avec la concentration appropriée d'anti-digoxygénine (1:150), et/ ou de streptavidin (1:1,000) (Tableau des matériaux) dilué dans 4x SSC/0.2% TWEEN 20/4% BSA pendant 35 min dans une chambre sombre et humide à 37 oC.</li>
	<li>Laver en 4x SSC/0,2% TWEEN 20 trois fois pendant 5 min chacun à 37 oC, en secouant à 90 tr/min dans une assiette de 6 puits dans un shaker.</li>
	<li>Équilibre dans PBS et post-fixe dans 2% formaldéhyde/PBS pendant 2 min à RT dans une plaque de 24 puits. REMARQUE : Les sondes directement étiquetées n'ont pas besoin de post-fixation.</li>
	<li>Laver 5x brièvement dans PBS. Tache avec 1 ng/mL DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)/PBS pendant 5 min à RT.</li>
	<li>Laver 5x brièvement dans PBS. Mont avec solution antifade (Tableau des Matériaux).</li>
</ol>5. Microscopie et analyse 3D multicolorDNA FISH
<ol><li>Acquérir des images 3D avec un système de microscope. REMARQUE : Ici, un microscope à champ large avec une distance axiale de 0,2 à 0,25 m entre les sections consécutives (figure 1B) est utilisé.</li>
	<li>Analysez les piles d'images 3D à l'aide de différents logiciels et outils (ici, NuCLMD ou Nuclear Contacts Locator en 3D). REMARQUE : L'outil NuCLMD a été développé afin d'analyser automatiquement l'ADN multicolor edeur3D FISH dans les piles z d'image cellulaire de fluorescence. NuCL-D reconstitue les noyaux à partir de piles d'images cellulaires en 3D et détecte et localise les taches 3D fluorescentes. Il mesure le positionnement relatif des taches dans le noyau (p. ex., la distance par rapport au centroïde des noyaux et/ou de la périphérie des noyaux) et le rayon maximal pour chaque noyau et chaque distance entre les taches. L'outil et l'algorithme utilisé sont entièrement décrits dans Cortesi et al.16.</li>
	<li>Analyser les données (p. ex., distances 3D entre les loci génomiques spécifiés et les fréquences de contact et de centroïdes nucléaires) récupérées par NuCL-D. REMARQUE : Pour les distances 3D entre les loci génomiques spécifiés et le centroïde nucléaire, normalisez les distances sur le rayon maximum de chaque noyau et représentent ces données comme des distributions de fréquences des distances normalisées du centroïde nucléaire. Pour les études d'interactions à longue portée, les fréquences de contact sont censées être de l'ordre de 10 à 20 %21 avec un seuil inter-distance qui peut varier et peut être mis autour de 2 m35.<ol>
<li>Pour effectuer une analyse statistique, analysez environ 100 noyaux par réplique biologique. Représenter les distances 3D entre les loci génomiques spécifiés comme des distributions cumulatives de fréquences inférieures au seuil inter-distance sélectionné et utiliser un test tpour évaluer l'importance des différences dans les distributions. En outre, calculer le pourcentage de noyaux positifs pour les interactions qui sont en dessous du seuil inter-distance sélectionné, et utiliser le test exact de Fisher pour évaluer l'importance des différences dans les pourcentages.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Cremer, T., Cremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+territories%2C+nuclear+architecture+and+gene+regulation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells.</a> Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).</li>
<li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li>
<li>Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+and+analysis+of+chromosome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).</li>
<li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+function+of+the+3D+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Genetics%22%5BJournal%5D)">Organization and function of the 3D genome.</a> Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772(2016).</li>
<li>van Steensel, B., Furlong, E. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+transcription+in+shaping+the+spatial+organization+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).</li>
<li>Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+genome+organization+and+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial genome organization and cognition.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).</li>
<li>Pombo, A., Dillon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+genome+architecture%3A+players+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).</li>
<li>Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+contact+permits+transcription+between+coregulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes.</a> Cell. 155 (3), 606-620 (2013).</li>
<li>Therizols, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+decondensation+is+sufficient+to+alter+nuclear+organization+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells.</a> Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).</li>
<li>Gonzalez-Sandoval, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinuclear+Anchoring+of+H3K9-Methylated+Chromatin+Stabilizes+Induced+Cell+Fate+in+C.+elegans+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos.</a> Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).</li>
<li>Hubner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+nuclear+landscapes+during+human+myelopoietic+cell+differentiation+maintains+co-aligned+active+and+inactive+nuclear+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 47(2015).</li>
<li>Aymard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+long-range+contacts+unveils+clustering+of+DNA+double-strand+breaks+at+damaged+active+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).</li>
<li>Sellou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+poly%28ADP-ribose%29-dependent+chromatin+remodeler+Alc1+induces+local+chromatin+relaxation+upon+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).</li>
<li>Krijger, P. H., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+disease-associated+gene+expression+in+the+3D+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).</li>
<li>Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+TADs%3A+How+Alterations+of+Chromatin+Domains+Result+in+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease.</a> Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).</li>
<li>Cortesi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4q-D4Z4+chromatin+architecture+regulates+the+transcription+of+muscle+atrophic+genes+in+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy.</a> Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).</li>
<li>Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+divergence+of+regulatory+strategies+at+Hox+Loci+and+the+origin+of+tetrapod+digits%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits.</a> PLoS Biology. 12 (1), 1001773(2014).</li>
<li>Woltering, J. M., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrapod+axial+evolution+and+developmental+constraints%3B+Empirical+underpinning+by+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model.</a> Mechanisms of Development. 138, Pt 2 64-72 (2015).</li>
<li>de Laat, W., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3C-based+technologies+to+study+the+shape+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">3C-based technologies to study the shape of the genome.</a> Methods. 58 (3), 189-191 (2012).</li>
<li>Denker, A., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second+decade+of+3C+technologies%3A+detailed+insights+into+nuclear+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization.</a> Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).</li>
<li>Finn, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Heterogeneity+and+Intrinsic+Variation+in+Spatial+Genome+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization.</a> Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).</li>
<li>Zheng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+chromatin+interactions+with+single-molecule+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision.</a> Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).</li>
<li>Solovei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+on+tissue+cryosections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections.</a> Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).</li>
<li>Cremer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+3D+fluorescence+in+situ+hybridization+for+imaging+interphase+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).</li>
<li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+three-dimensional+localization+microscopy+across+large+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes.</a> Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+super-resolution+imaging+with+qPAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative super-resolution imaging with qPAINT.</a> Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+genomic+loci+in+living+human+cells+by+an+optimized+CRISPR%2FCas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system.</a> Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).</li>
<li>Nelles, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+RNA+Tracking+in+Live+Cells+with+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9.</a> Cell. 165 (2), 488-496 (2016).</li>
<li>Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifaceted+FISH+approach+to+study+endogenous+RNAs+and+DNAs+in+native+nuclear+and+cell+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocol+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures.</a> Current Protocol of Human Genetics. , Chapter 4, Unit 4 15(2013).</li>
<li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+immunofluorescence%2C+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization%2C+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes%2C+transcriptional+activity%2C+nuclear+organization%2C+and+X-chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).</li>
<li>Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele-specific+nuclear+positioning+of+the+monoallelically+expressed+astrocyte+marker+GFAP%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP.</a> Genes & Development. 22 (4), 489-498 (2008).</li>
<li>Kraus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+structured+illumination+microscopy+of+nuclear+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures.</a> Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).</li>
<li>Solovei, I., Cremer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-FISH+on+cultured+cells+combined+with+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).</li>
<li>Skinner, B. M., Johnson, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+morphologies%3A+their+diversity+and+functional+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance.</a> Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).</li>
<li>Schoenfelder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pluripotent+regulatory+circuitry+connecting+promoters+to+their+long-range+interacting+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements.</a> Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).</li>
<li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).</li>
<li>Beliveau, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+super-resolution+imaging+of+chromosomes+and+in+situ+haplotype+visualization+using+Oligopaint+FISH+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes.</a> Nature Communication. 6, 7147(2015).</li>
<li>Beliveau, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+design+and+synthesis+platform+for+visualizing+genomes+with+Oligopaint+FISH+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).</li>
<li>Samacoits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computational+framework+to+study+sub-cellular+RNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">A computational framework to study sub-cellular RNA localization.</a> Nature Communication. 9 (1), 4584(2018).</li>
<li>Cardozo Gizzi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy-Based+Chromosome+Conformation+Capture+Enables+Simultaneous+Visualization+of+Genome+Organization+and+Transcription+in+Intact+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms.</a> Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).</li>
<li>Mateo, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+DNA+folding+and+RNA+in+embryos+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution.</a> Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).</li>
<li>Nir, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Walking+along+chromosomes+with+super-resolution+imaging%2C+contact+maps%2C+and+integrative+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling.</a> PLoS Genetics. 14 (12), 1007872(2018).</li>
<li>Bintu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+chromatin+tracing+reveals+domains+and+cooperative+interactions+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells.</a> Science. 362 (6413), (2018).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

La méthode actuelle décrit un protocole étape par étape pour effectuer 3D MULTIcolor DNA FISH sur un large éventail de cellules primaires humaines. Bien que l'ADN FISH soit une technologie largement utilisée, l'ADN 3D multicolore FISH sur les noyaux interphases 3D conservés est encore difficile à réaliser dans de nombreux laboratoires, principalement en raison des caractéristiques des échantillons utilisés23,24.
La traduction de pseudo...

Les eucaryotes plus élevés doivent condenser et compacter systématiquement une énorme quantité d'informations génétiques dans l'espace 3D minute du noyau1,2,3,4. Aujourd'hui, nous savons que le génome est classé spatialement dans des compartiments et des domaines topologiquement associés5 et que les niveaux multiples de pliage de l'ADN génèrent des contacts entre différentes régions génomiques qui peuvent impliquer la formation de boucle de chromatine6,7. La boucle dynamique 3D de la chromatine peut influencer de nombreux processus biologiques différents tels que la transcription8,9, la différenciation et le développement10,11, réparation de l'ADN12,13, tandis que ses perturbations sont impliqués dans diverses maladies14,15,16 et les défauts de développement15,17,18.
De nombreuses approches ont été développées pour étudier l'organisation du génome 3D. Des technologies basées sur le capture de conformation de chromosome (C-technologies, 3C, 4C, 5C, Hi-C et dérivés) ont été développées pour étudier l'organisation de génome dans les cellules fixes3,4,19,20. Ces approches sont basées sur la capacité de capturer les fréquences de contact entre les loci génomiques à proximité physique. C-technologies, en fonction de leur complexité, attraper l'organisation mondiale du génome 3D et la topologie nucléaire d'une population cellulaire3,4,19,20. Néanmoins, les interactions 3D sont dynamiques dans le temps et l'espace, très variables entre les cellules individuelles composées d'interactions multiplexes, et sont largement hétérogènes21,22.
L'hybridation 3D de fluorescence in situ de l'ADN multicolore (FISH) est une technique qui permet la visualisation de loci génomiques spécifiques à un seul niveau de cellule, permettant une étude directe de l'architecture nucléaire 3D d'une manière complémentaire aux technologies C. Il représente une technologie actuellement utilisée pour valider sans ambiguïté les résultats C. 3D multicolor DNA FISH utilise des sondes étiquetées fluorescentes complémentaires aux loci génomiques d'intérêts. L'utilisation de différents fluorophores et d'équipements de microscopie appropriés permet la visualisation contemporaine de cibles multiples dans l'espace nucléaire23,24. Ces dernières années, FISH a été combiné avec les progrès technologiques dans la microscopie pour obtenir la visualisation des structures à échelle fine à haute résolution25,26 ou avec des approches CRISPR-Cas pour la visualisation des acides nucléiques en imagerie en direct27,28. Malgré une large adoption, l'approche 3D multicolor DNA FISH est encore considérée comme difficile dans de nombreux laboratoires car le matériel biologique utilisé doit être adapté.
Ici, nous fournissons un protocole complet pour 3D multicolor DNA FISH (de la préparation cellulaire / sonde à l'analyse des données) applicable à un large éventail de cellules primaires humaines, permettant la visualisation de loci génomiques multiples et la préservation de la structure 3D des noyaux. Afin d'étudier l'architecture nucléaire, la structure 3D des noyaux doit être préservée. Pour cette raison, contrairement à d'autres protocoles existants29,30,31, nous évitons l'utilisation d'un gradient d'alcool et le stockage des couvertures dans l'alcool qui peut affecter la structure de chromatine32. La méthode est adaptée à partir de protocoles FISH d'ADN 3D conservés24,33 à appliquer à un large éventail de cellules primaires humaines, à la fois isolées ex vivo ou cultivées in vitro. Il existe des paramètres de perméabilisation et de déprotéinisation pour différentes morphologies nucléaires et caractéristiques cytologiques (p. ex., différents degrés de compactage nucléaire, abondance de cytosquelettes)34. Ces paramètres sont souvent généralement décrits dans d'autres protocoles24,33, sans fournir une discrimination claire de la procédure au sein de différents types de cellules. En outre, nous avons développé un outil spécifique nommé NuCLD (localisateur de contacts nucléaires en 3D)16, fournissant des principes pour l'analyse des données qui permettra d'améliorer la proximité 3D entre les différents loci et leur distribution topologique nucléaire dans l'espace nucléaire d'une manière automatisée.

<table><tbody><tr><td>Plaques 24 puits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Plaques 6 puits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigénine 488</td><td>DBA</td><td>DI7488</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Biotine 11 d-UTP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0081</td><td></td></tr><tr><td>BSA (albumine sérique bovine)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Coverlsips</td><td>Marienfeld</td><td>117500</td><td></td></tr><tr><td>CY3 d-UTP</td><td>GE Healthcare</td><td>PA53022</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4,6-diamidino-2-phénylindole)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D21490</td><td></td></tr><tr><td>Acides désoxyribonucléiques simple brin de testicules de saumon</td><td>Sigma</td><td>D7656</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de dextran (poudre)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-203917A</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigénine 11 d-UTP</td><td>Roche</td><td>11093088910</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21969-035 500mL</td><td></td></tr><tr><td>ADN polymérase I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18010-017</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>AMPD1</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs (C-G-A-T)</td><td>Euroclone</td><td>BL0423A/C/G</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644.2MG</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>02860-1L</td><td></td></tr><tr><td>FBS Hyclone</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30109</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde solution</td><td>Sigma</td><td>F8775-25mL</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Glutammine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024 100mL</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma</td><td>G5516-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Glycogène</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>30721</td><td></td></tr><tr><td>Humain Cot-1 ADN</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15279-001</td><td></td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Humaine Sigma</td><td>I9278-5 mL</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>63069</td><td></td></tr><tr><td>NaAc (acétate de sodium, pH 5,2, 3 M)</td><td>Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>158127-25G</td><td></td></tr><tr><td>PBS (solution saline tamponnée au phosphate)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Pennycilline/Streptavidine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070-063 100mL</td><td></td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Biorad</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>PhasePrep BAC Kit ADN</td><td>Sigma</td><td>NA0100-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Solution de poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36970</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Extraction rapide de gel & Kit combiné de purification PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K220001</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K210010</td><td></td></tr><tr><td>cocktail RNAse</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2288</td><td></td></tr><tr><td>Rubbercement</td><td>Bostik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>VWR</td><td>631-0114</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina Alexa fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S21374</td><td></td></tr><tr><td>Citrate tri-sodique</td><td>Sigma</td><td>1110379026</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253-500g</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250mL</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-100mL</td><td></td></tr></tbody></table>

3d multicolor dna fish outil pour étudier l'architecture nucléaire dans les cellules primaires humaines

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

Une question majeure en biologie cellulaire est l'organisation génomique dans l'espace nucléaire et comment l'architecture de chromatine peut influencer des processus tels que l'expression des gènes, l'identité cellulaire et la différenciation. De nombreuses approches développées pour étudier l'architecture 3D du génome peuvent être divisées en deux catégories complémentaires : les technologies basées sur la conformation chromosomique (technologies C) et l'imagerie. Alors que le premier est basé sur la capture de la conformation chromosomique et des interactions d'ADN proximal dans une population de cellules fixes, le second, basé sur la fluorescence de l'ADN in situ hybridation (FISH) sur des noyaux conservés en 3D, permet la visualisation contemporaine de loci multiples à un seul niveau cellulaire (multicolor), examinant leurs interactions et leur distribution dans le noyau (3D MULTIcolor DNA FISH). La technique de l'ADN multicolore 3D FISH a une limitation de visualiser seulement quelques loci prédéterminés, ne permettant pas une analyse complète de l'architecture nucléaire. Cependant, compte tenu de la robustesse de ses résultats, 3D multicolor DNA FISH en combinaison avec la microscopie 3D et la reconstruction d'image est une méthode possible pour valider les résultats basés sur la technologie C et d'étudier sans ambiguïté la position et l'organisation de loci spécifiques au niveau d'une seule cellule. Ici, nous proposons une méthode étape par étape de 3D MULTIcolor DNA FISH adapté à un large éventail de cellules primaires humaines et discuter de toutes les actions pratiques, étapes cruciales, notions d'imagerie 3D et l'analyse des données nécessaires pour obtenir un succès et instructif 3D multicolore DNA FISH dans différents contextes biologiques.

La méthode de l'ADN multicolore 3D FISH décrit dans cet article permet la visualisation contemporaine de différents loci génomiques dans les noyaux 3D conservés (Figure 1B). Ce protocole permet de mesurer les distances entre les allèles et les différents loci génomiques afin d'évaluer leur proximité spatiale et d'évaluer leur emplacement dans l'espace nucléaire (p. ex., distance loci du centroïde ou de la périphérie des noyaux)16. Cependant, il existe...

3D multicolor DNA FISH représente un outil pour visualiser les loci génomiques multiples dans les noyaux préservés 3D, définissant sans ambiguïté leurs interactions réciproques et leur localisation dans l'espace nucléaire à un seul niveau cellulaire. Ici, un protocole étape par étape est décrit pour un large éventail de cellules primaires humaines.

3D Multicolor DNA FISH Outil pour étudier l'architecture nucléaire dans les cellules primaires humaines

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...

L’ADN multicolore 3D FISH permet à la visualisation de multiples loci génomiques dans les noyaux préservés de définir de manière ambiguë leur interaction réciproque et leur localisation au niveau d’une seule cellule. 3D multicolore DNA FISH permet l’étude directe de l’architecture nucléaire. En général, il fonctionne en conjonction avec les technologies basées sur la capture chromosomique, faisant de cette technique un outil disponible pour la validation des données C au sein de cellules individuelles.La démonstration de la procédure sera Federica Marasca. C’est un postdoc dans mon laboratoire. Commencez par couver le mélange de traduction nick dans un mélangeur thermique à 16 degrés Celsius selon la longueur du matériel d’ADN de départ.À la fin de l’incubation, vérifiez la taille des sondes sur un gel agarose de 2,2 %. Pour chaque expérience DNA FISH, précipiter la quantité appropriée de sonde selon le matériau d’ADN de départ à partir duquel les sondes ont été produites dans 150 microlitres d’eau distillée double, 20 microgrammes d’ADN de sperme de saumon non étiqueté, 3,5 microgrammes d’ADN spécifique cot-1, trois volumes de 100% d’éthanol, et un 1/10e volume de trois acétate de sodium molaire pendant une heure à moins 80 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, centrifuger l’échantillon à vitesse maximale pendant une heure à quatre degrés Celsius.Après avoir jeté le supernatant, laver la pastille deux fois avec 500 microlitres de 70% d’éthanol. Après le deuxième lavage, resuspendez la pastille en deux microlitres de 100% formamide et secouez la sonde pendant 30 minutes à 40 degrés Celsius avant d’ajouter un volume égal de citrate de sodium salin 4X dans du sulfate de 20% dextran. Pour la fixation pré-traitement et la perméabilisation des petites cellules avec de petits noyaux et une faible quantité de cytoplasme, d’abord ajouter deux fois 10 à la sixième cellule en 200 microlitres de PBS directement sur des couvertures de verre dans les puits individuels d’une plaque de 24 puits et permettre aux cellules de se contenter de 30 minutes à température ambiante.À la fin de l’incubation, remplacez rapidement le PBS par 300 microlitres de paraformaldéhyde fraîchement préparés complétés par 0,1 % de Tween 20. Après 10 minutes, laver les cellules fixes trois fois en 300 microlitres de 0,05% TPBS pendant cinq minutes par lavage à température ambiante. Après le dernier lavage, perméabiliser les cellules T avec 300 microlitres de 0,5%TPBS pendant 10 minutes à température ambiante avant de traiter les cellules avec 250 microlitres par puits de cocktail RNAse dilué 1:100 en PBS pendant une heure à 37 degrés Celsius.À la fin de l’incubation, rincer les cellules dans 300 microlitres de PBS et ajouter 300 microlitres de 20% glycérol dans PBS à chaque puits avec une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, placez le verre sur de la glace sèche pendant 15 à 30 secondes pour congeler les cellules avant de décongeler graduellement les échantillons à température ambiante et de les tremper dans 300 microlitres de 20 % de glycérol dans le PBS pendant 30 secondes. Après le gel/dégel des cellules trois fois de plus comme nous venons de le démontrer, lavez les échantillons dans 300 microlitres de 0,5 % de TPBS pendant cinq minutes à température ambiante, suivis de deux lavages dans 300 microlitres de 0,05 % de TPBS pendant cinq minutes par lavage à température ambiante.Après le dernier lavage, traiter les cellules avec 300 microlitres de 0,1 acide chlorhydrique normal pendant 12 minutes à température ambiante, suivi de deux rinçages dans 300 microlitres de citrate de sodium salin. Puis fixer les échantillons pendant la nuit dans 300 microlitres de 50% formamide en citrate de sodium salin 2X à température ambiante. Pour la fixation, le pré-traitement et la perméabilisation de grandes cellules avec une grande quantité de cytoplasme, fixer, pré-traiter et perméabiliser les cellules de la même manière que démontré pour les cellules T primaires humaines et traiter les échantillons avec 300 microlitres de 0,0025% pepsine en 0,01 acide chlorhydrique normal pendant quelques secondes jusqu’à cinq minutes.Observez les cellules au microscope optique et arrêtez la réaction avec deux lavages de cinq minutes dans 300 microlitres de chlorure de magnésium de 50 millimlaires dès que les noyaux sont exempts du cytoplasme, mais les noyaux sont encore visibles et intacts. Pour les POISSONS d’ADN multicolores 3D, dénominatez les sondes d’hybridation à 80 degrés Celsius pendant cinq minutes et placez immédiatement les sondes sur la glace. Chargez les sondes sur une lame de microscope propre et placez un coverslip des cellules sur chaque goutte de sonde.Sceller les bords de coverslip avec du ciment en caoutchouc. Lorsque le ciment a séché complètement, déliaturez les échantillons sur un bloc chauffant de 75 degrés Celsius. Après quatre minutes, hydrater les échantillons à 37 degrés Celsius pendant la nuit dans une boîte métallique flottant dans un bain d’eau.Le lendemain matin, peler le ciment en caoutchouc et avec les toboggans immergés dans 2X citrate de sodium salin soigneusement décoller les coverslips. Placez chaque coverslip dans des puits individuels d’une assiette de six puits contenant deux millilitres de citrate de sodium salin frais par puits pendant deux lavages de cinq minutes à 37 degrés Celsius avec des secousses à 90 révolutions par minute. À la fin de l’incubation, rincer brièvement les coverslips en deux millilitres de 0,2 %Tween 20 dans le citrate de sodium salin 4X.Pour la détection 3D de poissons d’ADN multicolores, transférez les coverslips dans les puits individuels d’une nouvelle plaque de 24 puits et bloquez toute liaison non spécifique en 300 microlitres de tampon de blocage pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius et 20 révolutions par minute. À la fin de l’incubation, traiter les échantillons avec la concentration appropriée d’anti-digoxigenin et/ou de streptavidine diluée dans le tampon bloquant pendant 35 minutes dans une chambre sombre et humide à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, transférer les échantillons dans des puits individuels d’une assiette de six puits et laver les échantillons trois fois en deux millilitres de 0,2 % de citrate de sodium salin 20 et 4X pendant cinq minutes par lavage avec secousses à 90 révolutions par minute.Après le dernier lavage, équilibrer les échantillons en deux millilitres de PBS avant de transférer les coverslips dans une nouvelle plaque de 24 puits pour la post-fixation dans 300 microlitres de 2% de formaldéhyde en PBS par puits pendant deux minutes à température ambiante. Lavez les cellules fixes cinq fois brièvement dans 300 microlitres de PBS, suivis de la coloration avec DAPI diluée à un nanogramme par millilitre dans 300 microlitres de PBS pendant cinq minutes à température ambiante. Lavez les coverslips cinq fois de plus dans PBS et montez les échantillons avec un support de montage approprié.Puis acquérir des images 3D avec un système de microscope. 3D multicolore DNA FISH permet la visualisation contemporaine de différents loci génomiques au sein de noyaux 3D préservés. Pour la préparation de la sonde d’ADN, une sonde de moins de 200 paires de base assure une procédure fish 3D multicolore réussie.Les sondes FISH d’ADN sous-optimales produites par la traduction par entaille peuvent être partiellement ou trop digérées. Des sondes surdé digérées entraîneront un signal non spécifique en raison d’une perte de spécificité dans l’hybridation et d’une augmentation conséquente de l’arrière-plan. Pour les lymphocytes T primaires humains et les petites cellules avec de petits noyaux et une faible quantité de cytoplasme, un traitement hydrochlorique normal d’acide chlorhydrique de 12 minutes 0,1 est recommandé pour favoriser l’accessibilité des noyaux aux sondes d’ADN et pour préserver l’intégrité nucléaire.La digestion cytoplasmique de pepsine n’est pas nécessaire pour obtenir un bon signal de FISH d’ADN dans de petites cellules. Pour les myoblastes primaires humains et les cellules qui ont de grands noyaux et cytoplasme abondant, cependant, l’étape de pepsinisation est fondamentale. Une pepsinisation courte et sous-optimale du cytosquelette entravera l’entrée de la sonde dans les noyaux se terminant en l’absence d’un signal FISH ADN.Cependant, si les cellules sont sur pepsinisées, les noyaux ne resteront pas intacts en perdant leur structure 3D. Un FISH d’ADN multicolore 3D réussi se traduira par la présence de signal dans les noyaux. Je suggère de travailler avec du matériel biologique frais, de tester des sondes avant d’effectuer le FISH d’ADN multicolore 3D, de préparer des solutions fraîches et d’être précis avec les temps d’incubation et les températures.N’oubliez pas que le formamide et le HCL sont des substances dangereuses et doivent toujours être utilisés dans un capot de fumée chimique avec des matériaux jetables appropriés.

3d-multicolor-dna-fish-tool-to-study-nuclear-architecture-human

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Cet article décrit la sélection des sondes appropriées pour les mono-cellules de poisson, les techniques de propagation pour les noyaux des blastomères, et l'hybridation in situ et la notation du signal, appliquées au diagnostic génétique pré-implantatoire (DPI) dans un contexte clinique.

FISH pour le diagnostic préimplantatoire génétique

Chromosomics: détection d&#39;altérations numériques et structurelles dans les 24 chromosomes de l&#39;homme en utilisant simultanément un dosage FISH Novel OctoChrome

Ce protocole décrit une méthode pour visualiser un ADN de protéine cassures double-brin de signalisation activées en réponse aux dommages de l'ADN ainsi que sa localisation au cours de la mitose.

Deux et trois dimensions imagerie de cellules vivantes de protéines endommagent l&#39;ADN de réponse

L’isolement et la caractérisation des cellules tumorales circulantes (CTC) à partir du sang des patients cancéreux sont un type de biopsie liquide non invasive associée à la rechute et à la progression de la maladie. Cette vidéo décrit la technique d’hybridation par fluorescence in situ de l’ADN (DNA FISH) sur des CTC capturés sur un fil médical, pour étudier un gène d’intérêt spécifique.

3D DNA FISH : une technique pour localiser un gène spécifique sur un chromosome

Nous décrivons ici un protocole pour la détection simultanée des modifications des histones par des séquences d'ADN immunofluorescence et par FISH ADN suivies par microscopie 3D (3D et des analyses immuno-FISH ADN).

Immunofluorescence combinés et FISH ADN sur 3D préservé noyaux en interphase pour étudier les changements dans l&#39;organisation nucléaire 3D

Nous décrivons un protocole robuste et polyvalent pour l'analyse de l'architecture nucléaire par FISH d'ADN 3D à l'aide de sondes fluorescentes directement marqués.

Robuste FISH 3D DNA Utilisation des sondes directement marquées

L’imagerie spectroscopique électronique permet d’imager et de distinguer l’acide nucléique de la protéine à une résolution nanométrique. Il peut être combiné avec le système miniSOG, qui est capable de marquer spécifiquement les protéines marquées dans des échantillons de microscopie électronique à transmission. Nous illustrons l’utilisation de ces technologies en utilisant des foyers de réparation de cassures double brin à titre d’exemple.

Visualisation des miniSOG protéines marquées de réparation d&#39;ADN en combinaison avec Electron imagerie spectroscopique (ESI)

L’imagerie in vivo est un outil puissant qui peut être utilisé pour étudier les mécanismes cellulaires sous-jacents au développement du système nerveux. Ici, nous décrivons une technique pour utiliser la microscopie confocale en time-lapse pour visualiser un grand nombre de cellules multicolores étiquetées Brainbow en temps réel dans le système nerveux du poisson zèbre en développement.

Visualiser le cerveau en développement dans le poisson zèbre vivant à l’aide de Brainbow et Time-lapse Confocal Imaging

Une stratégie de préparation d’échantillons pour l’imagerie d’embryons précoces de poisson-zèbre dans un chorion intact à l’aide d’un microscope à feuillet de lumière est décrite. Il analyse les différentes orientations que les embryons acquièrent à l’intérieur du chorion aux stades épibolique et bourgeonnaire à 70 % et détaille les stratégies d’imagerie pour obtenir une résolution à l’échelle cellulaire dans tout l’embryon à l’aide du système de feuillet lumineux.

Stratégies d’imagerie et de montage par microscopie à feuillet de lumière pour les embryons précoces de poisson-zèbre

Cette méthode décrit un protocole d’immunofluorescence et un pipeline de quantification pour évaluer la distribution des protéines avec des modèles d’organisation nucléaire variés dans les lymphocytes T humains. Ce protocole fournit des conseils étape par étape, en commençant par la préparation des échantillons et en continuant par l’exécution d’une analyse semi-automatisée aux Fidji, se terminant par le traitement des données par un ordinateur portable Google Colab.

Un pipeline polyvalent pour l’analyse des changements dynamiques dans les corps nucléaires dans une variété de types de cellules

Apprenez la technique 3D multicolor DNA FISH pour visualiser les loci génomiques dans les cellules primaires humaines. Cette méthode permet d'étudier l'architecture nucléaire et les interactions chromosomiques à l'échelle cellulaire.

3D Multicolor DNA FISH Outil pour étudier l'architecture nucléaire dans les cellules primaires humaines

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