3D Multicolor DNA FISH Outil pour étudier l'architecture nucléaire dans les cellules primaires humaines

3D multicolor DNA FISH représente un outil pour visualiser les loci génomiques multiples dans les noyaux préservés 3D, définissant sans ambiguïté leurs interactions réciproques et leur localisation dans l'espace nucléaire à un seul niveau cellulaire. Ici, un protocole étape par étape est décrit pour un large éventail de cellules primaires humaines.

L’ADN multicolore 3D FISH permet à la visualisation de multiples loci génomiques dans les noyaux préservés de définir de manière ambiguë leur interaction réciproque et leur localisation au niveau d’une seule cellule. 3D multicolore DNA FISH permet l’étude directe de l’architecture nucléaire. En général, il fonctionne en conjonction avec les technologies basées sur la capture chromosomique, faisant de cette technique un outil disponible pour la validation des données C au sein de cellules individuelles.

La démonstration de la procédure sera Federica Marasca. C’est un postdoc dans mon laboratoire. Commencez par couver le mélange de traduction nick dans un mélangeur thermique à 16 degrés Celsius selon la longueur du matériel d’ADN de départ.

À la fin de l’incubation, vérifiez la taille des sondes sur un gel agarose de 2,2 %. Pour chaque expérience DNA FISH, précipiter la quantité appropriée de sonde selon le matériau d’ADN de départ à partir duquel les sondes ont été produites dans 150 microlitres d’eau distillée double, 20 microgrammes d’ADN de sperme de saumon non étiqueté, 3,5 microgrammes d’ADN spécifique cot-1, trois volumes de 100% d’éthanol, et un 1/10e volume de trois acétate de sodium molaire pendant une heure à moins 80 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, centrifuger l’échantillon à vitesse maximale pendant une heure à quatre degrés Celsius.

Après avoir jeté le supernatant, laver la pastille deux fois avec 500 microlitres de 70% d’éthanol. Après le deuxième lavage, resuspendez la pastille en deux microlitres de 100% formamide et secouez la sonde pendant 30 minutes à 40 degrés Celsius avant d’ajouter un volume égal de citrate de sodium salin 4X dans du sulfate de 20% dextran. Pour la fixation pré-traitement et la perméabilisation des petites cellules avec de petits noyaux et une faible quantité de cytoplasme, d’abord ajouter deux fois 10 à la sixième cellule en 200 microlitres de PBS directement sur des couvertures de verre dans les puits individuels d’une plaque de 24 puits et permettre aux cellules de se contenter de 30 minutes à température ambiante.

À la fin de l’incubation, remplacez rapidement le PBS par 300 microlitres de paraformaldéhyde fraîchement préparés complétés par 0,1 % de Tween 20. Après 10 minutes, laver les cellules fixes trois fois en 300 microlitres de 0,05% TPBS pendant cinq minutes par lavage à température ambiante. Après le dernier lavage, perméabiliser les cellules T avec 300 microlitres de 0,5%TPBS pendant 10 minutes à température ambiante avant de traiter les cellules avec 250 microlitres par puits de cocktail RNAse dilué 1:100 en PBS pendant une heure à 37 degrés Celsius.

À la fin de l’incubation, rincer les cellules dans 300 microlitres de PBS et ajouter 300 microlitres de 20% glycérol dans PBS à chaque puits avec une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, placez le verre sur de la glace sèche pendant 15 à 30 secondes pour congeler les cellules avant de décongeler graduellement les échantillons à température ambiante et de les tremper dans 300 microlitres de 20 % de glycérol dans le PBS pendant 30 secondes. Après le gel/dégel des cellules trois fois de plus comme nous venons de le démontrer, lavez les échantillons dans 300 microlitres de 0,5 % de TPBS pendant cinq minutes à température ambiante, suivis de deux lavages dans 300 microlitres de 0,05 % de TPBS pendant cinq minutes par lavage à température ambiante.

Après le dernier lavage, traiter les cellules avec 300 microlitres de 0,1 acide chlorhydrique normal pendant 12 minutes à température ambiante, suivi de deux rinçages dans 300 microlitres de citrate de sodium salin. Puis fixer les échantillons pendant la nuit dans 300 microlitres de 50% formamide en citrate de sodium salin 2X à température ambiante. Pour la fixation, le pré-traitement et la perméabilisation de grandes cellules avec une grande quantité de cytoplasme, fixer, pré-traiter et perméabiliser les cellules de la même manière que démontré pour les cellules T primaires humaines et traiter les échantillons avec 300 microlitres de 0,0025% pepsine en 0,01 acide chlorhydrique normal pendant quelques secondes jusqu’à cinq minutes.

Observez les cellules au microscope optique et arrêtez la réaction avec deux lavages de cinq minutes dans 300 microlitres de chlorure de magnésium de 50 millimlaires dès que les noyaux sont exempts du cytoplasme, mais les noyaux sont encore visibles et intacts. Pour les POISSONS d’ADN multicolores 3D, dénominatez les sondes d’hybridation à 80 degrés Celsius pendant cinq minutes et placez immédiatement les sondes sur la glace. Chargez les sondes sur une lame de microscope propre et placez un coverslip des cellules sur chaque goutte de sonde.

Sceller les bords de coverslip avec du ciment en caoutchouc. Lorsque le ciment a séché complètement, déliaturez les échantillons sur un bloc chauffant de 75 degrés Celsius. Après quatre minutes, hydrater les échantillons à 37 degrés Celsius pendant la nuit dans une boîte métallique flottant dans un bain d’eau.

Le lendemain matin, peler le ciment en caoutchouc et avec les toboggans immergés dans 2X citrate de sodium salin soigneusement décoller les coverslips. Placez chaque coverslip dans des puits individuels d’une assiette de six puits contenant deux millilitres de citrate de sodium salin frais par puits pendant deux lavages de cinq minutes à 37 degrés Celsius avec des secousses à 90 révolutions par minute. À la fin de l’incubation, rincer brièvement les coverslips en deux millilitres de 0,2 %Tween 20 dans le citrate de sodium salin 4X.

Pour la détection 3D de poissons d’ADN multicolores, transférez les coverslips dans les puits individuels d’une nouvelle plaque de 24 puits et bloquez toute liaison non spécifique en 300 microlitres de tampon de blocage pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius et 20 révolutions par minute. À la fin de l’incubation, traiter les échantillons avec la concentration appropriée d’anti-digoxigenin et/ou de streptavidine diluée dans le tampon bloquant pendant 35 minutes dans une chambre sombre et humide à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, transférer les échantillons dans des puits individuels d’une assiette de six puits et laver les échantillons trois fois en deux millilitres de 0,2 % de citrate de sodium salin 20 et 4X pendant cinq minutes par lavage avec secousses à 90 révolutions par minute.

Après le dernier lavage, équilibrer les échantillons en deux millilitres de PBS avant de transférer les coverslips dans une nouvelle plaque de 24 puits pour la post-fixation dans 300 microlitres de 2% de formaldéhyde en PBS par puits pendant deux minutes à température ambiante. Lavez les cellules fixes cinq fois brièvement dans 300 microlitres de PBS, suivis de la coloration avec DAPI diluée à un nanogramme par millilitre dans 300 microlitres de PBS pendant cinq minutes à température ambiante. Lavez les coverslips cinq fois de plus dans PBS et montez les échantillons avec un support de montage approprié.

Puis acquérir des images 3D avec un système de microscope. 3D multicolore DNA FISH permet la visualisation contemporaine de différents loci génomiques au sein de noyaux 3D préservés. Pour la préparation de la sonde d’ADN, une sonde de moins de 200 paires de base assure une procédure fish 3D multicolore réussie.

Les sondes FISH d’ADN sous-optimales produites par la traduction par entaille peuvent être partiellement ou trop digérées. Des sondes surdé digérées entraîneront un signal non spécifique en raison d’une perte de spécificité dans l’hybridation et d’une augmentation conséquente de l’arrière-plan. Pour les lymphocytes T primaires humains et les petites cellules avec de petits noyaux et une faible quantité de cytoplasme, un traitement hydrochlorique normal d’acide chlorhydrique de 12 minutes 0,1 est recommandé pour favoriser l’accessibilité des noyaux aux sondes d’ADN et pour préserver l’intégrité nucléaire.

La digestion cytoplasmique de pepsine n’est pas nécessaire pour obtenir un bon signal de FISH d’ADN dans de petites cellules. Pour les myoblastes primaires humains et les cellules qui ont de grands noyaux et cytoplasme abondant, cependant, l’étape de pepsinisation est fondamentale. Une pepsinisation courte et sous-optimale du cytosquelette entravera l’entrée de la sonde dans les noyaux se terminant en l’absence d’un signal FISH ADN.

Cependant, si les cellules sont sur pepsinisées, les noyaux ne resteront pas intacts en perdant leur structure 3D. Un FISH d’ADN multicolore 3D réussi se traduira par la présence de signal dans les noyaux. Je suggère de travailler avec du matériel biologique frais, de tester des sondes avant d’effectuer le FISH d’ADN multicolore 3D, de préparer des solutions fraîches et d’être précis avec les temps d’incubation et les températures.

N’oubliez pas que le formamide et le HCL sont des substances dangereuses et doivent toujours être utilisés dans un capot de fumée chimique avec des matériaux jetables appropriés.