Name: Traçage rétrograde des neurones moteurs embryonnaires drosophila à laide de colorants fluorescents lipophiles (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-12T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Découvrez le traçage rétrograde des neurones moteurs embryonnaires de Drosophila à l'aide de colorants fluorescents lipophiles. Cette technique permet d'étudier la morphogenèse neuronale et la connectivité dans le système nerveux.

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Nous remercions les membres du laboratoire Kamiyama pour leurs commentaires sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par un NIH R01 NS107558 (à M.I., K.B., et D.K.).

1. Équipement et fournitures
<ol><li>Matériel pour la collecte d'embryons et la formation des adultes à pondre<ol>
<li>Préparer l'appareil de filtration en coupant un tube de 50 ml et en coupant un trou dans le bouchon pour régler un filtre à mailles avec des pores de 100 m(tableau des matériaux)entre le tube et le bouchon. REMARQUE : Alternativement, les passoires cellulaires avec des pores de 100 m(tableau des matériaux)peuvent être utilisées pour l'étape de filtration de la collecte d'embryons.</li>
		<li>Faire des assiettes d'agar avec du prémélange d'agar de raisin (Table des matériaux) selon les instructions énumérées. En bref, remuer doucement 1 sachet de mélange de poudre dans 500 ml de température ambiante (RT, 23 oC) dH2O et cuire au micro-ondes le mélange dissous à ébullition vigoureuse. Après refroidissement jusqu'à 70 à 75 oC, verser le mélange dans la vaisselle Petri (60 mm). Une fois l'agar solidifié, entreposez les assiettes à 4 oC.</li>
		<li>Préparer la pâte de levure en mélangeant la levure sèche active(Tableau des matériaux)et l'eau à une consistance de pâte, et de garder à 4 oC.</li>
		<li>Utilisez des cages de collecte d'œufs (pour le plat Petri de 60 mm, Table of Materials)qui fournissent un débit d'air suffisant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation des aiguilles de dissection et micropipettes d'injection de colorant<ol>
<li>Préparer la micropipette d'injection de colorant et l'aiguille de dissection du même tube capillaire avec un diamètre intérieur de 0,6 mm et un diamètre extérieur de 1,2 mm (Tableau des matériaux). Tirez le tube capillaire par un puller micropipette à 7% à partir de 170 V sortie maximale (Tableau des matériaux) pour créer une aiguille pointue avec un cône de 0,4 cm de longueur.</li>
		<li>Pour l'injection de colorant, ajustez la micropipette à l'aide d'un beveler micropipette(Table of Materials)par une technique de biplage à bulles décrite dans le manuel de l'instrument.<ol>
<li>En bref, faire tremper le broyeur avec un agent mouillant (Table des matériaux) pour empêcher l'eau de «glisser» la pointe de l'aiguille. Placer l'aiguille sur la pince micropipette à 25-30 degrés et abaisser la pointe sur les deux tiers du rayon à partir du centre de la surface de beveling. Broyer l'aiguille pendant qu'une seringue avec des tubes pousse l'air dans l'aiguille, pour s'assurer que la micropipette sera dégagée des copeaux de verre.</li>
			<li>Marquez la micropipette avec un marqueur permanent à pointe fine pour indiquer la position de l'ouverture à l'extrémité après le bifurcation, car il est difficile de localiser l'ouverture étroite de la micropipette qui se forme à un angle.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Préparation pour la collecte d'embryons
<ol><li>Veiller à ce que les mouches adultes (20 à 40 mouches de type sauvage Canton-S ou les mouches blanches), les mâles et les femelles, soient maintenues dans des conditions jeunes (7 jours) et des conditions saines pour la collecte idéale des œufs. REMARQUE : Pour stimuler la ponte, les mouches sont dressées dans leur cage de collecte d'œufs quelques jours avant la collecte des œufs sur des assiettes d'agar striées de pâte de levure au moins une fois par jour.</li>
</ol>3. Mise en scène d'embryon
<ol><li>Permettre aux mouches de pondre des œufs pendant la nuit (ou au moins 15 h) à RT pour recueillir les embryons à 15 h AEL, c'est-à-dire, stade 1618, pour voir la dendritogénèse des neurones moteurs aCC et RP3. Le matin, recueillir l'assiette avec les œufs. REMARQUE: Les embryons à 15 h AEL auront un intestin distinct à 4 chambres18. Pour l'imagerie, différentes étapes suivent leurs critères morphologiques spécifiques et les conditions de vieillissement.</li>
	<li>Pour recueillir les embryons, déchorioner les œufs pondus sur la plaque avec 50% d'eau de Javel pendant 5 min.</li>
	<li>Une fois les corvées effacées, versez le contenu de la plaque à travers l'appareil de filtration ou la passoire cellulaire pour isoler les embryons. À l'aide d'une bouteille d'eau pressée, diluer l'eau de Javel laissée sur la plaque et recueillir autant d'embryons que possible en décantant le mélange dans le filtre.</li>
	<li>Laver les embryons sur le filtre 3-4x avec plus d'eau ou jusqu'à ce que l'odeur d'eau de Javel se dissipe. Retirez le filtre de l'appareil et lavez les embryons sur une autre plaque propre avec de l'eau. Décante l'eau de la nouvelle plaque sur laquelle se trouvent les embryons.</li>
	<li>Préparer une lame de verre en la recouvrant de deux couches de ruban adhésif au centre, formant un rectangle. Couper une piscine rectangulaire de la bande à l'aide d'une lame de rasoir. Placez une fine bande de ruban adhésif à double face vers l'extrémité supérieure de la piscine, c'est là que les embryons seront placés comme indiqué à la figure 1.</li>
	<li>À l'aide de forceps fins, sélectionnez individuellement des embryons de 5 à 10 à 15 h AEL et placez-les sur le ruban à double face avec le côté dorsal vers le haut. Ajouter le salin19 de l'insecte Ringer au bassin de dissection pour protéger les embryons de la dessiccation (Figure 1).</li>
</ol>4. Dissection et coloration
<ol><li>À l'aide d'une aiguille en verre sous un microscope disséquant(Tableau des matériaux),coupez la ligne médiane d'un seul embryon à sa surface de son postérieur à son extrémité antérieure. Puis faites glisser l'embryon hors de la membrane vitelline de la bande sur le verre (encadré dans la figure 1). Veillez à ne pas endommager les tissus intérieurs de l'embryon.</li>
	<li>Retourner les tissus épithéliales du centre et attacher le bord épidermique sur la surface de la glissière de verre(figure 1, enset).</li>
	<li>À l'aide d'une aiguille reliée au tube avec une ouverture de pointe de 300 m (préparée en cassant la fine pointe d'une aiguille de dissection), aspirez ou soufflez de l'air pour détacher et enlever les troncs trachéaux longitudinaux dorsaux ainsi que les boyaux restants.</li>
	<li>Utilisez 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans la saline tamponnée en phosphate (PBS) pour fixer les embryons pendant 5 min à RT. Lavez les embryons 3x avec PBS.</li>
	<li>Taïr les embryons avec 1 L d'anticorps peroxidase anti-raifort conjugué s'est rétorquer avec du colorant cyanine 3 (anti-HRP Cy3)(Tableau des matériaux)en 200 'L de PBS pendant 1 h. Laver les embryons avec PBS 3x après coloration. REMARQUE: Le colorant de l'anti-HRP peut être changé en fonction des colorants lipophiles de choix pour l'injection.</li>
</ol>5. Remplissage de la micro-pipette d'injection
<ol><li>Chauffer les colorants lipophiles (5 mg/mL de DiO ou DeiD, Table of Materials) à 60 oC dans un mélange de 1:10 d'éthanol : huile végétale avant utilisation.</li>
	<li>Préparer une glissière de colorant dissous à l'huile pour la micropipette d'injection. Placez la micropipette dans le support capillaire(figure 2,#1). À l'aide du micromanipulateur(Tableau des matériaux),ajustez la micropipette pour qu'elle soit au-dessus de la glissière de teinture. Ensuite, ajustez la scène pour placer la micropipette sur le colorant(figure 2, #2).</li>
	<li>Pour remplir la micropipette, utilisez un micro-injecteur (Tableau des matériaux) (Figure 2, #3). Recueillir le colorant dans la micropipette en réglant le Pi (pression d'injection) entre 200 à 500 hPa (hectopascal), le Ti (temps d'injection) entre 0,1 et 0,5 s et Pc (pression de compensation) à 0 hPa pour 5 min (figure 2, #4).</li>
	<li>Une fois le colorant recueilli, retirez la lame de teinture et placez l'échantillon sur le stade du microscope. Ensuite, augmenter le Pc à une plage de 20 à 60 hPa avant d'abaisser la micropipette dans l'échantillon pour prévenir la contamination du PBS par action capillaire.</li>
</ol>6. Injection de teinture dans les neurones
<ol><li>Localiser l'embryon au centre à l'aide du microscope avec une lentille objective 10x (Tableau des matériaux) et aligner la micropipette avec l'embryon. REMARQUE : La taille de la gouttelette de colorant peut être ajustée en changeant le Pi ou la taille de l'ouverture de la pointe de micropipette. La gouttelette doit être de 10 à 20 m, ce qui est environ la largeur de 1 muscle.</li>
	<li>Changer la lentille objective à une lentille d'immersion de l'eau 40x (Tableau des matériaux) et plonger la lentille dans PBS pour voir l'embryon.<ol>
<li>Utilisez la microscopie à fluorescence pour vérifier la morphologie neuronale marquée par l'anti-HRP Cy3 et déterminer le site d'injection.</li>
		<li>Pendant l'injection, utilisez la microscopie brightfield pour voir la gouttelette de colorant. Lorsque l'embryon est mis au point, modifiez la position de la micropipette pour établir un contact doux avec la pointe de l'axone d'intérêt (p. ex., aCC, RP3).</li>
		<li>Déposez le colorant dans un hemi-segment abdominal droit (A2-A6) à la jonction neuromusculaire de l'aCC ou du RP3 (figure 3) avec DiD ou DiO, en utilisant les neurones marqués par l'anti-HRP Cy3. Utilisation du contrôle de la main (souris; Figure 2, 5) relâchez le colorant et retirez la micropipette après avoir laissé tomber le colorant avec le micromanipulateur et passez au site d'injection suivant. REMARQUE : Contrairement à d'autres colorants (p. ex. jaune Lucifer, calcéine) qui se propagent dans les cellules voisines par des jonctions d'écart, les colorants lipophiles s'associent aux membranes cellulaires et ne sont pas transférés aux voisins. Cependant, en raison de la taille relativement grande de la gouttelette de colorant, cette technique entraîne également l'étiquetage des muscles partenaires (figure 3A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incuber l'échantillon à RT pendant 1 h après la teinture-goutte avant l'imagerie. REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici avant le montage, et l'échantillon peut être maintenu à 4 oC pendant la nuit. Les colorants lipophiles peuvent également être livrés à l'aide de l'iontophoresis, si un amplificateur intracellulaire couplé direct (DC) est facilement disponible20.</li>
</ol>7. Imagerie avec un microscope Confocal
<ol><li>Retirez le ruban à double face et le ruban vinyle de la glissière en verre à l'aide de forceps.</li>
	<li>Préparer un bordereau de couverture (22 x 22 mm2 verre de couverture No.1) avec une petite quantité de graisse sous vide ( Tablede matériaux) aux quatre coins et placer soigneusement sur l'échantillon, en évitant les bulles d'air. Supprimer tout excès de PBS à l'aide d'essuie-glaces.</li>
	<li>Appuyez sur le bordereau de couverture pour ajuster la distance de travail entre la lentille objective et l'échantillon. Scellez complètement les bords de la glissière de couverture avec du vernis à ongles.</li>
	<li>Image à 10x et 100x grossissement à l'aide d'un microscope confocal.</li>
	<li>Utilisez le logiciel ImageJ pour le traitement des images brutes du microscope (Table of Materials). REMARQUE : L'observation doit commencer dans les 10 minutes après le montage pour les meilleures images. Sinon, à RT, le colorant se propagera aux sites adjacents au site d'injection créant l'arrière-plan non désiré pour l'imagerie. Pour ralentir la diffusion du colorant, l'échantillon peut être stocké à 4 oC pendant quelques heures.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

L'utilisation de l'étiquetage des colorants pour l'étude de la morphologie neuronale présente plusieurs avantages par rapport aux techniques d'étiquetage génétique des cellules. La technique d'étiquetage des colorants peut réduire au minimum le temps nécessaire à l'étiquetage et à l'imagerie des morphologies des neurones moteurs. Le processus d'étiquetage des colorants est assez rapide car il faut moins de 2 h et nous permet de définir le contour des projections neuronales. Comme alternative, on peut visualiser le neuron...

Le système de neurones moteurs embryonnaires de Drosophila offre un modèle expérimental puissant pour analyser les mécanismes sous-jacents au développement du système nerveux central (SNC)1,2,3. Le système de neurones moteurs est favorable aux techniques biochimiques, génétiques, d'imagerie et d'électrophysiologie. En utilisant les techniques, les manipulations génétiques et les analyses fonctionnelles peuvent être effectuées au niveau des neurones moteurs uniques2,4,5,6.
Au début du développement du système nerveux, les neuroblastes se divisent et génèrent un grand nombre de glies et de neurones. La relation spatiotemporale entre la délamination et le profil d'expression génique des neuroblastes a déjà été étudiée en détail7,8,9. Dans le cas du système de neurones moteurs, la formation de la jonction neuromusculaire embryonnaire (NMJ) a été largement étudiée en utilisant l'aCC (cellule d'angle antérieure), RP2 (crevette brute 2), et RP5 neurones moteurs2,10. Par exemple, lorsque le neurone moteur RP5 forme une jonction synaptique naissante, la filopodia pré-synaptique et post-synaptique se mêle11,12,13. Une telle communication cellulaire directe est essentielle pour initier la formation nMJ. Contrairement à ce que nous savons sur les branches nerveuses périphériques, notre connaissance de la façon dont les dendrites motrices initier la connectivité synaptique au sein du SNC est encore primitive.
Dans ce rapport, nous présentons une technique qui permet l'étiquetage rétrograde des neurones moteurs dans les embryons au moyen de la livraison micropipette-négociée des colorants lipophiles. Cette technique nous permet de retracer les 38 neurones moteurs qui intériorisent chacun des 30 muscles de la paroi du corps dans un segment d'hémi à 15 h après la ponte (AEL)14. En utilisant cette technique, notre groupe a étudié à fond de nombreux gains de fonction/perte de fonction alleles15,16,17. Nous avons récemment démêlé les mécanismes moléculaires qui conduisent l'initiation de la connectivité de dendrite moteur et démontré qu'une interaction Dscam1-Dock-Pak définit le site de la croissance dendrite dans le neurone moteur aCC17. En général, cette technique est adaptable pour l'analyse phénotypique de tous les neurones moteurs embryonnaires de type sauvage ou souches mutantes, ce qui améliore notre capacité à fournir de nouvelles informations sur la conception fonctionnelle du système nerveux Drosophila.

<table><tbody><tr><td>Objectif 10x</td><td>Nikon</td><td></td><td>Plan</td></tr><tr><td>Objectif immergé dans l’eau 40x</td><td>Nikon</td><td></td><td>NIR Apo</td></tr><tr><td>Tube capillaire</td><td>Frederick Haer& Co</td><td>27-31-1</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Andor</td><td>N/A</td><td>Dragonfly Disque rotatif Unité confocale</td></tr><tr><td>Verre de couverture</td><td>Corning</td><td></td><td>22x22 mm Carré #1</td></tr><tr><td>DiD</td><td>ThermoFisher</td><td>V22886</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>ThermoFisher</td><td>V22888</td><td></td></tr><tr><td>DiO</td><td>ThermoFisher</td><td>V22887</td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>smz-u</td></tr><tr><td>ruban adhésif double face</td><td>scotch</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>dow corning graisse sous vide poussé</td><td>Fisher sci.</td><td>14-635-5D</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Cage de collecte d’œufs</td><td>FlyStuff</td><td>59-100</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet 5247</td><td>Eppendorf</td><td>abandonné</td><td>FemtoJet 4i (N° de 5252000021)</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Logiciel de traitement d’images</td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Sutter</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Biseauteur de micropipette</td><td>Sutter</td><td>BV-10-B</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur d’aiguille</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix</td><td>Packets FlyStuff</td><td>47-102</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Net Filter</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16 % Solution, grade EM</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710</td><td>Tous les grades EM</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Roche</td><td>11666789001</td><td>Vendu sur sigmaaldrich, en boîte Solution 10x</td></tr><tr><td>Photo-Flo 200</td><td>Kodak</td><td>146 4510</td><td>Agent mouillant</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence droit</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>Eclipse Ci avec une source lumineuse LED</td></tr><tr><td>Vinyle Ruban électrique</td><td>Scotch</td><td>6143</td><td></td></tr><tr><td>VWR Passoires à cellules</td><td>VWR</td><td>10199-659</td><td></td></tr><tr><td>Levure</td><td>FlyStuff</td><td>62-103</td><td>Levure sèche active (RED STAR)</td></tr></tbody></table>

traçage rétrograde des neurones moteurs embryonnaires drosophila à l'aide de colorants fluorescents lipophiles

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Nous décrivons une technique pour l'étiquetage rétrograde des neurones moteurs dans Drosophila. Nous utilisons un colorant lipophile dissous à l'huile et livrons une petite gouttelette à une préparation de filet embryonnaire par un micro-injecteur. Chaque neurone moteur dont la membrane est contactée par la gouttelette peut alors être rapidement étiqueté. Les neurones moteurs individuels sont continuellement étiquetés, ce qui permet de visualiser clairement les détails structuraux fins. Étant donné que les colorants lipophiles viennent dans différentes couleurs, la technique fournit également un moyen d'obtenir des neurones adjacents étiquetés en multicolore. Cette technique de traçage est donc utile pour étudier la morphogénèse neuronale et la connectivité synaptique dans le système de neurones moteurs de Drosophila.

Une image représentative des neurones moteurs aCC et RP3 est montrée dans la figure 3C pour démontrer l'étiquetage multicolore des neurones moteurs à 15 h AEL. Leurs morphologies dendritiques sont en grande partie invariantes entre les embryons. Le modèle de coloration obtenu avec l'anticorps anti-HRP est montré en gris. Une petite gouttelette de DiO ou DiD a été déposée sur le NMJ du muscle 1 ou 6/7, respectivement. La figure 4 démontre la capa...

Nous décrivons une méthode pour le traçage rétrograde des neurones moteurs embryonnaires de Drosophila utilisant des colorants fluorescents lipophiles.

Traçage rétrograde des neurones moteurs embryonnaires drosophila à l'aide de colorants fluorescents lipophiles

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

La technique de traçage décrite dans ce protocole nous aide à étudier la morphogenèse neuronale et à casser la connectivité dans le système de neurones moteurs de Drosophila. Le colorant lipophile peut rapidement se propager à toutes les parties de la membrane cellulaire avec une densité extrêmement élevée. C’est pourquoi notre protocole se résout efficacement à trouver les structures d’un neurone étiqueté.Si un terminal d’axone est accessible avec une micropipette d’injection, cette technique pourrait être appliquée à n’importe quel neurone dans les stades larvaires et adultes des mouches ou dans d’autres organismes. Si vous n’avez aucune expérience de disséquer ou d’utiliser un microinjecteur précis de l’opération sur le spécimen, peut être difficile. Comprendre l’anatomie de l’embryon, aidera avec des conseils à la portion appropriée des outils pour effectuer la dissection ou une dinjection.Pour commencer, préparer et mettre en page tous les matériaux de collecte d’embryons. Préparer l’appareil de filtration en coupant un tube de 50 millilitres et en coupant un trou dans le bouchon. Ensuite, placez un filtre à mailles avec 100 pores micromètres entre le tube et le bouchon.Préparer la micropipette d’injection de colorant et l’aiguille de dissection du même tube capillaire d’un diamètre intérieur de 1,2 millimètre. Tirez le tube avec une micropipette, puller à 7%de 170 volts sortie maximale pour créer une aiguille pointue avec un cône d’environ 0,4 centimètres de longueur. Pour préparer la micropipette d’injection de colorant, faire tremper le broyeur avec un agent mouillant et placer l’aiguille sur la pince de micropipette à 25 à 30 degrés.Puis abaissez la pointe sur les deux tiers du rayon à partir du centre de la surface biseautante. Moudre l’aiguille pendant qu’une seringue avec tube pousse l’air dedans. Marquez la micropipette avec un marqueur permanent à pointe fine pour indiquer la position de l’ouverture à la pointe après le biseauté, car il peut être difficile de localiser l’ouverture étroite qui se forme à un angle.Laissez les mouches pondre des œufs toute la nuit à température ambiante et recueillez le tuyau avec les œufs le matin. Pour recueillir les embryons, déchlorer les œufs dans l’assiette avec 50% d’eau de Javel pendant cinq minutes. Une fois les chlorions effacées, versez le contenu de la plaque à travers l’appareil de filtration ou la passoire cellulaire pour isoler les embryons.Utilisez une bouteille d’eau de compression pour diluer l’eau de Javel laissée sur la plaque et recueillir autant d’embryons que possible en décantant le mélange dans le filtre. Laver les embryons trois à quatre fois avec de l’eau jusqu’à ce que l’odeur d’eau de Javel se dissipe. Retirez le filtre de l’appareil et lavez-le sur une autre assiette propre avec de l’eau.Puis décanter l’eau de la nouvelle plaque que les embryons sont sur. Utilisez des forceps fins pour sélectionner cinq à dix embryons à 15 heures après la ponte et placez-les sur du ruban adhésif à double face avec le côté dorsal orienté vers le haut. Ajouter la solution saline de sonnerie d’insectes à la piscine de dissection pour protéger les embryons contre la dessiccation.Utilisez une aiguille en verre sous un microscope à dissection pour faire glisser l’embryon hors de la membrane de middling de la bande sur le verre, en prenant soin de ne pas endommager les tissus intérieurs de l’embryon. Ensuite, couper à travers la ligne médiane d’un seul embryon à sa surface de son postérieur à l’extrémité antérieure. Retournez les tissus épithéliales du centre et fixez le bord épidermique sur la surface de la glissière de verre.Utilisez une aiguille reliée par tube avec une ouverture de pointe d’environ 300 micromètres pour aspirer ou souffler de l’air pour enlever les troncs trachéaux longitudinals dorsal ainsi que les intestins restants. Utilisez 4%PFA et PBS pour fixer les embryons pendant cinq minutes à température ambiante sur un shaker orbital. Ensuite, lavez-les trois fois avec PBS.Tacher les embryons avec un microlitre d’anticorps anti-raifort peroxidase conjugué avec le colorant Cyanine3 et 200 microlitres de PBS pendant une heure sur le shaker orbital. Et répétez les lavages dans PBS. Pour remplir la micropipette d’injection, placez-la dans le support capillaire.Placez ensuite la glissade de teinture sur la scène et utilisez le micromanipulateur pour le positionner au-dessus de la glissière. Ajustez ensuite la scène pour placer la micropipette sur le colorant. Recueillir le colorant dans la micropipette en fixant la pression d’injection entre 200 et 500 hectopascal, le temps d’injection entre 0,1 et 0,5 secondes et la pression de compensation à zéro pendant cinq minutes.Une fois que le colorant a été recueilli, retirez la toboggan de teinture et placez l’échantillon sur le stade du microscope. Ensuite, augmenter la pression de compensation à une gamme de 30 à 60 hectopascal et abaisser la micropipette dans l’échantillon. Utilisez la lentille 10 fois objective pour localiser l’embryon et aligner la micropipette avec l’embryon.Changer l’objectif de lentille à une immersion d’eau 40 fois lentille. Et submerger la lentille dans le PBS. Utilisez la microscopie de fluorescence pour vérifier la morphologie neuronale marquée par l’anti-HRP Cy3 et déterminer le site d’injection.Lorsque l’embryon est au point changer la position de la micropipette pour entrer en contact doux avec la pointe de l’axon d’intérêt. Ensuite, utilisez la microscopie de champ lumineux pendant l’injection pour voir la gouttelette de colorant. Déposez le colorant dans l’hémisegment abdominal droit à la jonction neuromusculaire de l’aCC ou du RP3 avec did ou dio.Utilisez le contrôle de la main pour libérer le colorant et enlever la micropipette. Passez ensuite au site d’injection suivant. Incuber l’échantillon pendant une heure à température ambiante sur un shaker orbital avant l’imagerie.À l’aide de forceps fins, retirer les bandes de la glissière de verre. Pour monter l’échantillon, préparer un glissement de couvercle avec une petite quantité de graisse sous vide aux quatre coins. Placez-le soigneusement sur l’échantillon, en vous assurant d’éviter les bulles d’air.Poussez vers le bas le glissement de couverture pour ajuster l’espace de l’échantillon pour permettre la distance de travail entre l’objectif et la glissière. Retirez tout excès de PBS avec des lingettes de tâches. Sceller complètement les bords du bordereau de couverture avec du vernis à ongles.Image à 10 fois et 100 fois grossissement avec un microscope confocal et traiter les images, avec le logiciel imageJ. Ce protocole a été employé pour rétrograder l’étiquette le muscle innervating de neurone de moteur d’aCC un et le neurone moteur RP3 innervating muscles six et sept. Les branches dendritiques des neurones moteurs ACC et RP3 présentent un chevauchement important.Les deux neurones sont bipolaires, établissant deux populations différentes de dendrites. Pour démontrer les capacités quantitatives de cette méthode, le nombre total de pointes de dendrite a été compté dans le type sauvage et les mutants Dscam1. Les dendrites ipsilateral d’aCC sont montrés pour le type sauvage, mais peu de dendrites ipsilateral ont été observés pour le mutant de Dscam1.Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de se rappeler que la taille de la gouttelette de teinture est cruciale, qui est d’environ 10 à 20 micromètres. Testez la taille sur le ruban à double face, puis appliquez-le sur le site d’injection. En utilisant cette procédure, nous pouvons profiter de la propriété commutable photo de la sonde DiD pour obtenir des images de super résolution de la membrane plasmatique.De cette façon, nous pouvons étudier la caractérisation ultra structurelle des membranes synaptiques à la jonction neuromusculaire. On a fait le clic. Nous avons effectué l’analyse phénotypique des dendrites d’aCC dans la souche mutante, et découvrons qu’une injection de Dscam1-Dock-Pak définit le site de l’excroissance dendrite dans aCC.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Nous avons décrit les caractéristiques structurelles des synapses neuromusculaires Glia-dans un roman de préparation des tissus intérieur-extérieur de larves de mouches en direct en utilisant des colorants fluorescents en microscopie confocale. Nous avons étiqueté terminaisons neuronales vivre avec fluorescentes anticorps primaires à HRP, et également visualisé l'espace perisynaptic avec dextranes fluorescents.

Visualiser le Live Drosophile Gliales-jonction neuromusculaire avec des colorants fluorescents

Enregistrements électrophysiologiques...

Enregistrement électrophysiologique dans le Drosophile Embryon

Ce protocole traite de la dissection en direct...

Visualisation in vivo des vésicules synaptiques Dans Drosophila larves axones segmentaire

Cette vidéo présente un protocole permettant d’étudier le recyclage des vésicules synaptiques aux jonctions neuromusculaires chez des larves de drosophile exprimant la channelrhodopsine à l’aide d’un colorant fluorescent. La lumière bleue active les channelrhodopsines, provoquant un afflux de calcium et une exocytose des vésicules synaptiques. Le colorant s’intègre dans les membranes neuronales et est internalisé pendant l’endocytose, ce qui entraîne une fluorescence accrue. Une stimulation...

Analyse du recyclage des vésicules synaptiques et de l’absorption de colorant fluorescent chez les larves de drosophile

Source : Inal, M. A. et. al., Tracé rétrograde de Drosophila Motoneurones embryonnaires à l’aide de colorants fluorescents lipophiles. J. Vis. Exp. (2020)Cette vidéo montre la méthode de marquage rétrograde des motoneurones de Drosophila à l’aide de colorants lipophiles. Le colorant pénètre dans l’axone, se déplace rétrogradement et étiquette les neurones en vert, ce qui permet une visualisation détaillée de leur morphologie et de leurs projections au microscope confocal.

Marquage rétrograde des motoneurones de la drosophile à l’aide de colorants lipophiles fluorescents

Source : Guan, W., et. al. Visualiser Drosophila  à travers la cuticule adulte. J. vis. exp. (2018) Cette vidéo montre l’imagerie de }{{}}} de drosophiles} avec des motoneurones exprimant des protéines fluorescentes vertes à l’aide de la microscopie confocale. Un laser et deux détecteurs capturent la GFP et l’autofluorescence de la cuticule. Les images sont traitées en divisant les canaux, en soustrayant l’autofluorescence et en fusionnant en une image composite colorée pour visualiser les...

Imagerie de motoneurones marqués par fluorescence dans une jambe de drosophile adulte

Ce travail décrit une méthode d'immunohistochimie standard pour visualiser les projections de neurones moteurs d'embryons de Drosophila melanogaster en phase finale 16. La préparation en filets d'embryons fixés colorés à l'aide d'un anticorps FasII fournit un outil puissant pour caractériser les gènes requis pour le suivi des axones motrices et la reconnaissance des cibles lors du développement neuronal.

Visualisation du modèle de projection axonale des neurones du moteur embryonnaire dans<em&gt; Drosophila</em

Ici, nous illustrons comment microscopie photoactivation localisation seule molécule peut être effectuée sur le terminal de nerf moteur d’un live de Drosophila melanogaster troisième stade larve.

In Vivo Simple-molécule suivi du terminal de nerf moteur présynaptique Drosophila

Nous décrivons ici un protocole afin de visualiser le ciblage axonale avec une protéine fluorescente dans jambes adultes de la drosophile par fixation, montage, imagerie et imageries après étapes.

Visualiser les Drosophila jambe axones des motoneurones à travers la cuticule de l’adulte

Au début de l’embryon de drosophile , de nombreux organites sont mobiles. En principe, ils peuvent être photographiés en direct via des sondes fluorescentes spécifiques, mais la coquille d’œuf empêche l’application directe sur l’embryon. Ce protocole décrit comment introduire de telles sondes par microinjection, puis analyser le mouvement des organites en vrac via la vélocimétrie d’image de particules.

Visualisation du trafic dépendant du cytosquelette d’organites contenant des lipides dans des embryons de drosophiles

Ici, des méthodes non invasives sont décrites pour la localisation des protéines de la membrane photoréceptrice et l’évaluation de la dégénérescence rétinienne dans l’œil composé de la drosophile à l’aide de la fluorescence eGFP.

Étude du trafic de protéines membranaires dans les cellules photoréceptrices de la drosophile à l’aide de protéines marquées eGFP

Découvrez le traçage rétrograde des neurones moteurs embryonnaires de Drosophila à l'aide de colorants fluorescents lipophiles. Cette technique permet d'étudier la morphogenèse neuronale et la connectivité dans le système nerveux.

Traçage rétrograde des neurones moteurs embryonnaires drosophila à l'aide de colorants fluorescents lipophiles

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