Imagerie de calcium fluorescent et hybridation in situ subséquente pour la caractérisation neuronale de précurseur dans Les laevis de Xenopus

Ce protocole peut être utilisé pour corréler les modèles d’activité calcique avec l’expression des gènes au niveau d’une seule cellule, ce qui permet aux chercheurs d’étudier de nouvelles questions sur les relations entre ces deux caractéristiques. Contrairement aux approches précédentes, qui étudient généralement des tissus entiers, notre technique zoome sur le niveau d’une seule cellule, ce qui nous permet d’évaluer les relations autonomes cellulaires entre l’activité calcique et l’expression des gènes. Commencez par la stérilisation uv de deux boîtes de Pétri en plastique de 35 millimètres et d’un plat de culture cellulaire de 35 millimètres pendant environ 30 minutes.

En travaillant dans le capot d’écoulement laminaire, ajoutez 10 millilitres de solution de calcium de deux millimolaires à chacun des deux tubes coniques en plastique de 50 millilitres, une boîte de Petri uv-stérilisée, et le plat de culture cellulaire UV-stérilisé. Ajouter deux millilitres de solution sans calcium et magnésium à l’autre boîte de Pétri stérilisée aux UV et remplir deux boîtes petri en plastique de 100 millimètres et une boîte de Petri en plastique de 35 millimètres avec 0,1 X MMR complété par de la gentamicine. Remplissez ensuite une boîte de Pétri en plastique de 60 millimètres de 70 % d’éthanol.

Immédiatement avant la dissection, bien mélanger 0,01 grammes de collagenous B dans un tube de solution de calcium. Ajoutez la solution à une nouvelle boîte de Pétri en plastique de 60 millimètres et utilisez un microscope disséquant pour identifier les embryons du stade de développement souhaité. Utilisez une pipette de transfert stérile pour déplacer au moins six embryons appropriés dans une plaque de 100 millimètres contenant mmr plus gentamicine.

Déplacez ensuite un embryon de la plaque de détention dans la deuxième plaque de 100 millimètres de ROR plus gentamicine et placez cette plaque de dissection sous le microscope. À l’aide d’une paire de forceps contondants pour stabiliser l’embryon, peler soigneusement la membrane vitelline entourant l’embryon avec une paire de forceps fins. Lorsque toute la membrane a été enlevée, utilisez les forceps fins pour pincer l’embryon le long de l’axe postérieur antérieur pour séparer les régions dorsales et ventrales.

Utilisez la nouvelle pipette de transfert stérile pour transférer la partie dorsale à la plaque de 60 millimètres de solution collagenous pendant une à deux minutes avant de transférer soigneusement le spécimen à la plaque de dissection. Pour compléter la dissection, retirez soigneusement toute la contamination endodermique et mésodermique résiduelle du tissu neural présumé de l’ectoderm et transférez doucement l’explantation à la plaque de 35 millimètres de solution de calcium. Lorsque trois autres explants ont été collectées, utilisez une micropipette P1000 pour transférer les quatre explants à la plaque de 35 millimètres de solution sans calcium et magnésium en prenant soin d’éviter tout contact entre les explants et l’interface de l’eau de l’air.

Puis faites tourbillonner doucement le plat afin que toutes les explants se regroupent au centre de l’assiette et couvent les spécimens pendant une heure à température ambiante pour permettre aux tissus de se dissocier. Au cours de cette incubation, transférer les deux derniers embryons dans le deuxième plat de RRO avec de la gentamicine, et couvrir le plat pour permettre à ces spécimens de se développer sans être dérangés. À la fin de l’incubation, utilisez de la colle super pour fixer un coverslip micro-gouverné au fond du plat de culture cellulaire de 35 millimètres et utilisez une micropipette P100 pour recueillir les explantations dissociées.

Tenir la pipette à un angle peu profond près de la surface du plat de culture cellulaire, positionner la pointe de la pipette dans le coin de la grille orientée vers l’intérieur et expulser fermement la suspension cellulaire à travers la zone quadrillée. Idéalement, les cellules s’installeront dans un amas serré et dense. Laissez les cellules adhérer à la plaque pendant une heure à température ambiante.

Pendant que les cellules se tassent, déterminez et enregistrez le stade de développement des embryons de contrôle des frères et sœurs. À la fin de l’incubation, déplacez le plat échantillonné à un endroit protégé par la lumière et aspirez 100 microlitres de solution du bord du plat. Mélangez cette solution avec sept microlitres d’une solution acide Pluronique F127 Fluo-4 AM fraîchement préparée avec du pipetage de haut en bas avant de retourner le volume complet dans le plat échantillonné.

Tourbillonnez doucement pour mélanger et couvrir la plaque de papier d’aluminium. Après une heure à température ambiante, remplacer un millilitre du plat de culture explantant supernatant par trois millilitres de solution fraîche de deux millimolaires de calcium. Remplacez ensuite trois millilitres de supernatant par trois millilitres de solution de calcium frais deux fois de plus.

Pour l’imagerie de l’activité calcique à l’intérieur des explants, placez la plaque d’échantillon sur la scène d’un microscope confocal inversé protégé contre l’exposition à la lumière ambiante et utilisez un marqueur pour étiqueter le point avant de la plaque afin que le même champ de vision puisse être trouvé lors des séances d’imagerie subséquentes. Utilisez les objectifs 10 et 20 fois pour localiser un échantillon au microscope et sélectionnez un champ de vision approprié qui est dense en cellules, mais pas si dense que les cellules sont agglutinées ou difficiles à distinguer individuellement. Ajustez la mise au point du microscope de façon à ce que le coverslip dominé par la grille soit visible, en changeant le champ de vision d’origine jusqu’à ce qu’un numéro identifiable soit dans le cadre au besoin.

Obtenez une image de champ lumineux du champ de vision sélectionné avec le coverslip dominé par la grille au point et une image de champ lumineux du champ de vision sélectionné avec les cellules au point. Sans une image claire du coverslip quadrillé et du champ de vision, vous ne serez pas en mesure de co-enregistrer vos cellules avec celles des images de poissons que vous générerez plus tard. Puis illuminez les échantillons avec un laser de 488 nanomètres.

Pour une image de deux heures, modifiez la configuration d’imagerie pour enregistrer 901 images avec un temps d’analyse de 3,93 secondes dans un intervalle de huit secondes avant d’exécuter la configuration pour acquérir l’image. Une fois l’imagerie terminée, retirez la plaque du stade du microscope et remplacez le supernatant de culture par un millilitre de 1X MEMFA pendant une incubation de deux heures à température ambiante en prenant soin d’enregistrer le stade de développement des embryons de contrôle des frères et sœurs au début de l’incubation. La visualisation d’une parcelle composite contenant des traces pour toutes les cellules enregistrées dans une expérience révèle à quel point les mesures en vrac ou en population peuvent masquer des modèles plus nuancés de comportement s’enliser.

Lorsque les profils enregistrés des cellules individuelles sont isolés, des exemples de l’activité irrégulière de spiking caractéristique des cellules progénitrices neurales peuvent être clairement identifiés. Pour quantifier cette complexité, différentes méthodes d’analyse des données peuvent être appliquées, y compris divers paramètres pour définir un pic. Si les plaques sont manipulées grossièrement ou si les lavages sont effectués avec trop de force lors de l’hybridation in situ fluorescente, les cellules peuvent être délogées des surfaces des plaques, ce qui rend impossible l’appariement des cellules entre les images.

Si cette perturbation n’affecte que certaines cellules dans le champ de vision, il peut encore être possible de détecter et d’assigner certaines des cellules dans l’image. Cependant, la quantité maximale de données est obtenue à partir d’une expérience dans laquelle l’hybridation est effectuée avec soin et peu de cellules sont perdues ou repositionnées entre les images. Les résultats d’expériences de collusion de l’activité calcique avec l’expression de gènes marqueurs progéniteurs neuronaux peuvent révéler de nombreuses associations entre des modèles spécifiques d’activité calcique et des phénotypes neuro-émetteurs.

Grâce à ces données, les chercheurs peuvent sonder les caractéristiques plus complexes de ces modèles dynamiques de calcium et les relations avec l’expression des gènes plutôt que d’être limités au simple comptage des pointes.