Name: Analyse de la distribution des tumeurs et des tissus de l’anticorps thérapeutique spécifique à l’antigène cible (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Découvrez une méthode rapide et économique pour surveiller la distribution des anticorps thérapeutiques dans les tumeurs et les tissus. Cette technique permet de sélectionner des anticorps avec une localisation tumorale optimale.

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Nous sommes reconnaissants à l’Université de Virginie Cancer Center Centre Centre d’imagerie de base, Biomolecular Analysis Facility, Advanced Microscopy Facility et le Core Vivarium Facility for Assistance. J. T-S est un chercheur en début de carrière de l’Ovarian Cancer Academy (OCA-DoD). Ces travaux ont été appuyés par la subvention de l’INFE/NIH (R01CA233752) à J. T-S, U.S. DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) breakthrough level-1 award to J. T-S (BC17097) et U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OCRP) funding award (OC180412) to J. T-S

Toutes les procédures concernant la manipulation des animaux et les études sur les xénogreffes tumorales ont été examinées et approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ici à l’Université de Virginie et conformes aux normes réglementaires pertinentes
1. Expression et purification des anticorps
<ol><li>Entretien des cellules CHO<ol>
<li>Cultivez les cellules CHO dans FreeStyle CHO Media complétées par un supplément de glutamine 1x disponible dans le commerce à 37 °C secouant à 130 rpm avec 5% de CO2 à l’aide de flacons Erlenmeyer délongs en verre ou jetables. REMARQUE : Il est fortement recommandé d’utiliser un flacon dérouté avec bouchon ventilé pour augmenter l’agitation et pour améliorer le transfert de gaz pendant l’état de secousse. Un rendement d’anticorps significativement réduit a été obtenu avec des flacons réguliers (non déconcertés) en raison de l’agitation limitée de la culture de suspension.</li>
		<li>Maintenez le nombre de cellules entre 1-5 x 106 cellules/mL avec &gt;95% viabilité cellulaire. Si le nombre de cellules augmente de plus de 5 x 106 cellules/mL, divisez les cellules. Ne permet jamais aux cellules CHO d’atteindre en dessous de 0,2 x10 6 cellules/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfection des cellules CHO<ol>
<li>Faire pousser les cellules CHO dans 200 mL de médias (2 x10 6 cellules/mL) dans des flacons délongés d’Erlenmeyer déconcertés. REMARQUE : Les cultures de suspension cultivées dans des flacons déconcertés ont toujours produit des rendements protéiques plus élevés que lorsqu’elles sont cultivées dans des flacons non déconcertés.</li>
		<li>Dans un tube de 15 mL, prendre 5 mL de supports CHO FreeStyle et ajouter 50 μg d’ADN clone VH et 75 μg d’ADN clone VL. Vortex pour bien mélanger.</li>
		<li>Incuber le mélange d’ADN à température ambiante pendant 5 min. REMARQUE : Une incubation plus longue réduit les rendements protéiques.</li>
		<li>Ajouter 750 μL de bouillon de polyéthylènemine de 1 mg/mL (Î.-P.-É.) à la solution d’ADN et vortexer agressivement le mélange pendant 30 s. Incuber à température ambiante pendant 5 min supplémentaires. REMARQUE : L’Île-du-Prince-Édouard doit être fraîche. Le cycle de dégel multiple de l’Île-du-Prince-Édouard réduit considérablement le rendement global.</li>
		<li>Ajouter tout le mélange d’ADN et d’Î.-P.-É. sur les cellules tout en secouant manuellement le flacon. Incubez immédiatement les flacons délongs d’Erlenmeyer déconcertés avec des cellules à 37 °C secouant à 130 rpm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Expression REMARQUE : L’anticorps a un peptide de signal sécrétaire conçu à son extrémité n-terminale, ce qui aide les anticorps à être sécrétés dans les médias.<ol>
<li>Faire pousser les cellules transfectées à 37 °C, avec des secousses à 130 rpm le jour 1.</li>
		<li>Le jour 2, ajouter 2 mL d’agent anti-agglutination 100x et 2 mL de solution antibactérienne-anticotique 100x. Déplacez le flacon à basse température (32-34 °C), avec des secousses à 130 rpm.</li>
		<li>Tous les cinq jours, ajouter 10 mL d’aliments Tryptone N1 et 2 mL de supplément de glutamine de 100 x.</li>
		<li>Continuez à compter les cellules tous les trois jours à l’aide de l’hémomètre après avoir souté un aliquot de cellules avec la tache bleue trypan. Assurez-vous que la viabilité de la cellule reste supérieure à 80 %.</li>
		<li>Le jour 10 ou 11, récolter le milieu pour la purification des anticorps. Faites tourner la culture à 3000 x g,4 °C pendant 40-60 min, puis filtrez le média clair à l’aide de filtres à bouteille de 0,22 μM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purification REMARQUE : La purification des anticorps est effectuée à l’aide de la colonne Protein-A disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux),à l’aide d’une pompe périssaliste.<ol>
<li>Equilibrer la colonne avec deux colonnes de volume de tampon liant (phosphate de sodium de 20 mM au pH 7,4).</li>
		<li>Passez les supports filtrés contenant des anticorps (obtenus à l’étape 1.3.5) à travers la colonne à la vitesse d’écoulement de 1 mL/min.</li>
		<li>Lavez la colonne avec un volume de deux colonnes de tampon de liaison.</li>
		<li>Elute l’anticorps en fractions de 500 μL à l’aide d’un tampon d’élitution de 5 mL (acétate de sodium de 30 mM au pH 3,4).</li>
		<li>Neutraliser le pH de l’anticorps éluté en ajoutant 10 μL de tampon de neutralisation (3 M d’acétate de sodium au pH 9) par fraction. REMARQUE : La fraction numéro 3-6 contient la majeure partie de l’anticorps. Il est conseillé de conserver toutes les fractions au cas où l’anticorps serait élucidé en une fraction plus tard que prévu.</li>
		<li>Mesurez la concentration d’anticorps purifié à l’aide d’un spectrophotomètre en sélectionnant le protocole par défaut pour IgG. La concentration finale de l’anticorps est obtenue en mg/mL en tenant compte du poids moléculaire et du coefficient d’absorption.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Étiquetage fluorescent
REMARQUE : Les anticorps sont étiquetés avec le colorant infrarouge qui contient un groupe réactif nhs ester, qui se couple avec les protéines et forme un conjugué stable. Cette réaction est sensible au pH et fonctionne mieux au pH 8.5. Les conjugués fluorescents étiquetés avec le colorant affichent un maximum d’absorption de 774 nm, et un maximum d’émission de 789 nm. le pH 8.5 est essentiel à une conjugaison efficace.
<ol><li>Dialyze 0,5 mL de l’anticorps à l’aide d’une cassette de dialyse (0,1-0,5 mL) dans 1 L de tampon de conjugaison (tampon phosphate de 50 mM au pH 8,5). Après 4 h, transférer la cassette de dialyse dans un tampon frais et dialyser pendant la nuit.</li>
	<li>Configurer une réaction de conjugaison en ajoutant 0,03 mg d’IRDye 800CW par 1 mg d’anticorps dans un volume de réaction de 500 μL. REMARQUE : IRDye 800CW est dissous dans DMSO à une concentration de 10 mg/mL.</li>
	<li>Effectuer des réactions d’étiquetage de 2 h à 20 °C. REMARQUE : Augmenter le temps au-delà de 2 h n’améliore pas l’étiquetage.</li>
	<li>Purifier les conjugués étiquetés par dialyse étendue contre 1x PBS.</li>
	<li>Estimer le degré d’étiquetage en mesurant l’absorption du colorant à 780 nm et l’absorption de la protéine à 280 nm. La contribution de colorant au signal de 280 nm est de 3%.</li>
	<li>Calculez le rapport colorant/protéine à l’aide de cette formule : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60727/60727equ01.jpg"> où 0,03 est un facteur de correction pour l’absorption du colorant utilisé à 280 nm (égal à 3,0 % de son absorption à 780 nm), εColorant et protéine εsont des coefficients d’extinction molaire pour le colorant et la protéine (anticorps) respectivement. REMARQUE : εColorant est de 270 000 M-1 cm-1 et εLa protéine est de 203 000 M-1 cm-1 (pour un IgG typique) en 1:1 mélange de PBS : méthanol. Les protéines autres que l’IgG peuvent avoir des coefficients d’extinction molaire très différents. L’utilisation d’un coefficient d’extinction correct pour la protéine d’intérêt est essentielle pour déterminer avec précision le rapport D/P.</li>
	<li>Calculez la concentration finale de protéines à l’aide de cette formule : <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60727/60727equ02.jpg"> REMARQUE : Confirmez toujours l’efficacité antigène-contraignante de l’anticorps étiqueté et non étiqueté utilisant ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ou la cytométrie de flux avant de procéder à des études in vivo.</li>
</ol>3. Études de xénogreffe de souris
<ol><li>Préparation des cellules tumorales pour injection<ol>
<li>Cultiver des cellules OVCAR-3 dans RPMI-1640 Medium, complétées par 10% de FBS et 1x pénicilline-streptomycine.</li>
		<li>La veille de l’injection, les cellules de sous-culture dans de nouveaux plats de culture de 100 mm avec 10 mL de milieu complet / plat. Utilisez le numéro de cellule de 0,5-1 x 106 cellules/plat.</li>
		<li>Incuber les cultures à 37 °C de température, 95 % d’humidité et 5 % de CO2 pendant 20 à 24 h.</li>
		<li>Le jour de l’injection, retirer le milieu de croissance des plats de culture. Rincez soigneusement la couche cellulaire avec ca2+/Mg2+ saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco pour éliminer les cellules mortes, les débris cellulaires et toutes les traces de sérum, ce qui peut interférer dans l’action de la trypsine.</li>
		<li>Essayez de trypsiniser les cellules en ajoutant 1,0-1,5 mL de solution Trypsin-EDTA à chaque plat et essayez de répandre la solution en inclinant le plat tout autour suivi de l’incubation à 37 °C pendant 5-10 min. REMARQUE : Observez les cellules sous un microscope inversé pour vérifier l’état réel de la trypsinisation. Sous la trypsinization les résultats en nombre inférieur de détachement cellulaire de la surface du plat de culture, sur trypsinization induit le stress cellulaire. Donc, une bonne trypsinisation est importante.</li>
		<li>Ajouter 1,0-1,5 mL de milieu de croissance complet à chaque plat pour arrêter l’action de la trypsine, après que re-suspendre les cellules par pipetting doucement. REMARQUE : Le pipetage doux est important pour maintenir la santé cellulaire.</li>
		<li>Recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL et tourner à 250 x g pendant 5 min à température ambiante.</li>
		<li>Recueillir la pastille cellulaire après avoir enlevé le supernatant et laver les cellules en suspendant à nouveau la pastille en 1x DPBS.</li>
		<li>Faire tourner la suspension cellulaire à basse vitesse 250 x g pendant 5 min.</li>
		<li>Ajouter 500 μL de DPBS et re-suspendre les cellules par pipetting doux pour obtenir une suspension à cellule unique.</li>
		<li>Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé. REMARQUE : Pour une meilleure précision, répétez le comptage trois fois et prenez une moyenne.</li>
		<li>Ajustez le volume de manière à ce que la densité cellulaire finale soit de 1 x 108 cellules/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injection sous-cutanée de cellules pour développer des xénogreffes de souris REMARQUE : Toutes les procédures doivent être effectuées dans une armoire de sécurité BSL2. Athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+souris ont été utilisés dans l’étude actuelle.<ol>
<li>Prendre 50 μL de la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 mL et mélanger avec 50 μL de membrane de sous-sol milieu matricielle. REMARQUE : Le milieu de matrice de membrane de sous-sol tend à former un gel comme l’état à la température ambiante, ainsi maintiennent soigneusement les cellules et le mélange moyen de matrice sur la glace. Il est conseillé de garder les tubes, les pointes et les seringues au réfrigérateur, puis de les transférer sur de la glace avant l’injection d’animaux.</li>
		<li>Agiter le mélange pour éviter toute agglutination cellulaire. Ensuite, prenez ce 100 μL du mélange moyen suspension-matrice cellulaire qui contient 5 x10 6 cellules, dans une seringue de 1 cc.</li>
		<li>Soulevez doucement la peau de l’animal pour séparer la peau de la couche musculaire sous-jacente et injectez lentement la suspension cellulaire (100 μL) sous la peau (5 x 106 cellules), avec une aiguille de 26 G. Attendez quelques secondes avant de sortir l’aiguille, de sorte que le milieu matricielle du sous-sol peut former le gel semi-solide comme la structure avec des cellules sous la peau, empêchant le mélange sortant du site d’injection. REMARQUE : Les cellules doivent être testées avant l’injection pour toute contamination qui pourrait nuire aux souris immunodéficientes. Lors de l’injection ne mettez pas l’aiguille trop profondément dans la peau car cela peut former la tumeur plus profonde que prévu.</li>
		<li>Gardez l’animal dans une cage stérile et observez pendant environ 20 minutes.</li>
		<li>Observez les souris pendant 2-3 semaines et permettez à la tumeur de grandir jusqu’à 500 mm3 taille.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Localisation des anticorps à l’aide d’un système d’imagerie in vivo
REMARQUE : L’équipement d’imagerie in vivo (voir tableau des matériaux)utilisé dans cette expérience utilise un ensemble de filtres à haut rendement et d’algorithmes spectraux de non-mélange pour la visualisation non invasive et le suivi de l’activité cellulaire et génétique au sein d’un organisme vivant en temps réel. Le système fournit à la fois la fluorescence et la capacité de surveillance de la bioluminescence.
<ol><li>Injecter 25 μg d’anticorps étiquetés de colorant par veine de queue.<ol>
<li>Anesthésier la tumeur portant des souris à l’aide de 2% d’isoflurane. Vérifiez le manque de réponse aux réflexes de pédale.</li>
		<li>Une fois que les souris cessent de bouger, dilater la veine latérale de la queue en appliquant de l’eau de ver.</li>
		<li>Injecter 25 μg (en 100 μL) d’anticorps étiquetés à l’aide d’une seringue à insuline de 1 cc avec une aiguille de 26 G.</li>
		<li>De même, en tant que contrôle négatif, étiquetez et injectez l’anticorps isotype IgG1 non spécifique qui ne cible pas les cellules cancéreuses.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Effectuer l’imagerie in vivo en direct après 8, 24, 48 h, etc. d’injections d’anticorps.<ol>
<li>Dans le logiciel associé, cliquez sur Initialize situé dans le panneau de commande et confirmez que la température de l’étape est de 37 °C.</li>
		<li>Allumez l’alimentation en oxygène, toutes les pompes sur le système d’anesthésie, l’approvisionnement en gaz isoflurane à la chambre anesthésique et réglez la valve vaporisateur isoflurane à 2%.</li>
		<li>Transférer les souris dans une chambre anesthésique et attendre que les souris soient complètement anesthésiées. Appliquer l’onguent lubrifiant pour les yeux pour éviter le séchage de leurs yeux.</li>
		<li>Rendez-vous sur le panneau contrôle,configurez l’imagerie par fluorescence grâce à l’option Imaging Wizard et sélectionnez l’excitation à 773 nm et l’émission à 792 nm. REMARQUE : Les paramètres d’exposition automatique par défaut fournissent une bonne image fluorescente. Toutefois, les préférences d’exposition automatique peuvent être modifiées en fonction des besoins.</li>
		<li>Transférez les souris anesthésiées dans la chambre d’imagerie et assemblez-les sur le champ d’imagerie à l’aide d’un cône nasal. L’étape d’imagerie offre la possibilité d’accueillir 5 souris à la fois. REMARQUE : Avoir des souris témoins photographiées avec les souris d’essai pour avoir une quantité similaire d’exposition et d’autres paramètres pendant l’analyse.</li>
		<li>Une fois que tout est prêt, sélectionnez l’option Acquérir sur le panneau de contrôle pour l’acquisition de l’image.</li>
		<li>Avec les paramètres Autoexposure, le système génère l’image en une minute. L’image générée est la superposition de fluorescence sur l’image photographique avec une intensité de fluorescence optique affichée en unités de dénombrements ou de photons, ou en termes d’efficacité.</li>
		<li>Après l’acquisition de l’image, transférer les souris de la chambre d’imagerie à leur cage et d’observer pour leur récupération pendant 1 à 2 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Peaufiner davantage l’image avec les outils et les fonctions fournis dans le logiciel pour l’analyse d’images. Les outils d’analyse d’image sont dans la barre de menu et la palette d’outils.<ol>
<li>Sous Image Adjust, ajustez la luminosité, le contraste ou l’opacité et sélectionnez l’échelle de couleur.</li>
		<li>Utilisez les outils roi pour spécifier une région d’intérêt (ROI) dans une image optique et mesurer l’intensité du signal dans le roi. Si nécessaire, exportez les données de signal quantifiées vers un logiciel de feuille de calcul et tracez les données.</li>
		<li>Pour les études de suivi, analyser les autopsies de souris de divers tissus (p. ex., foie, poumon, cœur, rein, rate, cerveau, etc.) côte à côte pour une distribution détaillée non spécifique d’anticorps étiquetés fluorescents. REMARQUE : Les données peuvent être soutenues avec l’ELISA spécifique aux tissus en utilisant l’antigène (FOLR1 dans ce cas) dans 96 ainsi que des analyses.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

La livraison sélective et spécifique de tissu de tumeur de l’agent thérapeutique anticancéreux est la clé pour mesurer l’efficacité et l’innocuité d’une thérapie cibléedonnée 13. Ici nous avons décrit une approche rapide et efficace pour étudier la distribution détaillée de tissu et de tumeur du clinicien, du farletuzumab et d’un anticorps nonclinique de BaCa. L’approche décrite est applicable à n’importe quel anticorps nouvellement généré et peut être employée aux côtés d’un anticorps médicalemen...

Fda a approuvé le premier anticorps monoclonal ciblant CD3 (OKT3, Muromonab) en 19861,2. Depuis lors, pendant les vingt prochaines années, il ya eu une explosion rapide dans le domaine de l’ingénierie des anticorps en raison du succès écrasant des anticorps contre les inhibiteurs du point decontrôle immunitaire 3. Outre l’activation indirecte du système immunitaire, les anticorps visent à signaler directement les cellules cancéreuses pour engager avec précision les cellules effectrices immunitaires, déclencher la cytotoxicité par l’intermédiaire de l’agoniste des récepteurs de la mort, bloquer la signalisation de survie des cellules tumorales, obstruer l’angiogenèse (croissance des vaisseaux sanguins), contraindre les régulateurs de contrôle immunitaires, délivrer des radioisotopes, des agents chimiothérapeutiques et de l’ARN comme agents conjugués2. En outre, l’étude des fragments variables à chaîne unique (scFv) de divers anticorps à la surface des cellules T dérivées du patient et des cellules NK (CAR-T et CAR-NK) est un domaine en croissance rapide des investigations cliniques pour les thérapies cellulaires4.
L’affinité ultra-élevée des médicaments à base d’anticorps qui fournit la sélectivité à l’antigène exprimant les cellules tumorales en fait un agent attrayant. De même, l’accouchement ciblé et la rétention tumorale d’un anticorps thérapeutique (ou d’un médicament chimique) est la clé pour équilibrer l’efficacité sur la toxicité. Par conséquent, un grand nombre de stratégies basées sur l’ingénierie protéique qui incluent mais ne sont pas limitées aux anticorps bispécifiques5 et tri-spécifiques6 sont exploitées pour augmenter sensiblement la conservation optimisée de tumeur d’avidité des thérapeutiques injectées par voie intraveineuse (IV)5,7. Ici, nous décrivons une méthode basée sur la fluorescence simple pour adresser la distribution de tumeur et de tissu des anticorps anticancéreux potentiellement efficaces.
Puisque les tissus animaux possèdent l’auto-fluorescence une fois excités dans le spectre visible, les anticorps ont été au commencement étiquetés avec le colorant infrarouge proche (par exemple, IRDye 800CW). Pour des preuves d’études de concept, nous avons utilisé le récepteur folique alpha-1 (FOLR1) ciblant l’anticorps appelé farletuzumab et son dérivé appelé activateur d’ancrage bispécifique Cytotoxicity (BaCa)7 qui co-cible FOLR1 et récepteur de la mort-5 (DR5)8 dans un anticorps recombinant. FOLR1 est un récepteur cible surexprimé bien défini dans les cellules cancéreuses ovariennes et TNBC, les xénogreffes tumorales et les tumeurs patientes9. Il y a notamment de multiples efforts pour exploiter cliniquement FOLR1 à l’aide d’approches à base d’anticorps pour engager les cellules effectrices immunitaires et les conjugués anticorps (ADC) pour les cancersde l’ovaire et du sein 10,11.
Dans cet article de méthodes, nous avons cloné, exprimé et purifié anti-FOLR1 clinique (farletuzumab) avec d’autres anticorps de contrôle utilisant le système d’expression de CHO. L’isotype IgG1 et un anticorps clinique anti-idiotype mucin-16 appelé abagovomab12 ont été utilisés comme témoins négatifs. Après purification de protéine-A, les anticorps indiqués ont été étiquetés avec IRDye 800CW et ont été administrés dans la veine de queue des souris nues portant des xénogreffes de tumeur ovarienne ou folr1 humain habilement transfected exprimant des xénogreffes de cancer du côlon murine. La localisation des anticorps a été suivie par imagerie en direct à l’aide du spectre d’imagerie in vivo à plusieurs momentsdifférents 7. Cette méthode ne nécessite aucune modification génétique ou injection du substrat pour permettre l’émission de lumière et est beaucoup plus rapide, rentable et efficace. Le protocole général de clonage, d’expression, de purification et d’étiquetage décrit ci-dessous peut être appliqué à n’importe quel anticorps clinique et nonclinique si des séquences de chaîne lourde et légère sont disponibles.

<table><tbody><tr><td>FreeStyle CHO media</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 12651-014</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Anti (100X)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Clumping Agent</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 01-0057DG</td><td></td></tr><tr><td>BD Seringue à insuline</td><td>BD BioSciences</td><td>Cat #329420</td><td></td></tr><tr><td>Caliper IVIS Spectrum</td><td>PerkinElmer</td><td>Cat #124262</td><td></td></tr><tr><td>CHO CD EfficientFeed B</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat #A10240-01</td><td></td></tr><tr><td>Corning 500 mL DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)</td><td>Corning</td><td>Cat # 10-13-CV</td><td></td></tr><tr><td>Corning 500 mL RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>Cat # 10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 conjuguée Anti-Human IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>Cat # 709-175-149</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax-I (100X)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HiPure Plasmid Maxiprep kit</td><td>Invitrogen</td><td>Cat # K21007</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap MabSelect SuRe Column</td><td>GE Healthcare</td><td>Cat # 11-0034-93</td><td></td></tr><tr><td>Infusion</td><td>Takara BioScience</td><td>STO344</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW NHS Ester</td><td>LI-COR</td><td>Cat # 929-70020</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>Covetrus</td><td>Cat # 11695-6777-2</td><td></td></tr><tr><td>Lubrifiant Pommade pour les yeux</td><td>Refresh Lacri-Lube</td><td>Cat # 4089</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>Cat # 354234</td><td></td></tr><tr><td>PEI réactif de transfection</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat # BMS1003A</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer Cassettes de dialyse</td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat # 66333</td><td></td></tr><tr><td>Steritop Vacuum Filtres</td><td>Millipore Express</td><td>Cat #S2GPT02RE</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 15400-054</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Experimental Models : Lignées cellulaires</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human : OVCAR-3</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC HTB-161</td><td></td></tr><tr><td>Humain : Cellules CHO-K</td><td>Stable transformé dans notre laboratoire</td><td>Souris ATCC CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>: 4T1</td><td>Aimable don du Dr Chip Landen, UVA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Souris : MC38</td><td>Aimable don de la Dre Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC</td><td>Authentifié par profilage</td><td></td>STR</tr><tr><td>Souris : MC38 hFOLR1</td><td>Généré dans notre laboratoire (Cet article)</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Experimental Models : Souris Animal</fortes></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>: athymique Nu Foxn1nu/Foxn1+</td><td>Envigo</td><td>Ordres</td><td></td>multiples</tr><tr><td>Souris : NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td><td>Jackson</td><td>Laboratory Multiple Orders</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse de la distribution des tumeurs et des tissus de l’anticorps thérapeutique spécifique à l’antigène cible

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Les anticorps monoclonaux sont des médicaments multifonctionnels à haute affinité qui fonctionnent par des mécanismes indépendants variables pour éliminer les cellules cancéreuses. Au cours des dernières décennies, le domaine des anticorps conjugués, des anticorps bispécifiques, des récepteurs d’antigène chimérique (RCA) et de l’immunothérapie contre le cancer est devenu le domaine le plus prometteur des investigations fondamentales et thérapeutiques. Avec de nombreux essais humains réussis ciblant les récepteurs des points de contrôle immunitaires et les cellules CAR-T dans la leucémie et le mélanome à un rythme révolutionnaire, c’est une période très excitante pour les thérapeutiques oncologiques dérivées de variations de l’ingénierie des anticorps. Malheureusement, un nombre significativement élevé d’anticorps et de thérapies basées sur la RCA se sont également avérés décevants dans les essais humains des cancers solides en raison de la disponibilité limitée des cellules immunisées d’effecteur dans le lit de tumeur. Fait important, la distribution non spécifique d’anticorps thérapeutiques dans des tissus autres que les tumeurs contribue également au manque d’efficacité clinique, à la toxicité associée et à l’échec clinique. Comme la traduction fidèle des études précliniques dans les traînées cliniques humaines sont fortement comptées sur des souris tumeur xénogreffe efficacité et études d’innocuité, ici nous soulignons une méthode pour tester la tumeur et la distribution générale de tissu des anticorps thérapeutiques. Ceci est réalisé en étiquetant l’anticorps purifié de protéine-A avec le colorant fluorescent proche infrarouge suivi de l’imagerie vivante des souris porteuses de tumeur.

Dans la méthodologie décrite, nous avons d’abord cloné des anticorps ciblant le récepteur folique alpha-1 (FOLR1) nommé farletuzumab, et un anticorps bispécifique appelé BaCa composé de farletuzumab et de lexatumumab ainsi que d’anticorps témoins tels que l’abagovomab (séquences fournies dans le fichier supplémentaire 1). Les détails des domaines représentant variable lourd (VH) et à lumière variable (VL) dans les clones d’ADN (pVH, pVL) sont indiqués dans la figure 1A. Pour...

Ici nous présentons un protocole pour étudier la localisation in vivo des anticorps dans les modèles de xénogreffe de tumeur de souris.

Analyse de la distribution des tumeurs et des tissus de l’anticorps thérapeutique spécifique à l’antigène cible

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Ce protocole démontre l’expression et la purification des anticorps et la surveillance en temps réel de la distribution des anticorps dans la tumeur et les tissus. Le criblage des anticorps avec le protocole décrit aidera à sélectionner des anticorps qui ont la distribution non spécifique limitée de tissu, et enrichira des localisations de tumeur. La technique décrite est rapide et rentable.D’autres techniques, telles que la tomographie calculée par émission d’un seul photon et la tomographie par émission de positons, sont très coûteuses et nécessitent des traceurs radioactifs et d’autres traceurs sophistiqués. La technique ne se limite pas aux anticorps ciblant le cancer. Il peut être appliqué à toute autre maladie, comme les maladies pulmonaires ou cardiaques, pour l’analyse de la distribution des anticorps dans le corps.Jeremy Gatesman, un technicien vétérinaire de mon université, fera la démonstration de la procédure. Cellules CHO brutes dans 200 millilitres de médias, dans Delong, Erlenmeyer flacons déconcertés. Combinez cinq millilitres de cho freestyle media avec 50 microgrammes d’ADN variable de clone lourd, et 75 microgrammes un ADN variable de clone de lumière dans un tube de 15 millilitres.Ensuite, vortex le tube. Laisser le mélange à température ambiante pendant cinq minutes. Ajouter 750 microlitres d’un milligramme par millilitre de stock de polyéthyllène à la solution d’ADN, et vortex agressif pendant 30 secondes.Laisser le mélange à température ambiante pendant cinq minutes supplémentaires. Ajouter tout le mélange aux cellules CHO tout en secouant manuellement le flacon. Incuber immédiatement les cellules à 37 degrés Celsius tout en secouant à 130 RPM.Le lendemain, ajouter deux millilitres de 100 X agent anti-agglutination, et deux millilitres de 100 X solution antibactérienne antimycotique aux cellules. Incuber les flacons à 32 à 34 degrés Celsius, avec des secousses à 130 RPM. Continuer à culturer les cellules pendant 10 à 11 jours, en ajoutant 10 millilitres d’alimentation Tryptone N1, et deux millilitres de supplément de glutamine 100 X tous les cinq jours.Comptez les cellules tous les trois jours pour s’assurer que la viabilité cellulaire reste supérieure à 80 % Le jour 10 ou 11, récoltez le milieu pour la purification des anticorps en centrifugant la culture à 3 000 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 40 à 60 minutes. Filtrez ensuite le média clair à l’aide d’un filtre à bouteille de 0,22 micromètre. Pour purifier les anticorps, équilibrer la colonne protéine A avec deux volumes de colonne de tampon liant.Passez le média filtré à travers la colonne à la vitesse d’écoulement d’un millilitre par minute. Ensuite, lavez la colonne avec deux volumes de colonne de tampon de liaison. Utilisez cinq millilitres de tampon d’élitution pour émiguier l’anticorps en 500 fractions de microlitres.Et neutraliser le pH de l’anticorps fait allusion en ajoutant 10 microlitres de tampon de neutralisation pour la fraction. Mesurer la concentration de l’anticorps purifié à l’aide d’un spectrophotomètre à l’aide du protocole par défaut pour IgG. Dialyze 0,5 millilitres de l’anticorps à l’aide d’une cassette de dialyse dans un litre de tampon de conjugaison.Après quatre heures, transférer la cassette de dialyse dans un tampon frais et dialyser pendant la nuit. Pour mettre en place une réaction de conjugaison, ajouter 0,03 microgramme de colorant IRR 800 CWU par milligramme d’anticorps dans un volume total de 500 microlitres. Incuber le mélange pendant deux heures à 20 degrés Celsius, puis purifier les conjugués étiquetés par dialyse étendue contre PBS.Estimer le degré d’étiquetage en mesurant l’absorption du colorant 780 nanomètres, et l’absorption de la protéine à 280 nanomètres. Pour développer des xénographes de souris, soulevez doucement la peau de l’animal et séparez-la de la couche musculaire sous-jacente. Injectez lentement 100 microlitres de suspension cellulaire sous la peau avec une aiguille de calibre 26.Attendez quelques secondes avant de sortir l’aiguille afin que le milieu matriciel du sous-sol informe la structure semi-solide en forme de gel ainsi que les cellules sous la peau, ce qui empêchera le mélange de sortir du site d’injection. Pour effectuer l’imagerie in vivo, injectez l’anticorps étiqueté colorant par la veine de la queue. Après anesthésier la souris, vérifiez le manque de réponse aux réflexes de pédale, et dilatez la veine en appliquant de l’eau chaude.Utilisez une seringue à insuline 1cc avec une aiguille de calibre 26 pour injecter 25 microgrammes de l’anticorps étiqueté dans un volume de 100 microlitres. Comme un contrôle négatif, étiqueter et injecter l’anticorps isotype IgG non spécifique qui ne cible pas les cellules cancéreuses. Effectuez l’imagerie in vivo huit, 24 et 48 heures après les injections d’anticorps.Dans le logiciel d’imagerie, cliquez sur initialiser. Confirmez que la température de l’étape est de 37 degrés Celsius. Dans le panneau de contrôle, configurer l’imagerie par fluorescence par l’intermédiaire de l’assistant d’imagerie, et définir l’excitation à 773 nanomètres, émission à 792 nanomètres.Transférer la souris anesthésiée dans la chambre d’imagerie. Placez-le sur le champ d’imagerie à l’aide du cône avant. Une fois prêt, cliquez sur acquérir sur le panneau de contrôle pour l’acquisition de l’image, et cliquez sur exposer automatiquement.L’image générée est la superposition de la fluorescence sur l’image photographique avec fluorescence optique et densité affichées dans des unités de dénombrements ou de photons. Des clones positifs de cDNA avec les domaines lourds et variables variables de lumière ont été confirmés avec le PCR de colonie. Les résultats représentatifs de farletuzumab purifié exécuté sur la page de SDS non-réduisant et réduisant sont montrés ici.Les chaînes lourdes et légères produisaient 50 et 25 bandes de kilodalton après réduction. La liaison des anticorps aux protéines indigènes dans la surface de cellules a également été confirmée. Les anticorps fluorescents étiquetés étaient la veine de queue injectée, dans les souris greffées avec les tumeurs pleines d’expression de R1.Les animaux ont été vécus image à plusieurs moments en utilisant IVIS. les données confirs enrichissement sélectif des anticorps R1 et BaCa complets dans les tumeurs. Lorsque vous essayez ce protocole, gardez à l’esprit que le maintien des cellules CHO est essentiel pour le rendement des anticorps.Et il est important d’avoir un degré semblable de conjugaison fluorescente de colorant pour la localisation compétitive de tumeur. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que l’immunohistochimie tissulaire et le tissu ou la tumeur spécifique ELISA peuvent être effectuées pour soutenir les données d’imagerie des souris vivantes.

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Radioimmunothérapie préciblée : méthode d’administration ciblée de radionucléides thérapeutiques à des tumeurs

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Technique d’évaluation de la localisation in vivo d’anticorps spécifiques à une tumeur

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