Name: Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Découvrez le protocole Fbio CLIP-seq pour profiler les interactions ARN-protéines dans les cellules de mammifères. Cette méthode isotope-free et sans anticorps spécifique simplifie la détection des ARN liés directement aux protéines.

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Le soutien des subventions est du Programme national de recherche fondamentale de Chine (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), de la National Natural Science Foundation of China (31630095) et du Center for Life Sciences de l’Université de Tsinghua.

1. Construction de lignes cellulaires
<ol><li>Cloner le gène d’intérêt dans un vecteur PiggyBac pPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA d’intérêt]-(Hygromycine-résistant) plasmide qui porte un FLAG-biotin epitope13,21 pour exprimer une étiquette FLAG-biotine fusionné RBP(FBRBP).</li>
	<li>Cotransfecter le vecteur d’expression FBRBP avec le vecteur pBase dans une lignée cellulaire exprimant l’enzyme BirA22. REMARQUE : Dans cette étude, le gène FBRBP a été transfecté en cellules souches embryonnaires de souris (MESCs) portant un vecteur intégré d’expression BirA21. Alternativement, le vecteur d’expression FBRBP peut être cotransfecté en cellules avec pBase et pPiggyBac-BirA-V5 ensemble.</li>
	<li>Faire pousser les cellules en mESC sur des plats gélatineux et maintenir dans le milieu de culture mES (Table of Materials) en 5% CO2 à 37 °C. Sélectionnez les cellules transfectées avec hygromycine b (100 μg/mL) pendant 1 semaine.</li>
	<li>Après la sélection des médicaments, récolter les cellules par tampon de chargement SDS (tableau 1) et utiliser une tacheoccidentale 23 pour confirmer le marquage et l’expression du gène avec un anticorps FLAG et streptavidine-HRP, respectivement.</li>
</ol>2. Liaison croisée
<ol><li>Plaque ~3 x 10cellules de 6 mES dans une plaque de 10 cm 1 jour avant l’expérience afin que les cellules se développent à 70−90% de confluence lors de la récolte (~5−10 millions de cellules par échantillon).</li>
	<li>Retirer le milieu avec un vide. Traiter les cellules avec 2 mL de 0,25% trypsine-EDTA pendant 2 min à température ambiante (RT) et étancher la trypsine de 4 mL de mESC frais moyen. Transférer les cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 mL. Faites tourner les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 3 min à 4 °C et retirez le supernatant.</li>
	<li>Suspendre les cellules avec 4 mL de PBS froid et plaquer les cellules à la plaque de 10 cm pour la liaison croisée. Relier les cellules par rayonnement à la lumière UV de 254 nm (réglez le lien entre les UV et un paramètre de 400 mJ/cm2). REMARQUE : Pour les monocouches cellulaires, les cellules peuvent être reliées directement à la lumière UV sur la plaque avant le traitement par trypsine.</li>
	<li>Transférer les cellules croisées dans un tube de 15 mL. Faites tourner vers le bas par centrifugation à 300 x g pendant 3 min à 4 °C et retirez le supernatant. REMARQUE : La pastille cellulaire croisée peut être stockée à -80 °C jusqu’à utilisation.</li>
</ol>3. Préparation de lysate cellulaire
<ol><li>Lyse les cellules avec 500 μL de tampon de lavage A (Tableau 1) fraîchement complété avec 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1/500 cocktail inhibiteur de la protéase, et 400 U / mL inhibiteur RNase. Transférer les cellules dans un tube de 1,5 mL sans RNase. Incuber les cellules pendant 30−60 min sur un rotor avec rotation douce à 4 °C.</li>
	<li>Traiter le lysate avec 30 μL de DNase I à 37 °C pendant 10 min. Arrêtez la réaction en ajoutant 4 μL de 0,5 M EDTA. Faites tourner la pastille insoluble de 12 000 x g pendant 20 min à 4 °C et transférez le supernatant dans un nouveau tube préchilled de 1,5 mL. REMARQUE : Pour une utilisation immédiate, restez sur la glace. Si le supernatant ne sera pas utilisé immédiatement, conservez-le à -80 °C jusqu’à utilisation.</li>
</ol>4. Préparation de perles FLAG
<ol><li>Ajouter 40 μL de perles FLAG de boue par échantillon à un tube frais de 1,5 mL.</li>
	<li>Lavez rapidement les perles avec 0,5 mL de tampon de lavage glacé A et faites tourner vers le bas de 3 000 x g pendant 2 min à 4 °C.</li>
	<li>Répétez l’étape 4.2 une fois. Faire tourner les perles avec 3 000 x g pendant 2 min à 4 °C. Retirez soigneusement le tampon à l’aide d’une pointe de pipette à extrémité étroite. Évitez d’enlever les perles.</li>
</ol>5. Immunoprécipice
<ol><li>Transférer la lysate cellulaire de l’étape 3.2 aux perles FLAG prééquilibrées. Faites pivoter tous les échantillons sur un shaker à rouleaux à 4 °C doucement. Incuber les perles FLAG avec du lysate pendant 2−4 h ou toute la nuit.</li>
	<li>Centrifuger les perles pendant 2 min à 3000 x g et enlever le surnatant.</li>
	<li>Laver les perles avec 0,5 mL de tampon de lavage préchilled A par incubation pendant 5 min dans un rotateur à 4 °C, faire tourner les perles avec 3 000 x g pendant 2 min et enlever le surnatant. Répétez le lavage 1x.</li>
	<li>Répétez le lavage 2x tel que décrit à l’étape 5.3 avec 0,5 mL de tampon de lavage préchilled B (tableau 1).</li>
</ol>6. Elution avec peptide FLAG 3x
<ol><li>Préparez la solution d’élitution FLAG 3x en dissolvant 1 mg de peptide FLAG 3x avec 5 mL de tampon de lavage A à une concentration finale de 200 ng/mL.</li>
	<li>Faites tourner les perles FLAG de l’étape 5.4 avec 3.000 x g pendant 2 min. Retirer soigneusement le surnatant. Assurez-vous que la plupart du supernatant est enlevé à l’aide d’une pointe de pipette à extrémité étroite.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de solution d’élitution FLAG 3x à chaque échantillon. Incuber les échantillons en rotation douce pendant 30 min à 4 °C. Faites tourner les perles FLAG pendant 2 min à 3 000 x g. Transférer les surnatants dans des tubes frais.</li>
	<li>Répétez l’élitution 2x tel que décrit dans les étapes 6.2 et 6.3 et mettre en commun les élitants ensemble. Économisez 5 % des élites pour l’analyse des taches occidentales ou la coloration en argent pour vérifier l’efficacité de FLAG-IP.</li>
</ol>7. Préparation de perles de Streptavidin
<ol><li>Préparer 50 μL d’une boue de perle streptavidine pour chaque échantillon. Recueillir les perles avec un support magnétique pendant 30 s et enlever le supernatant avec une pointe pipette.</li>
	<li>Lavez rapidement les perles avec 0,5 mL de tampon de lavage glacé A et recueillez les perles avec un support magnétique de 30 s.</li>
	<li>Répétez le lavage 1x. Retirer le surnatant après le lavage.</li>
</ol>8. Purification d’affinité de biotine
<ol><li>Transférer les élisents mis en commun de l’étape 6.4 aux perles de streptavidine de l’étape 7.3 et faire pivoter doucement les échantillons à 4 °C pendant 1−3 h ou toute la nuit.</li>
	<li>Recueillir les perles avec un support magnétique pour 30 s et enlever le surnatant. Laver les perles 2x avec 500 μL de tampon de lavage C (Tableau 1) par rotation douce à RT pendant 5 min.</li>
	<li>Recueillir les perles avec le support magnétique et enlever le supernatant. Laver les perles 2x avec 500 μL de tampon de lavage D (Tableau 1) en tournant à RT pendant 5 min.</li>
	<li>Recueillir les perles avec le support magnétique et enlever le supernatant. Lavez rapidement les perles 2x avec 500 μL de tampon PNK glacé (tableau 1).</li>
</ol>9. Digestion partielle de l’ARN
<ol><li>Faire une dilutionde 10 5fois de MNase avec tampon de réaction MNase (Tableau 1). Ajouter 100 μL de solution MNase à chaque échantillon. Vortex les perles à 37 °C avec un mélangeur thermique fixé à 1200 rpm (5 s de course, 30 s d’arrêt) pendant 10 min, recueillir les perles avec un support magnétique pour 30 s et enlever le supernatant. REMARQUE : La concentration de MNase doit être optimisée pour différentes protéines liant l’ARN. La concentration de MNase qui peut digérer les ARN en fragments de 30−50 nt (déterminés par la taille de l’insertion de la bibliothèque finale) est optimale.</li>
	<li>Lavez rapidement les perles 2x avec 500 μL de tampon PNK+EGTA glacé(tableau 1). Recueillir les perles avec un support magnétique et enlever le supernatant entre chaque étape de lavage.</li>
	<li>Laver les perles 2x avec 500 μL de tampon de lavage C par rotation douce pendant 5 min à RT. Lavez ensuite rapidement les perles 2x avec 500 μL de tampon PNK glacé.</li>
</ol>10. Déphosphorylation de l’ARN
<ol><li>Faire un mélange de réaction de l’intestin du veau (CIP) avec 8 μL de tampon CIP 10x (Tableau des matériaux), 3 μL d’enzyme CIP, et 69 μL d’eau. Le volume total est de 80 μL par réaction.</li>
	<li>Recueillir les perles avec un support magnétique et enlever le tampon. Ajouter le mélange de réaction CIP aux perles. Vortex les perles à 37 °C avec un mélangeur thermique réglé à 1200 rpm (5 s de course, 30 s d’arrêt) pendant 10 min.</li>
	<li>Lavez rapidement les perles 2x avec 500 μL de tampon PNK+EGTA glacé. Lavez rapidement les perles 2x avec 500 μL de tampon PNK glacé.</li>
</ol>11. Ligature linker 3'
<ol><li>Faire un mélange linker 3' avec 4 μL de 20 μM 3' linker, 4 μL de 10x T4 ARN ligase tampon, 4 μL de 50% PEG8000, 2 μL de T4 ARN ligase 2 (tronqué), et 26 μL d’eau. Le volume total est de 40 μL par réaction.</li>
	<li>Recueillir les perles de l’étape 10.3 avec un support magnétique et retirer le tampon. Ajouter 40 μL du mélange de ligature linker de 3' aux perles. Vortex les perles à 16 °C avec un mélangeur thermique réglé à 1200 rpm (5 s de course, 30 s d’arrêt) pendant 3 h ou toute la nuit.</li>
	<li>Lavez rapidement les perles 2x avec 500 μL de tampon PNK+EGTA glacé. Lavez rapidement les perles 2x avec 500 μL de tampon PNK glacé.</li>
</ol>12. Traitement PNK
<ol><li>Faire un mélange PNK avec 4 μL de tampon PNK 10x, 2 μL d’enzyme T4 PNK, 1 μL de 10 mM ATP, et 33 μL d’eau. Le volume total est de 40 μL par réaction.</li>
	<li>Recueillir les perles avec un support magnétique et enlever le tampon. Ajouter 40 μL de mélange PNK aux perles. Vortex les perles doucement à 37 °C avec un mélangeur thermique fixé à 1200 rpm (5 s de course, 30 s d’arrêt) pendant 10 min.</li>
	<li>Lavez rapidement les perles avec 500 μL de tampon PNK+EGTA glacé.</li>
	<li>Lavez rapidement les perles avec 500 μL de tampon PNK glacé. Économisez 5 % des perles pour l’analyse des taches occidentales ou argentées afin de confirmer l’efficacité de l’immunoprécipitation.</li>
</ol>13. Isolement de l’ARN
<ol><li>Recueillir les perles de l’étape 12.4 avec un support magnétique et retirer le tampon. Ajouter 200 μL de tampon de digestion proteinase K (Tableau 1). Vortex les perles pendant 30 min à 37 °C avec un mélangeur thermique réglé à 1200 rpm (5 s de course, 30 s d’arrêt). Isoler magnétiquement les perles et prendre le supernatant pour l’expérience.</li>
	<li>Ajouter 400 μL de reagent d’isolation arn(Tableau des matériaux)au supernatant de l’étape 13.1, bien mélanger et incuber sur la glace pendant 5 min. Ajouter 80 μL de chloroforme et bien mélanger, puis incuber sur la glace pendant 5 min. Tournez vers le bas avec 12.000 x g pendant 10 min 4 °C. REMARQUE : Cette étape doit être effectuée dans une hotte chimique.</li>
	<li>Prenez le supernatant (~500 μL) et ajoutez deux volumes de mélange isopropanol:éthanol (1:1), 1/10 volume de 3 M d’acétate de sodium (pH = 5,5) et 1 μL de glycogène. Congeler à -20 °C pendant 2 h. Centrifugeuse à 4 °C avec 12 000 x g pendant 20 min.</li>
	<li>Lavez la pastille 2x avec de l’éthanol glacé à 70 %. Faites tourner la pastille à 4 °C avec 12 000 x g pendant 5 min. Retirer le surnatant et sécher la pastille. Dissoudre les ARN dans 5 μL de H2O sans RNase.</li>
</ol>14. 5' Ligature linker ARN
<ol><li>Faire un mélange de ligature arn de 5' avec 1 μL de tampon ligase 10x T4 ARN, 0,5 μL de BSA (1 μg/μL), 1 μL de 10 mM ATP, 1 μL d’inhibiteur de RNase, et 0,5 μL de Ligase D’ARN T4. Le volume total est de 4 μL par réaction.</li>
	<li>Ajouter 1 μL de 5' 20 μM de liaison ARN à l’ARN de l’étape 13.4, dénominateur de l’ARN en chauffant à 70 °C pendant 2 min, et réfrigérer sur la glace immédiatement.</li>
	<li>Ajouter le mélange de ligature arn de 5' à l’ARN de l’étape 14.2. Incuber à 16 °C pendant la nuit.</li>
</ol>15. Transcription inversée
<ol><li>Purifier les ARN tels que décrits à l’article 13 et dissoudre l’ARN avec 11,5 μL d’eau exempte de RNase.</li>
	<li>Ajouter 1 μL d’amorce de transcription inversée de 10 μM à l’ARN purifié, chauffer à 70 °C pendant 2 minutes et réfrigérer immédiatement sur la glace.</li>
	<li>Faites un mélange de transcription inversée avec 4 μL de tampon de transcription inverse de 5 x, 1 μL de 10 mM dNTP, 1 μL de 0,1 M DTT, 1 μL d’inhibiteur de la RNase et 0,5 μL de transcriptase inverse (Tableau des matériaux). Le volume total est de 7,5 μL par réaction.</li>
	<li>Ajouter 7,5 μL de mélange de transcription inverse à l’ARN, incuber à 50 °C pendant 30 min et arrêter la réaction par incubation à 70 °C pendant 10 min. Laisser à 4 °C.</li>
</ol>16. Amplification PCR
<ol><li>Faire un mélange d’amplification PCR avec 15 μL de 2x PCR master mix (Table of Materials), 5 μL de cDNA à partir de l’étape 15.4, 0,6 μL d’amorce avant de 10 μM 1 ( tableau2), 0,6 μL de 10 amorce inversée μM 1 (tableau 2) et 8,8 μL de H2O. Le volume total est de 30 μL.</li>
	<li>Amplifiez l’ADN avec les réglages suivants : 98 °C 30 s, 98 °C 10 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s (répéter les étapes 2−4 pendant 15−20 cycles), 72 °C 2 min et tenir à 4 °C. Exécutez le produit PCR sur un gel d’agarose de 2−3%. Découpez l’ADN de ~100−150 bp, extrayez l’ADN avec le kit d’extraction de gel(tableau des matériaux),et élisez l’ADN avec 20 μL d’eau.</li>
	<li>Prenez 3 μL du produit PCR purifié, amplifiez avec l’amorce avant 2 (tableau 2) et l’amorce inversée 2 (amorce de l’indice; Tableau 2) tel que décrit à l’étape 16.2 pendant cinq cycles pour introduire des séquences d’index. Purifier le produit PCR tel que décrit à l’étape 16.2.</li>
	<li>Séquencez la bibliothèque avec une plate-forme de séquençage à haut débit.</li>
</ol>17. Analyse bioinformatique
<ol><li>Effectuer l’analyse des données à l’aide de programmes commerciaux commedécrit précédemment 8.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+Mapping+of+DROSHA+Cleavage+Sites+on+Primary+MicroRNAs+and+Noncanonical+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates.</a> Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).</li>
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<li>Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+in+vivo+biotinylation+to+study+protein-protein+and+protein-DNA+interactions+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).</li>
<li>Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+piggyBac+transposon-based+mammalian+cell+expression+system+for+inducible+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).</li>
<li>Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The Western Blot.</a> Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).</li>
<li>Aktas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DHX9+suppresses+RNA+processing+defects+originating+from+the+Alu+invasion+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome.</a> Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).</li>
<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Crosslinking+Immunoprecipitation+%28eCLIP%29+Method+for+Efficient+Identification+of+Protein-bound+RNA+in+Mouse+Testis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59681(2019).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous introduisons une méthode CLIP-seq modifiée appelée FBIoCLIP-seq, en profitant du système flag-biotine double marquage pour effectuer la purification en tandem des complexes protéines-ARN. Il a été démontré que le système de double étiquetage FLAG-biotine est puissant pour identifier les interactions protéine-protéines et protéines-ADN13,21. Ici, nous démontrons la grande spécificité et la commodité de ce système dans l’identification des ARN ...

Les ARN et les protéines liant l’ARN contrôlent divers processus cellulaires, y compris l’épissage, la traduction, la biogenèse ribosome, la régulation épigénétique et la transition du destincellulaire 1,2,3,4,5,6. Les mécanismes délicats de ces processus dépendent de l’arrangement spatial et temporel unique des ARN et des PRR. Par conséquent, une étape importante vers la compréhension de la régulation de l’ARN au niveau moléculaire consiste à révéler les informations positionnelles sur les sites contraignants des P RB.
Une stratégie appelée liaison croisée et immunoprécipitation (CLIP-seq) a été mise au point pour capturer les interactions protéine-ARN avec les liaisons UV suivies de l’immunoprécipitation de la protéine d’intérêt7. La principale caractéristique de la méthodologie est l’induction de liens croisés covalents entre une protéine liant l’ARN et ses molécules d’ARN directement liées (dans ~1 Å) par irradiation UV8. Les empreintes RBP peuvent être déterminées par le clustering des balises CLIP et l’appel de pointe, qui ont généralement une résolution de 30−60 nt. Alternativement, l’étape de transcription inverse de CLIP peut conduire à des indélébiles (insertions ou suppressions) ou des substitutions aux sites de liaison croisée, ce qui permet d’identifier les sites de liaison protéique sur les ARN à une résolution à nucléotide unique. Des pipelines comme Novoalign et CIMS ont été développés pour l’analyse des résultats de séquençage à haut débit de CLIP-seq8. Plusieurs méthodes clip-seq modifiées ont également été proposées, y compris la résolution individu-nucléotide reliant et immunoprécipitant (iCLIP), clip amélioré (eCLIP), irCLIP, et ribonucleoside-amélioré photoactivatable cross-linking and immunoprecipitation (PAR-CLIP)9,10,11,12.
Malgré l’utilisation à grande échelle des méthodes traditionnelles clip-seq dans l’étude des P RB, les méthodes CLIP présentent plusieurs inconvénients. Tout d’abord, l’électrophoresis de gel dénaturé fastidieux et la procédure de transfert de membrane peuvent mener à la perte de l’information, et causer la complexité limitée de séquence. Deuxièmement, la méthode clip à base d’anticorps protéiques peut tirer vers le bas un complexe protéique au lieu d’une seule protéine cible, ce qui peut conduire à de fausses interactions positives protéine-ARN à partir des RBPs copurifiés. Troisièmement, la stratégie à base d’anticorps nécessite une grande quantité d’anticorps de haute qualité, ce qui rend l’application de ces méthodes inadéquate pour l’étude des RBPs sans anticorps de haute qualité disponibles. Quatrièmement, la méthode CLIP traditionnelle exige que l’ATP radioétique étiqueter les ARN liés aux protéines.
La forte affinité de la streptavidine avec les protéines biotinylées en fait une approche très puissante pour purifier des protéines ou des complexes protéiques spécifiques. La biotinylation efficace des protéines portant une séquence artificielle de peptide par ligase bactérien de biotine de BirA exprimée ectopiquement dans les cellules mammifères en fait une stratégie efficace pour exécuter la purification de biotine in vivo13. Nous avons développé une méthode clip-seq modifiée appelée FBIoCLIP-seq(FLAG-Bioteinté Cross-lencrage et jemmunoprecipitation suivie d’un séquençage à haut débit) en utilisant FLAG-biotin tag tandem purification14 (Figure 1). Grâce à la purification en tandem et à des conditions de lavage rigoureuses, presque tous les P RB en interaction sontéliminés ( figure 2). Les conditions de lavage rigoureuses permettent également de contourner le SDS-PAGE et le transfert de membrane, qui est exigeant en main-d’œuvre et techniquement difficile. Et semblable à eCLIP et irCLIP, la méthode FBIoCLIP-seq est sans isotopes. Sauter les étapes de fonctionnement et de transfert du gel permet d’éviter la perte d’informations, de garder intactes les interactions protéine-ARN authentiques et d’augmenter la complexité de la bibliothèque. De plus, l’efficacité élevée du système de marquage en fait un bon choix pour les P RB sans anticorps de haute qualité disponibles.
Ici, nous fournissons une description étape par étape du protocole CLIP-seq fbiopour les cellules mammifères. En bref, les cellules sont reliées entre elles par 254 nm UV, suivies de la lyse cellulaire et de l’immunoprécipitation FLAG (FLAG-IP). Ensuite, les complexes protéine-ARN sont encore purifiés par la capture d’affinité de biotine et les ARN sont fragmentés par digestion partielle avec MNase. Ensuite, l’ARN lié aux protéines est déphosphorylaté et ligaté avec un linker de 3'. Un lieneur d’ARN de 5' est ajouté après que l’ARN soit phosphorylaté avec PNK et élulisé par la digestion de proteinase K. Après transcription inverse, les signaux arn lié aux protéines sont amplifiés par PCR et purifiés par purification du gel agarose. Deux RBPs ont été choisis pour illustrer le résultat de FBIoCLIP-seq. LIN28 est une protéine liant l’ARN bien caractérisée impliquée dans la maturation des microARN, la traduction des protéines et la reprogrammationcellulaire 15,16,17. WDR43 est une protéine contenant du domaine WD40 qui coordonnerait la biogenèse ribosome, la transcription eucaryotique et le contrôle de la pluripotence des cellules souchesembryonnaires 14,18. Conformément aux résultats précédemment rapportés pour LIN28 avec CLIP-seq, FbioCLIP-seq révèle des sites contraignants de LIN28 sur des motifs « GGAG » dans le microARN mir-let7g et les ARNM16,19 (Figure 3). WDR43 FbioCLIP-seq a également identifié la préférence contraignante de WDR43 avec des espaceurs transcrits externes de 5' (5'-ETS) des pré-rRNAs20 (Figure 4). Ces résultats valident la fiabilité de la méthode FBIoCLIP-seq.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV crosslinker</td><td>UVP</td><td>HL-2000 HybrilLinker</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Affinity Purification Beads</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG</td><td>perles Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Beads</td><td>Invitrogen</td><td>112.06D</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Réactifs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>70013032</td><td></td></tr><tr><td>3 M NaOAc</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>3 x FLAG peptide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium (CaCl2)</td>La mémoire tampon CIP <td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>NEB</td><td></td><td>M0290S</td><td>est dans le même boîtier.</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purification de gel</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Glycogène</td><td>Ambion</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449172</td><td></td></tr><tr><td>MNase</td><td>NEB</td><td>M0247S</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Amresco</td><td>M158-500ML</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10837091001</td><td></td></tr><tr><td>Porteinase K</td><td>TAKARA</td><td>9033</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail inhibiteur de protéase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity 2X Master Mix</td><td>NEB</td><td>0492S</td><td></td></tr><tr><td>trancriptase inverse ( SupperScriptIII)</td><td>Invitrogen</td><td>18080093</td> réactif d’isolement de l’ARN (Trizol)Invitrogen 15596018 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>inhibiteur de la RNase</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Invitrogen</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 Dnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1614363</td><td></td></tr><tr><td>Le tampon</td><td>Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Le désoxycholate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>est dans le même emballage.</td></tr><tr><td>L’ARN ligase T4</td>, <td>le tampon ThermoFisher</td><td>EL0021</td><td>L’ARN ligase T4 et le BSA sont dans le même emballage.</td></tr><tr><td>L’ARN ligase T4 T4 (ARN ligase2),</td> le tampon <td>NEB</td><td>M0242S</td> tronqué <td>(ARN ligase T4) et 50 % de PEG sont dans le même package.</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Urée</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208884</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fort>milieu de culture ESCm</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM (80 %)</td><td>Gibco</td><td>11965126</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>FCS (15 %)</td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (1 %)</td><td>Protéine</td><td></td> recombinante purifiée Gibco 35050061 <td></td></tr><tr><td>LIF</td><td></td><td></td><td>; dilution 10 000 fois</td></tr><tr><td>NEAA (1 %)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>mélange de nucléosides (1 %)</td><td>Millipore</td><td>ES-008-D</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (1 %)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kit d’extraction de gel d’ADN</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr></tbody></table>

transcriptome-wide profiling of protein-rna interactions by cross-linking and immunoprecipitation mediated by flag-biotin tandem purification

Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification

Les protéines liant l’ARN et l’ARN (P RB) contrôlent de multiples processus biologiques. L’arrangement spatial et temporel des ARN et des PRR sous-tend la réglementation délicate de ces processus. Une stratégie appelée CLIP-seq (liaison croisée et immunoprécipitation) a été mise au point pour capturer les interactions protéine-ARN endogènes avec les liaisons UV suivies d’immunoprécipitation. Malgré l’utilisation à grande échelle de la méthode clip-seq conventionnelle dans l’étude RBP, la méthode CLIP est limitée par la disponibilité d’anticorps de haute qualité, de contaminants potentiels provenant des P RB copurifiés, de l’exigence de manipulation des isotopes et de la perte potentielle d’information au cours d’une procédure expérimentale fastidieuse. Ici, nous décrivons une méthode clip-seq modifiée appelée FBIoCLIP-seq en utilisant la purification tandem tag FLAG-biotine. Grâce à la purification en tandem et à des conditions de lavage rigoureuses, presque toutes les protéines liant l’ARN interagissent sont éliminées. Ainsi, les ARN qui interagissent indirectement sous la couverture de ces PRR copurifiés sont également réduits. Notre méthode FBIoCLIP-seq permet une détection efficace des ARN directs liés aux protéines sans SDS-PAGE et sans procédures de transfert de membrane s’il n’y a pas d’isotopes et d’anticorps spécifiques aux protéines.

La représentation schématique de la procédure CLIP-seq du Fbioest indiquée dans la figure 1. Par rapport à la purification d’affinité en une étape médiée par flag ou à base de streptavidine, la purification en tandem FLAG-biotine a éliminé presque toutes les protéines copurifiées, évitant ainsi la contamination des interactions indirectes protéine-ARN (figure 2). Les résultats représentatifs de FBIoCLIP-seq pour LIN28 et WDR43 sont représen...

Ici, nous présentons un protocole CLIP-seq modifié appelé FBIoCLIP-seq avec purification tandem FLAG-biotine pour déterminer les cibles arn des protéines liant l’ARN (RBPs) dans les cellules mammifères.

RNA and RNA-binding proteins (RBPs) control multiple biological processes. The spatial and temporal arrangement of RNAs and RBPs underlies the delicate ...

Seules et seules les protéines contraignantes contrôlent de multiples processus biologiques. Cette méthode FLAG-Biotin CLIP-seq, donc pour profiler globalement l’arrangement spécial et temporel des ARN et des RBPs dans les cellules mammifères. Cette méthode permet la détection efficace des ARN directs liés aux protéines sans SDS-PAGE et les procédures de transfert de membrane.Par rapport à clip-seq traditionnel est sans isotopes et il ne nécessite pas d’anticorps spécifiques aux protéines. Commencez par placage d’environ 3 millions de cellules souches embryonnaires de souris dans une plaque de 10 centimètres et les incuber pendant la nuit. Le lendemain, retirer le milieu avec un vide et traiter les cellules avec deux millilitres de 0,25% trypsine EDTA pendant deux minutes à température ambiante.Étanchez la trypsine avec quatre millilitres de moyenne MESC fraîche, et transférez les cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Ensuite, centrifugez-les à 300 fois G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius et retirez le supernatant. Suspendre les cellules en quatre millilitres de PBS froid et les transférer à la plaque de 10 centimètres pour la liaison croisée.Rayonnez les cellules avec une lumière UV de 254 nanomètres, puis transférez les cellules croisées dans un tube de 15 millilitres. Faites tourner ces cellules à 300 fois G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius, puis retirez le supernatant et lysez les cellules avec 500 microlitres de tampon A préparés selon les directives manuscrites. Transférez les cellules dans un tube de 1,5 millilitre sans RNAse et incubez-les à quatre degrés Celsius avec rotation douce pendant 30 à 60 minutes.Traiter le lysate avec 30 microlitres de DNAse 1 à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, arrêtez la réaction en ajoutant quatre microlitres de 0,5 molaire EDTA. Faites tourner la pastille insoluble en centrifugant à 12 000 fois G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius, et transférez le supernatant dans un nouveau tube pré-refroidi de 1,5 millilitre.Transférer la cellule lysate dans des perles FLAG prééquilibrées et incuber l’échantillon à quatre degrés Celsius pendant la rotation de deux à quatre heures. Après l’incubation, centrifuger les perles pendant deux minutes à 3000 fois G et enlever le supernatant. Ajouter 500 microlitres de tampon A à l’échantillon, et incubé à 4 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis faire tourner les perles et enlever le surnatant.Répétez le lavage avec le tampon A, suivi de deux lavages avec une elute tampon B.To pré-réfrigérée avec un peptide FLAG de trois X, préparez la solution d’élitution telle que décrite dans le manuscrit du texte et faites tourner les perles FLAG. Retirez le supernatant avec une pointe de pipette à extrémité étroite et ajoutez 200 microlitres des trois solutions d’élitution X FLAG à chaque échantillon. Incuber les échantillons pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius avec rotation douce.Puis faites tourner les perles pendant deux minutes à 3000 fois G.Transférer le supernate dans un tube frais et répéter l’élitution deux fois. Économisez 5 % des évasés pour l’analyse des taches occidentales ou la coloration argentée pour vérifier l’efficacité de l’immunoprécipitation FLAG. Transférer les élitants tirés sur des perles de streptavidine préparées et faire pivoter les échantillons doucement à quatre degrés Celsius pendant une à trois heures ou toute la nuit.Ensuite, recueillir les perles sur un support magnétique et enlever le surnatant. Laver les perles deux fois avec 500 microlitres de Tampon C avec rotation douce pendant cinq minutes par lavage. Ensuite, lavez les perles deux fois avec 500 microlitres de Buffer D, et deux fois avec 500 microlitres de tampon PNK glacé, en recueillant les perles sur le support magnétique et en enlevant le supernatant entre les lavages.Pour effectuer la digestion partielle de l’ARN, ajouter 100 microlitres de solution MNA à chaque échantillon et vortex réglé à 37 degrés Celsius avec un mélangeur thermique pendant 10 minutes. Recueillir les perles avec un support magnétique pendant 30 secondes et enlever le surnatant. Ensuite, lavez-les avec le tampon PNK-EDTA, le tampon C et le tampon PNK selon les instructions manuscrites.Recueillir les perles avec le support magnétique et enlever le tampon. Ajouter ensuite le mélange de réaction CIP et vortexer les perles à 37 degrés Celsius à l’aide d’un mélangeur thermique pendant 10 minutes. Lavez rapidement les perles deux fois avec 500 microlitres de tampon PNK EDTA glacé, suivi de deux lavages avec 500 microlitres de tampon PNK glacé.Après les lavages, ajouter 40 microlitres de trois mélanges de ligature linker premier aux perles, et les vortex à 16 degrés Celsius avec un mélangeur thermique pendant trois heures ou toute la nuit. Une ligature efficace du lien avec les alliés est essentielle pour cette expérience. Vérifiez le tube de réaction de temps en temps pour s’assurer que ceux-ci ne précipitent pas pendant la ligature.Après l’incubation, répéter les lavages avec des tampons PNK EDTA et PNK, ajouter 40 microlitres de PNK mélangés aux perles, et les vortex à 37 degrés Celsius avec le mélangeur thermique pendant 10 minutes. Lavez les perles avec des tampons PNK EDTA et PNK, puis procédez à l’isolement de l’ARN tel que décrit dans le manuscrit du texte. Comparé à flag-médié ou streptavidin médié une purification d’affinité d’étape, purification de tandem flag-biotine enlevé presque toutes les protéines purifiées de noyau, évitant la contamination des interactions indirectes d’ARN de protéine.LIN28 et WDR43, FBIo CLIP-seq a été effectué à l’aide de cellules SOUCHES embryonnaires de souris. Au total, environ 7,7 millions et 2,2 millions de lectures uniques ont été récupérées pour LIN28 et WDR43 respectivement. La comparaison des vues de la voie montre différents modèles de liaison dans le locus pré-rRNA de la RN45.Les sites reliés entre les deux sur le motif GGA G de l’ARN pré-let7-g par LIN28, FBIo CLIP-seq ou identifiés. En outre, des motifs enrichis d’ARN dans les sites de liaison, et le pourcentage de nucléotides mutés dans différents types de mutations ont été déterminés. Montrant que LIN28 préfère se lier au nucléotide génétique.Eh bien, à 22h00, ce protocole, il est important de confirmer l’efficacité de l’immunoprécipitation pour s’assurer que les complexes protéiques seulement ont été purifiés avec succès.

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Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification (Vidéo) | JoVE Journal

Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification

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