Localisation et quantification des bégomovirus dans les tissus de la mouche blanche par immunofluorescence et PCR quantitatif

Clarifier la spatialité et la quantité de virus chez les vecteurs de la linge blanche peut aider à comprendre les interactions begomovirus-whitefly et à élaborer de nouvelles stratégies pour contrôler les maladies graves du begomoviral. Les avantages de cette technique sont que nous pouvons rapidement isoler les tissus de la luxation blanche, co-localisé les protéines virales et les protéines de la fly blanche, et quantifier les virus dans les corps entiers de la luge blanche et les plantes infectées par le virus. Au moment expérimental approprié, après l’acquisition du virus, placez les mouches blanches femelles anesthésiées par la glace dans une goutte de PBS sur une lame de microscope et utilisez une aiguille d’acupuncture fine pour ouvrir l’abdomen de la mouche blanche sous un microscope stéréo.

Utilisez l’aiguille pour extraire le midgut et placer le midgut dans un plat de collection de PBS. Pour recueillir les PSGs, divisez le corps au thorax du côté dorsal près de la tête et fixez la liffe blanche avec une aiguille par le thorax. Utilisez une deuxième aiguille pour secouer la luxure jusqu’à ce que les deux glandes salivaires soient séparées du corps et transférez les glandes dans un nouveau plat de PBS.

Pour recueillir les ovaires, ouvrez complètement l’abdomen et utilisez une aiguille pour séparer les ovaires des autres tissus. Utilisez une pipette pour enlever l’excès de tissu et transférer les ovaires dans un nouveau plat de PBS. Pour recueillir un échantillon d’hémolymph, ajouter 10 microlitres de PBS sur une nouvelle lame de microscope et placer une nouvelle luxère blanche dans la gouttelette.

Utilisez une aiguille d’acupuncture fine pour faire doucement un trou dans l’abdomen. Ensuite, appliquez une légère pression sur l’abdomen pour libérer l’hémolympe dans le tampon et recueillir un échantillon de huit microlitres du liquide. Pour visualiser la localisation du TYLCV dans la mouche blanche récoltée PSG, midgut, ou tissus ovariens, transférer 15 à 20 spécimens dans un verre de 3,5 centimètres de boîte de Pétri et aspirer l’excès de tampon.

Fixer les tissus en un millilitre de 4 % de paraformaldéhyde pendant deux heures à température ambiante avant de laver soigneusement les échantillons trois fois pendant deux minutes dans un millilitre de SCT frais par lavage. Après le dernier lavage, perméabiliser les échantillons avec un millilitre de 0,5%Triton X-100 pendant 30 minutes avant de laver trois fois comme il vient de le démontrer avec un millilitre de TBST par lavage. Après le dernier lavage, bloquer toute liaison non spécifique avec un millilitre d’albumine sérique bovine de 1 % pendant deux heures à température ambiante, suivie de trois lavages dans tbst comme démontré.

Après le dernier lavage, étiquetez les cellules avec les anticorps primaires d’intérêt pendant la nuit à quatre degrés Celsius protégés de la lumière. Le lendemain matin, lavez les échantillons trois fois avec tbst avant d’ajouter les anticorps secondaires appropriés pendant deux heures à température ambiante protégée de la lumière. À la fin de l’incubation, lavez les miguts trois fois et transférez les spécimens à une lame de microscope propre.

Enlever autant de tampon que possible et tacher les noyaux avec une goutte de DAPI avant de monter avec un coverslip et d’examiner les tissus étiquetés par microscopie confoccale. Pour la quantification de TYLCV, lavez les échantillons récoltés de tissu de mouche blanche deux à trois fois dans le PBS frais et transférez 20 midguts, 20 PSGs, ou un ovaire dans cinq microlitres de PBS dans les tubes individuels de PCR contenant 25 microlitres de solution de lyse. Ajouter cinq à sept perles de céramique de deux millimètres de diamètre à chaque tube et moudre les échantillons dans un homogénéisateur.

Ajouter un échantillon de huit microlitres d’hémolympe dans un nouveau tube PCR et ajouter 10 microlitres de lyse au tube avec un mélange complet. Incuber tous les échantillons à 65 degrés Celsius pendant une heure, suivi d’une incubation de 10 minutes à 100 degrés Celsius et d’une brève centrifugation. Ensuite, ajoutez 18 microlitres de mélange principal dans les flacons de tubes quantitatifs de bande PCR et ajoutez deux microlitres de chaque échantillon d’ADN à au moins trois flacons.

Lorsque tous les échantillons ont été chargés, fermez les tubes et la centrifugeuse pour sédimenter la solution au fond de chaque flacon. Chargez les flacons sur un cycleur thermique en temps réel pour pcr quantitatif, en sélectionnant cyber comme colorant fluorophore et inconnu comme type d’échantillon. Exportez ensuite les données quantitatives vers une feuille de calcul pour analyse de la quantité relative d’ADN viral dans chaque échantillon.

Ici, des images représentatives de TYLCV dans la coloration de DAPI dans les PSGs de mouche blanche, les midguts, et les ovaires sont montrées. Comme nous l’avons observé, tvlcv démontre une plus grande accumulation dans les PSGs et les midguts que dans les ovaires. La quantification du virus chez les PSGs à mouche blanche, les midguts, les hémolymph et les ovaires après s’être nourris de tomates infectées par le TYLCV pendant 24, 48 et 72 heures indique que la quantité de virus augmente dans différents tissus de mouche blanche en corrélation directe avec l’augmentation de la période d’accès à l’acquisition.

Il est préférable d’utiliser des mouches blanches fraîches, car les insectes morts augmenteront la difficulté de la dissection. À la suite de cette procédure, d’autres analyses, comme le ballonnement occidental et la co-immunoprécipitation, peuvent être effectuées pour répondre à d’autres questions sur l’expression des protéines virales et les interactions virales et vectorielles de protéines.