Découverte des cibles réglementaires de csgD dans le biofilm de Salmonella utilisant l'immunoprécipitation de chromatine et le séquençage à haut débit (ChIP-seq)

L’immunoprécipitation de la chromatine suivie du séquençage, ou ChIP-seq, est une technique qui peut être utilisée pour découvrir les cibles réglementaires des facteurs de transcription, des modifications de l’histone et d’autres protéines associées à l’ADN. Dans le ChIP-seq, les cellules sont récoltées et les protéines liant l’ADN. est lié à l’ADN in vivo avec du formaldéhyde.

Les cellules sont lysées, libérant le contenu cellulaire et la chromatine est cisaillée en fragments de moins de 1000 paires de base, généralement entre 200 et 600 paires de base. L’ADN, qui interagit avec la protéine cible, est immunoprécipité à l’aide d’anticorps et isolé par découpage. Les liens croisés des protéines de l’ADN sont inversés et l’ARN et les protéines sont digérés.

L’ADN est purifié, transformé en bibliothèques et séquencé. Les données ChIP-seq peuvent également être utilisées pour trouver une liaison différentielle des facteurs de transcription dans différentes conditions environnementales ou types de cellules. Initialement, chip a été exécuté par hybridation sur un microarray.

Cependant, le séquençage du ChIP est devenu la méthode préférée en raison des progrès technologiques, de la diminution des obstacles financiers au séquençage et de la production massive de données de haute qualité. Dans ce protocole, nous démontrerons des techniques d’exécution de ChIP-seq avec des biofilms bactériens, une source majeure d’infections persistantes et chroniques. ChIP-seq sera effectué sur le biofilm de salmonella typhimurium et les cellules planctoniques, ciblant le régulateur principal de biofilm, CSGD, pour déterminer la liaison différentielle dans les deux types de cellules.

Dans cette vidéo, nous démontrerons des techniques de détermination de la quantité appropriée de biofilm à récolter, de normalisation d’un échantillon de contrôle planctonique, d’homogénéisation du biofilm pour l’accès à des liaisons croisées et d’exécution d’étapes chip-seq de routine pour obtenir des résultats de séquençage de haute qualité. Streak plaque salmonella enterica servir notre typhimurium sur une plaque d’agar LB pour isoler les colonies et incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Inoculer cinq mL de bouillon LB avec une à trois colonies de la plaque strie et incuber à 37 degrés Celsius en secouant pendant sept heures ou pour enregistrer la croissance.

Trouvez la densité optique de la culture des flacons à 600 nanomètres, à l’aide d’un spectrophotomètre et ajoutez un équivalent OD 600 de la culture cellulaire ou 10 aux neuf cellules à un flacon Erlenmeyer contenant 100 millilitres de tryptone à un pour cent. Incuber à 28 degrés Celsius en secouant pendant 13 heures. Les cellules biofilm apparaissent sous forme de flocons agrégés et les cellules planctoniques simples se trouvent dans les médias nuageux.

Les biofilms sont très résistants et collent aux côtés des tubes et des pointes de pipette. Nous utilisons des supports conditionnés pour déplacer le biofilm au début et utiliser pbs chaud immédiatement avant le croisement pour enlever les substrats de liaison croisée des protéines dans les médias. Les chercheurs devront peut-être trouver une solution appropriée pour suspendre à nouveau le biofilm.

Recueillir la culture du flacon dans un tube de centrifugeuse et une centrifugeuse à 12 000 G pendant 10 minutes à 10 degrés Celsius. Décanter le supernatant dans une unité de filtre de 0,2 micromètre et un filtre à vide. Aliquot flacon culture en tubes et centrifugeuses à vitesse lente pour séparer les deux types de cellules.

Les cellules de biofilm sont dans la pastille au fond du tube et les cellules simples sont dans le surnatant nuageux. Pipette le supernatant contenant des cellules planctoniques dans un tube de centrifugeuse pour plus tard. 25 microgrammes d’ADN sont recommandés comme entrée pour les expériences ChIP-seq.

Dans notre cas, 30 milligrammes de biofilm produisent environ 25 microgrammes d’ADN. Puisque les agrégats de biofilm ont une abondance de matériel extracellulaire proteinaceous, il concurrence pour le crosslinker et peut avoir comme conséquence le produit croisé inégal présenté pour l’immunoprécipitation. Un essai de protéine pour déterminer le matériel cellulaire équivalent par concentration de protéine est suggéré.

Dans ce cas, six cellules planctoniques OD 600 sont récoltées comme un contrôle pour 30 milligrammes de biofilm. Biofilm est récolté par poids humide et les unités agricoles de la colonie de biofilm peuvent être trouvés en utilisant le facteur de conversion montré. Les chercheurs sont encouragés à trouver le facteur de conversion du biofilm formant des espèces avec qui ils travaillent par homogénéisation et dilutions goutte.

Suspendez à nouveau la pastille de biofilm dans un millilitre de tryptone conditionné et déplacez-vous dans un bouchon de deux millilitres pré-pesé ou un tube de bouchon à vis. Centrifugeuse pendant une minute à 11 000 G.Retirez le supernatant du tube et pesez le tube avec précision. Soustrayez le poids du tube du poids du tube avec du biofilm pour trouver le poids des agrégats.

Il devrait être dans les 10% du poids cible du biofilm. Ajouter un millilitre de PBS et de vortex pour suspendre à nouveau les agrégats de biofilms. Distribuez le supernatant de centrifugation à vitesse lente dans des tubes de centrifugeuse.

Mesurez la densité optique des cellules planctoniques à 600 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre et calculez le volume requis pour un OD 600 final sur six. Refroidir la centrifugeuse Flora à 10 degrés Celsius et pelleter les cellules planctoniques à l’aide de la centrifugeuse Flora. Centrifugeuse à 10 000 G pendant 10 minutes à 10 degrés Celsius.

Retirer le supernatant et suspendre à nouveau la pastille dans PBS. Mesurez l’OD 600 des cellules planctoniques à l’aide d’un spectrophotomètre et distribuez le volume de six cellules planctoniques OD 600 dans un bouchon de deux millilitres ou un tube de bouchon à vis. Les agrégats biofilm doivent être décomposés pour permettre à crosslinker d’accéder aux cellules.

Les cellules planctoniques sont traitées de la même manière que les cellules biofilm pour réduire les variables. L’utilisation de perles métalliques dans un moulin à mélangeurs peut être plus efficace pour briser le biofilm que les homogénéisateurs de tissus en verre. Aseptiquement, ajouter une perle métallique stérilisée à chacun des tubes.

Homogénéiser à l’aide d’un moulin à mélangeur pendant cinq minutes à 30 Hertz. Observez les tubes agrégés pour confirmer que le biofilm a été décomposé avant de transférer les cellules homogénéisées dans un nouveau tube de 1,5 millilitre, évitant ainsi la perle métallique. Porter le volume à un millilitre avec PBS.

À ce stade, il est facultatif d’effectuer des dilutions de chute pour énumérer les cellules d’entrée. Distribuer du formaldéhyde frais dans des tubes d’échantillon à une concentration finale de 1 %. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante sur une roue rotative.

Ajouter la glycine à une concentration finale de 125 millimolaires pour étancher les liaisons croisées et incuber pendant cinq minutes à température ambiante sur une roue rotative. Pour laver les cellules et enlever l’excès de lien entre les deux, centrifugeuse pendant trois minutes à 8000 G et enlever le supernatant. Suspendre à nouveau la pastille dans les inhibiteurs de la protéase et 500 microlitres de filtre stérilisé PBS.

Suspendre à nouveau la pastille dans 600 microlitres de tampon de lyse et incuber sur la glace pendant 10 minutes. Déplacez le lysate partiel vers un nouveau tube contenant 1,4 millilitres de tampon de dilution IP. Garder sur la glace pendant une heure et demie à deux heures et vortex de temps en temps.

Certains matériaux résistants peuvent rester dans les tubes. Cependant, une longue période d’incubation et un vortex occasionnel briseront le matériel agrégé et le reste sera brisé pendant la sonication. Accordez le sonicateur.

Placez le tube de 15 millilitres dans un bécher de glace et placez la sonde à l’intérieur du tube. Pulsez à 20 à 40 pour cent pendant cinq éclats de sonication de 30 secondes et refroidissez entre les tours de sonication. Le lysate cellulaire apparaîtra nuageux avant la sonication et apparaîtra clair après la sonication.

Pour enlever le matériau précipité, centrifugeuse à 8000 G pendant 10 minutes à quatre degrés et distribuer le supernatant dans un nouveau tube, en évitant la pastille noire. Le transfert d’énergie de sonicator et la résistance de type de cellule peuvent différer ainsi un essai de sonication est recommandé pour trouver le nombre de tours de sonication qui produiront la gamme de taille de fragment exigée pour la préparation et le séquençage en aval de bibliothèque. Distribuez l’ADN sonicated dans un aliquot de 1,35 millilitre pour l’immunoprécipitation et un aliquot de 200 microlitres comme ADN d’entrée.

Gardez le contrôle des entrées à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce que les étapes de dé-croisement et de digestion. Après avoir testé les anticorps pour assurer leur spécificité pour la protéine cible, ajouter l’anticorps aux tubes d’immunoprécipitation et incuber à quatre degrés Celsius pendant la nuit sur une roue rotative. Ajouter 50 microlitres de perles magnétiques de protéine G et incuber à quatre degrés Celsius sur une roue rotative pendant trois heures.

Lier les perles sur les côtés des tubes à l’aide d’un support magnétique et effectuer des lavages. Lavez-les deux fois avec 750 microlitres de tampon de lavage IP froid. Lavez-en un avec 750 microlitres de tampon de lavage IP froid deux.

Et laver deux fois avec 750 microlitres de TE froid au pH huit. Gardez les tubes sur le support magnétique pendant les lavages. Ajouter 450 microlitres de tampon d’élitution IP à chaque tube et incuber à 65 degrés Celsius pendant 30 minutes avec vortex doux toutes les cinq minutes.

Lier les perles sur les côtés des tubes à l’aide d’un support magnétique. Attendez au moins deux minutes jusqu’à ce que la solution soit claire, puis distribuez la solution déblayée à un nouveau tube de 1,5 millilitre. Pour inverser les liens croisés et digérer l’ARN, ajoutez deux microgrammes de RNase huit et ajoutez du chlorure de sodium à votre concentration finale de 0,3 molaire dans chaque tube.

Incuber à 65 degrés Celsius pendant plus de six heures ou toute la nuit. Pour digérer les protéines, ajouter 180 microgrammes de proteinase K à chaque tube et incuber à 45 degrés Celsius pendant trois à cinq heures. Purifiez l’ADN.

Les perles magnétiques sont préférées pour isoler les petites quantités d’ADN récupérées pendant le ChIP avec des cellules bactériennes. Cependant, l’extraction basée sur la colonne ou le phénylchloroforme peut récupérer adéquatement l’ADN de ChIP. Après purification, les bibliothèques sont préparées à partir d’ADN ChIP purifié à l’aide d’un kit compatible avec la plate-forme de séquençage sélectionnée.

Les bibliothèques d’ADN ChIP nécessitent souvent d’ajouter le minimum d’adaptateurs et d’effectuer le nombre maximum de cycles d’amplification PCR. Vérifiez la taille de la bibliothèque par un bioanalyseur et vérifiez la concentration de la bibliothèque à l’œil ou à l’œil d’une trousse de quantification de la bibliothèque QPCR. Mettre en commun les bibliothèques et procéder au séquençage selon les spécifications de la plate-forme sélectionnée.

L’analyse des données ChIP-seq nécessite la qualité de base de notation, la coupe de bases de mauvaise qualité, l’alignement d’un assemblage se lit sur un génome de référence, l’appel des pics, l’association des pics avec les gènes, et l’analyse des motifs contraignants surreprésentés. Les données ChIP-seq ont généralement un faible niveau d’arrière-plan. L’ADN qui est contrôlé par la protéine ciblée par l’immunoprécipitation sera enrichi et apparaîtra comme des pics qui sont au moins deux fois au-dessus du fond.

Dans cette vidéo, nous avons décrit des méthodes pour effectuer chIP-seq sur le biofilm de salmonelle et les cellules planctoniques simples qui donne des crêtes de l’ADN enrichi aux gènes commandés par le facteur de transcription d’intérêt. On pense que la majorité de la vie bactérienne dans la nature existe dans les biofilms et que jusqu’à 40 % des maladies humaines seraient liées au biofilm. Ils ont donc d’énormes répercussions médicales et économiques.

Cependant, le biofilm est résistant et plus difficile à énumérer, à ouvrir et à manipuler. Les chercheurs peuvent utiliser les techniques chip-seq que nous avons décrites pour récolter une quantité appropriée de biofilm, homogénéiser le biofilm, les cellules de lyse, le sonicate, effectuer l’immunoprécipitation, purifier et séquencer l’ADN d’autres espèces bactériennes formant des biofilms.