Name: Génération d’organoïdes mammaires mosaïques par trypsinisation différentielle (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Découvrez la trypsinisation différentielle pour isoler les cellules myoépithéliales et épithéliales luminales de glandes mammaires murines. Cette méthode préserve l'intégrité cellulaire pour la culture 3D d'organoides.

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Nous remercions Ben Abrams pour l’assistance technique et le soutien de base de l’Université de Californie, Santa Cruz (UCSC) Institute for the Biology of Stem Cells (IBSC). Nous remercions Susan Strome et Bill Saxton pour l’utilisation de leur Solamere Spinning Disk Confocal Microscope. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions de l’UCSC de l’Institut médical Howard Hughes par l’entremise du programme de bourses James H. Gilliam pour l’étude avancée (S.R.), des NIH (NIH GM058903) pour l’initiative visant à maximiser le perfectionnement des étudiants (H.M.) et de la National Science Foundation for a graduate research fellowship (O.C. DGE 1339067) et une subvention (A18-0370) du Comité de coordination de la recherche sur le cancer de l’UC (LH).

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Californie à Santa Cruz.
1. Jour 1 : Digestion des glandes mammaires
<ol><li>Préparez-vous à récolter les GM de souris femelles matures de 10 à 14 semaines.<ol>
<li>Effectuer la récolte sur un banc ouvert dans des conditions aseptiques.</li>
		<li>Stériliser tous les fournitures chirurgicales, les planches à liège et les broches en autoclaving et en trempant dans 70% d’alcool pendant 20 minutes avant la chirurgie.</li>
		<li>Anesthésiez les animaux atteints de pentobarbital de sodium (dose anesthésique 2X de 0,06 mg/g de poids corporel) administrés par injection intraperitonéale avec une seringue à insuline de 0,5 mL.</li>
		<li>Surveillez le niveau d’anesthésie en pinçant les tocoups de l’animal pour vérifier une réponse réflexe et commencer le protocole seulement après que l’animal est entièrement anesthésié.</li>
		<li>Placez l’animal sur le dos, épinglez ses appendices sur le carton de liège et essuyez son abdomen et sa poitrine avec de l’éthanol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour récolter les #2, 3, 4 et 5 MG d’une souris (c.-à-d., 8 MG, figure 1A), identifier la ligne médiane entre les deux pattes postérieures et faire une petite incision (1 cm) sur la peau abdominale avec des ciseaux pointus, puis étendre la coupe jusqu’au cou18.</li>
	<li>Suivez en faisant de petites coupures latéralement vers les jambes et les bras pour permettre la libération de la peau à l’aide d’un coton-tige. Éloignez la peau et étirez-la serrée avant de l’épingler d’un côté(figure 1B, étape 1)18. Retirez les GM en coupant sous eux, et retirez les ganglions lymphatiques des glandes #4 (figure 1B, étapes 2, 3)18. Répétez la procédure de l’autre côté du corps.</li>
	<li>Recueillir le tissu MG dans 50 ml de 4 'C Dulbecco’s Modified Eagle’s Media (DMEM)/Nutrient Mixture F12 (F12) complété par 5% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1X Antibiotique-antimycotique (Anti-Anti)18.</li>
	<li>Hacher les glandes dans un plat de 35 mm ou sur une plaque en céramique à l’aide d’une lame de rasoir ou d’un hélico. Faites pivoter la plaque toutes les cinq côtelettes manuelles ou chaque tour sur l’hélico de tissu jusqu’à ce que les morceaux de tissu puissent s’adapter à une pointe de micropipette de 1 ml avec facilité (0,1 mm/fragment, figure 1C).</li>
	<li>Digest les GM dans Le milieu de la digestion (voir tableau 1) pendant 14 h dans un plat d’adhérence 6 puits à 37 oC, 5% de CO2.</li>
</ol>2. Jour 2 : Isolement des fragments mammaires épithéliaux de tissu
<ol><li>Après 14 h de digestion, mélanger délicatement en tuyautant le tissu digéré 10X à l’aide d’une micropipette de 1 ml pour décomposer tout tissu stroma ou adipeux restant, en veillant à ce que ni les bulles ni l’excès de force mécanique ne soient générés. REMARQUE : S’il y a une digestion incomplète après 14 h, cela pourrait être dû à l’accumulation d’ADN cisaillement. Dans ce cas, ajouter 1 l de 1 mg/mL deoxyribonuclease I (DNase I) par 2 ml de Digestion Medium. Incuber pour un autre 30 min à 37 oC, 5% de CO2.</li>
	<li>Recueillir les tissus dans un tube de 15 ml et rincer le puits utilisé pour la digestion avec 2-3 ml de culture tissulaire grade 1X Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) exempt de Ca2 et Mg2 . Centrifugeuse à 600 x g pour 10 min.</li>
	<li>Évacuer le supernatant contenant la couche lipidique et le milieu, puis réutilisez la pastille dans 5 ml de DPBS et passez à un nouveau tube de 15 ml. Centrifugeuse à 600 x g pour 10 min.</li>
	<li>Pendant la centrifugation, placez une passoire à cellules en nylon de 70 m dans un tube de 50 ml et prélasse la passoire à l’aide de 10 ml de DMEM/F12 de 37 oC.</li>
	<li>Résuspendez des fragments de tissu de l’étape du protocole 2.4 utilisant 5 ml de DPBS et passez la suspension par une passoire de cellules en nylon de 70 m pour enlever les cellules stromales et les cellules mononiques(figure 1D).</li>
	<li>Recueillir les fragments de tissu sur la passoire cellulaire. Rincer 4X avec 10 ml de DMEM/F12 de 37 oC(figure 1D). CAUTION : Le rinçage incomplet entraînera des cultures contaminées par des cellules non épithéliales.</li>
	<li>Relâchez les fragments de tissu en tenant l’onglet de pasoire avec les doigts gantés, en inversant la passoire sur un plat de culture tissulaire de 60 mm et en passant 1 mL d’aliquots de maintenance moyenne (voir tableau 1) à travers le fond de la pasoire 4X (figure 1E).</li>
	<li>Vérifiez la passoire pour les restes de fragments de tissu, qui seront visibles à l’œil nu, et rincez la passoire 1X plus avec 1 mL de milieu d’entretien si des fragments adhèrent encore à la passoire. Les fragments de tissus rincés doivent maintenant être exempts de cellules stromales.</li>
	<li>Examinez rapidement le plat de 60 mm contenant les fragments de MG de l’étape 2.9 du protocole sous un microscope inversé (objectif 4X ou 10X, figure 1F). Une préparation typique de huit MG donne 500 fragments. Recherchez des cellules simples ou des gouttelettes de graisse et s’il y a des cellules contaminantes. REMARQUE : S’il y a des cellules contaminantes, répétez l’étape de filtration en recueillant le milieu et les fragments du plat de 60 mm à l’aide d’une pipette de 5 ml et en filtrant à nouveau le fragment à travers une souche fraîche de 70 m, en répétant les étapes du protocole 2,6, 2,8-2,10.</li>
	<li>Incuber 24 h à 37 oC, 5% de CO2, permettant au fragment de tissu d’adhérer et de générer des fragments bicouches(figure 2A). REMARQUE : Si les fragments ne se sont pas installés à 24 h, continuez à incuber jusqu’à ce qu’ils soient respectés. Si les fragments n’adhèrent pas bien, la séparation des compartiments cellulaires ne fonctionnera pas. Si les chercheurs sont préoccupés par l’adhérence, les plaques de culture tissulaire peuvent être traitées pour favoriser l’attachement des fragments (p. ex., poly-L-lysine).</li>
</ol>3. Jour 3 : Trypsinisation différentielle des cellules épithéliales myoépitheliales et luminales
<ol><li>Pour séparer les MyoEC des LEC, videz les supports du plat, rincez 1x avec 1 ml de DPBS et ajoutez 1 ml de trypsin frais-EDTA (0,05 %), et surveillez attentivement la digestion sous un microscope inversé (objectif 10X ou 20X, figure 2B,C,F). Le détachement de la couche MyoEC externe nécessitera 3-6 min, selon trypsin-EDTA (0,05%) Force. REMARQUE : Veuillez consulter la figure 2 pour les images représentatives montrant ce processus. Sous l’éclairage de champ lumineux, les MyoECs semblent arrondis et ont une apparence plus lumineuse par rapport aux LEC, qui restent adhérés au centre et semblent plus foncés.</li>
	<li>Recueillir la fraction MyoEC dans un tube de 15 mL contenant 2 mL 10% FBS/DPBS. Sans déranger les LEC, rincez doucement le plat de 60 mm avec 2 ml de DPBS, puis éliminez le DPBS(figure 2H-I). REMARQUE: La récupération habituelle pour les MyoECs est dans une fourchette de (3,5 x 106-1,5 x 106) selon la taille des MGs.</li>
	<li>Pour enlever la fraction LEC, ajouter 1 ml de trypsin-EDTA (0,05 %) à nouveau au plat et incuber 7-15 min, la surveillance soigneusement pour prévenir la surdigestion. Étécher la trypsine-EDTA (0,05%) sur le plat avec 2 ml de FBS/DPBS à 10%. Recueillir la fraction LEC dans un nouveau tube de 15 ml. REMARQUE : La récupération habituelle des LEC se situe dans une fourchette (2 x 106-4,2 x 106) selon la taille des GM. Systématiquement, la pureté des deux fractions comme l’analyse l’immunohistochimie est de 90 %19 (figure 2E).</li>
	<li>Centrifugeuse chaque fraction pendant 5 min à 300 x g pour enlever la trypsine-EDTA (0,05%). Réutilisez la granule dans 250 l de maintenance moyenne et comptez chaque population cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé. Placer les cellules sur la glace tout en comptant. REMARQUE : Si la manipulation génétique des fractions cellulaires est désirée, les cellules primaires peuvent être cultivées sur des plats d’adhérence basse et infectées par le lentivirus20.</li>
</ol>4. Jour 3 : Combiner et intégrer des fractions cellulaires dans une matrice extracellulaire
REMARQUE : Une fois que les fractions MyoEC et LEC ont été collectées et comptées, elles peuvent être combinées. Le ratio MyoEC/LEC typique est de 1:3 (figure 3A)19. Différentes études peuvent être réalisées. Par exemple, pour effectuer des études en mosaïque, des fractions peuvent être générées à partir de souris de type sauvage (WT) et mutantes (Mut) et combinées (MyoEC/LEC : WT/WT; WT/Mut; Mut/WT; Mut/Mut)21, ou fractions peuvent être combinés en utilisant différents ratios de MyoECs/LECs19.
<ol><li>En fonction du nombre de cellules, calculez le nombre de puits (8 puits de chambre, voir Tableau des matériaux) qui doivent être préparés pour 12 000 cellules/puits (p. ex. 3 000 MyoEC : 9 000 LEC).</li>
	<li>Établir la couche de base de la culture 3D en ajoutant 90 L de 50% ECM (50% ECM/50% DMEM/F12, sans phénol rouge - voir le tableau des matériaux) à chacun puits. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles et que les puits sont enduits uniformément. Pour solidifier la couche de base, incuber les diapositives à 37 oC, 5% de CO2 pendant 30 min. REMARQUE : L’ECM doit rester glacé jusqu’à cette étape, sinon elle polymérisera prématurément et conduira à un revêtement de base et à une polymérisation inégales. L’utilisation d’un ECM de base améliore la croissance organoïde dans un seul plan, ce qui facilite la capture d’image. Cela permet également une croissance organoïde plus rapide et utilise moins ECM22.</li>
	<li>Pendant la polymérisation, préparer les mélanges cellulaires. Pelletez les fractions MyoEC et LEC à 300 x g pendant 5 min et réutilisez chaque fraction cellulaire dans 10% ECM/90% Medium croissance de sorte que chaque puits a 100 ll (voir le tableau 1 pour la façon de faire la croissance moyenne). REMARQUE : Pour faciliter la préparation, répliquez les puits à l’aide des mêmes mélanges cellulaires. Ceux-ci peuvent être combinés et préparés dans un tube (p. ex., quatre puits d’un même mélange cellulaire peuvent être préparés en 400 L de 10% ECM/90% Croissance Moyenne).</li>
	<li>Ajouter 100 l de chaque mélange cellulaire dans 10% ECM/90% Croissance Moyenne à chaque puits et permettre aux organoïdes de se contenter de 20 min à 37 oC, 5% de CO2.</li>
	<li>Une fois que les cellules se sont installées, ajoutez délicatement 100 L de Medium de croissance en détraquant doucement la paroi de la chambre de chaque puits. Incuber les diapositives à 37 oC, 5% de CO2 (voir la figure 3A pour la composition totale de chaque puits). REMARQUE : L’inhibiteur de Rho Kinase, R-spondin, et Nrg1 sont des facteurs qui ont été identifiés comme importants pour la culture à long terme des organoïdes cultivés à partir des cellules mammaires murines primaires et des cellules cancéreuses humaines du sein13,14. En outre, les facteurs de cellules souches B27 et N2 prolongent le temps que les organoïdes peuvent être cultivés.</li>
	<li>Cellules d’image tous les 24 h pour suivre leur croissance et renouveler doucement le milieu de croissance tous les 2-3 jours en utilisant 100 L/puits(figure 3B-E). REMARQUE : Utilisez un soin extrême lors du renouvellement du médium. Inclinez les toboggans de chambre pour recueillir le milieu à un coin des puits. Retirez 100 l’eau du milieu et réapprovisionnez-le avec soin pour laisser la couche ECM intacte.</li>
	<li>Si les chercheurs sont intéressés à étudier la lactation/alvéoloogenèse, passez à Alveologenesis Medium (voir tableau 1) le jour 5 et continuez à renouveler le milieu tous les 2-3 jours jusqu’au jour 10(figure 3F) ou au-delà en passant en utilisant la solution de récupération (voir le tableau des matériaux)13. REMARQUE : À ce stade, les organoïdes peuvent être isolés de l’ECM en incuber à 4 oC dans la solution de récupération de 4 'L de 4 'C (voir tableau des matériaux pour le protocole et les informations de réactif).</li>
</ol>5. Jour 5 ou 10 : Correction et immunostachation des organoïdes
<ol><li>Retirez soigneusement le milieu en dépisant doucement les supports (une pipette à ampoule fonctionne mieux). Rincez chaque puits à l’aide de 200 L de saline tamponnée au phosphate de 1x Dulbecco (DPBS, voir recettes).</li>
	<li>Fixer les organoïdes à l’aide de paraformaldéhyde (PFA) à froid (4 oC) (w/v) pendant 10 min à température ambiante. CAUTION: PFA est dangereux. Portez de l’équipement de protection individuelle (manteau de laboratoire, gants et lunettes de sécurité). Cette étape doit être effectuée à l’intérieur d’une hotte à fumée. REMARQUE : L’ECM est dissoute par le traitement PFA. L’ablation incomplète d’ECM peut mener à la coloration de fond quand les organoïdes sont analysés par immunofluorescence.</li>
	<li>Retirez le PFA de 4 % et ajoutez 200 L de 0,2 % (w/v) glycine/DPBS (voir tableau 1) à chaque puits. Incuber les toboggans à température ambiante pendant 30 min ou 4 oC pendant la nuit sur une surface rocheuse réglée à un réglage lent. REMARQUE : Les organoïdes peuvent être entreposés pendant 1 à 3 jours dans le DPBS à 4 oC avant l’étape suivante.</li>
	<li>Perméabiliser les organoïdes à l’aide de DPBS - 0,25% Triton X-100 (PBST, voir tableau 1) pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Bloquer les organoïdes à l’aide de sérum d’âne (DS) (ou tout autre sérum correspondant à l’espèce de l’anticorps secondaire) dans DPBS pendant 1 h sur une surface rocheuse. REMARQUE : Cette étape peut être effectuée toute la nuit à 4 oC sur une surface rocheuse.</li>
	<li>Préparer les anticorps primaires dans 1% DS/DPBS. Utilisez 125-200 L pour chaque puits. Effectuez l’immunostaining en incuber les organoïdes dans l’anticorps primaire pendant la nuit à 4 oC sur une surface rocheuse.</li>
</ol>6. Jour 11 : Immunofluorescence complète
<ol><li>Laver chaque puits 2X avec 200 T PBST pendant 5 min. Ajouter l’anticorps secondaire dans 1% DS/DPBS en utilisant 125-200 L pour chaque puits. Incuber à température ambiante sur une surface rocheuse pendant 45 min.</li>
	<li>Laver chaque puits 2X à l’aide de 200 T PBST par puits.</li>
	<li>Tacher les noyaux à l’aide de colorant à ADN Hoechst dans DPBS (1:2,000 en DPBS) pendant 5 minutes à température ambiante.</li>
	<li>Retirer tout le liquide laissé sur le puits en s’aspirant doucement avec un aspirateur.</li>
	<li>Retirez soigneusement les chambres et le joint, placez une goutte (30 l) de supports de montage (voir tableau des matériaux) sur chaque puits et couvre-porte, en prenant soin d’enlever les bulles. Laisser sécher lame dans un espace sombre pendant 1-2 jours. Sceller avec du vernis à ongles clair. Imagez les organoïdes sur un microscope confocal (figure 3E-F).</li>
</ol>

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<li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li>
<li>Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PLoS One. 6 (9), e25661(2011).</li>
<li>Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+human+reduction+mammoplasty+and+mastectomy+tissues+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), e50011(2013).</li>
<li>Marlow, R., Dontu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+breast+cancer+bone+metastatic+niche+in+complex+three-dimensional+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).</li>
<li>Koledova, Z., Lu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+Fibroblast-Epithelium+Co-culture+Model+for+Understanding+Microenvironmental+Role+in+Branching+Morphogenesis+of+the+Mammary+Gland%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland.</a> Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, une méthode est présentée détaillant comment les chercheurs peuvent générer des cultures organoïdes 3D à l’aide de cellules MG primaires. La différence entre ceci et d’autres protocoles est que nous détaillons une méthode pour séparer les deux compartiments cellulaires MG distincts : les MyoEC basiques externes et les LEC intérieurs. Notre méthode utilise une trypsine en deux étapes-EDTA (0,05 %) traitement que nous appelons la trypsinisation différentielle19. Cette procédure permet aux cherc...

La glande mammaire (MG) est une structure épithéliale tubulaire ressemblant à un arbre encastrée dans un stroma riche en adipocytes. L’épithélium canalaire bilayered comprend une couche externe basale de cellules contractiles et myoépithelial (MyoECs) et une couche interne de cellules épithéliales luminales et sécrétrices (LEC), encerclant un lumen central1. Pendant la lactation lorsque les MyoEC externes se contractent pour presser le lait des LEC alvéolaires intérieurs, le MG subit de nombreux changements qui sont sous le contrôle de facteurs de croissance (p. ex., EGF et FGF) et d’hormones (p. ex. progestérone, insuline et prolactine). Ces changements provoquent la différenciation des structures spécialisées, les alvéoles, qui synthétisent et sécrètent du lait pendant la lactation1. L’épithélia mammaire peut être manipulée expérimentalement à l’aide de techniques dans lesquelles soit des fragments épithéliaux de tissu, des cellules, ou même une seule cellule basale sont transplantés dans des coussinets de graisse mammaire hôte, précoléarisés du parenchyme mammaire endogène, et a permis de se développer pour reconstituer un arbre épithélial completentier,3,,4,5. La transplantation est une technique puissante, mais elle prend beaucoup de temps et impossible si une mutation entraîne une létalité embryonnaire précoce (avant E14) qui empêche le sauvetage de l’anlage mammaire transplantable. En outre, les chercheurs souhaitent fréquemment faire des recherches sur les rôles des deux compartiments différents, qui sont dérivés de cellules progénitrices restreintes à la lignée. Bien que la technologie Cre-lox permette une manipulation génétique différentielle des MyoEC et des LEC, il s’agit également d’une entreprise longue et coûteuse. Ainsi, depuis les années 1950, les chercheurs ont utilisé des organoïdes mammaires in vitro comme un moyen relativement facile et efficace de répondre aux questions concernant la structure et la fonction des tissus mammaires6,,7.
Dans les premiers protocoles décrivant l’isolement et la culture des cellules épithéliales mammaires primaires, les chercheurs ont constaté qu’une matrice de membrane de sous-sol (BME), composée d’un caillot de plasma et d’extrait d’embryon de poulet, était nécessaire pour des fragments de MG cultivés sur un plat6. Dans les décennies suivantes, des matrices extracellulaires (ECMs, collagène, et la matrice de protéines gelées sécrétées par les cellules de sarcome murine Engelbreth-Holm-Swarm) ont été développées pour faciliter la culture 3D et mieux imiter l’environnement in vivo7,8,9,10. Cellules de culturing dans des matrices 3D indiquées par de multiples critères (morphologie, expression génique, et réactivité hormonale) qu’un tel microenvironnement de meilleurs modèles dans les processus physiologiquesvivo 9,10,11,12. La recherche utilisant les cellules murines primaires a identifié des facteurs de croissance et des morphogènes clés nécessaires pour l’entretien prolongé et la différenciation des organoïdes13. Ces études ont préparé le terrain pour le protocole présenté ici, et pour la culture des cellules mammaires humaines comme organoïdes 3D, qui est maintenant un outil clinique moderne, permettant la découverte de médicaments et le dépistage des médicaments sur les échantillons de patients14. Dans l’ensemble, le culturing organoïde met en évidence les capacités d’auto-organisation des cellules primaires et leurs contributions à la morphogenèse et à la différenciation.
Présenté ici est un protocole à la culture épithélia murine qui peut être différencié en acini producteur de lait. Une technique de trypsinisation différentielle est utilisée pour isoler les MyoEC et les LEC qui composent les deux compartiments cellulaires MG distincts. Ces fractions de cellules séparées peuvent alors être manipulées génétiquement pour surexprimer ou renverser la fonction du gène. Parce que la lignée intrinsèque, l’auto-organisation est une propriété innée de cellules épithéliales mammaires15,16,17, recombiner ces fractions cellulaires permet aux chercheurs de générer bilayered, organoïdes mosaïques. Nous commençons par digérer enzymatiquement le tissu adipeux, puis incuber les fragments mammaires sur un plat de culture tissulaire pour 24 h (figure 1). Les fragments de tissu s’installent sur les plats en polystyrène comme fragments bilayered avec leur organisation in vivo : couche myoepithelial externe entourant les couches lumineuses intérieures. Cette organisation cellulaire permet l’isolement des MyoECs externes par trypsin-EDTA (0,05 %) traitement pour 3-6 min suivi d’un deuxième tour de trypsin-EDTA (0,05%) traitement qui détache les LEC intérieurs restants(figure 2). Ainsi, ces types de cellules avec une sensibilité différente à la trypsine sont isolés et peuvent ensuite être mélangés et plaqués dans ECM(figure 3). Les cellules subissent l’auto-organisation pour former des sphères bilayered, comprenant une couche externe de MyoECs entourant les LEC intérieurs. La formation de Lumen se produit pendant que les cellules se développent dans un milieu contenant un cocktail de facteurs de croissance (voir recettes pour le milieu de croissance)13. Après 5 jours, les organoïdes peuvent être différenciés en acini producteurs de lait en passant à Alveologenesis Medium (voir recettes et figure 3F) et incubés pendant encore 5 jours. Alternativement, les organoïdes continueront à se développer et se brancheront dans Growth Medium pendant au moins 10 jours. Les organoïdes peuvent être analysés à l’aide d’immunofluorescence(figure 3D-F)ou libérés de l’ECM à l’aide d’une solution de récupération (voir tableau des matériaux)et analysés par d’autres méthodes (p. ex., immunoblot, RT-qPCR).

<table><tbody><tr><td>Tube conique en polypropylène haute clarté de 15 ml (BD Falcon)</td><td>Plaque</td><td>de</td> fixation ultra-basse 352096 24 puits Fisher Scientific CLS3473-24EA <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>35 mm traitée TC (BD Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique en polypropylène haute clarté de 50 ml (BD Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>352098</tr><tr><td>Boîte de culture cellulaire de style facile à saisir (BD Falcon) de 60 mm traitée TCharFisher</td> <td>Scientific</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro ; Passoire à cellules en nylon M (Corning)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique-antimycosique (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td>Pen/Strep fonctionne également</td></tr><tr><td>Supplément B27 sans vitamine A (50x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>souris B6 ACTb-EGFP</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>003291</td><td></td></tr><tr><td>BD Seringue à insuline 0,5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-826-79</td><td></td></tr><tr><td>Dispase de classe 2 (Roche)</td><td>Millipore Sigma</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>Classe 3 Collagénase</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004206</td><td></td></tr><tr><td>Corning Solution de récupération cellulaire</td><td>Fisher Scientific</td><td>354253</td><td>Suivre les directives d’utilisation &ndash ; Extraction de structures tridimensionnelles à partir de la matrice Corning Matrigel Corning</td></tr><tr><td>Costar Attachement ultra-faible 6 puits</td><td>Fisher Scientific</td><td>CLS3471</td><td></td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Millipore Sigma</td><td>D4902-25MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12, sans rouge de phénol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11039-021</td><td></td></tr><tr><td>DNase (désoxyribonucléase I)</td><td>Worthington</td><td>Biochemical LS002007</td><td></td></tr><tr><td>Âne anti-chèvre 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21447</td><td>Utilisation à 1:500, Lot : 1608641, stock 2 mg/mL, RRID : AB_2535864</td></tr><tr><td>Âne anti-souris 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-606-150</td><td>Utilisation à 1:1000, Lot : 140554, stock 1,4 mg/mL</td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium : Mélange de nutriments F-12 (DMEM/F12)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-250</td><td>sans Mg2+/Ca2+</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Fisher Scientific</td><td>AF-100-15-100ug</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal de bovin</td><td>VWR</td><td>97068&ndash ; 085</td><td>100 % US Origine, qualité premium, Lot : 059B18</td></tr><tr><td>Fluoromount-G (Southern Biotech)</td><td>Fisher Scientific</td><td>0100-01</td><td>Désigné comme support de montage dans le texte</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-WAP</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>SC-14832</td><td>Utilisation au 1:250, Lot : J1011, stock 200 & micro ; g/mL, RRID :AB_677601</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>AnaSpec</td><td>AS-83218</td><td>Utilisation 1:2000, stock est de 20mM</td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Millipore Sigma</td><td>I6634-100mg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>KRT14&ndash ; CreERtam</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5107</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Facteur de croissance réduit (DFG) ; Sans rouge de phénol ; 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40230C</td><td>Lot : 8204010, concentration de matière 8,9 mg/mL</td></tr><tr><td>Unité de filtration MillexGV 0,22 & micro ; m</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Millicell EZ SLIDE Verre à 8 puits, stérile</td><td>Millipore Sigma</td><td>PEZGS0816</td><td>Ces lames de chambre sont idéales pour l’enlèvement des joints, mais d’autres marques peuvent bien fonctionner (par exemple, Lab Tek II).</td></tr><tr><td>Souris anti-SMA</td><td>Millipore Sigma</td><td>A2547</td><td>Utilisation à 1:500, Lot : 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID :AB_476701</td></tr><tr><td>N-2 Supplément (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>S468-500</td><td></td></tr><tr><td>Nrg1</td><td>R& D</td><td>5898-NR-050</td><td></td></tr> Programme <tr><td>national d’hormones et de peptides</td><td></td> de<td>prolactine hypophysaire ovine</td><td>Acheté au Dr Parlow à l’Institut de recherche et d’éducation Harbor-UCLA</td></tr><tr><td>Paraformaldahyde</td><td>Millipore Sigma</td><td>PX0055-3</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Millipore Sigma</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>R26R-EYFP</td><td>Le laboratoire Jackson</td><td>6148</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de Rho Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin</td><td>Peprotech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Sérum d’âne filtré stérile</td><td>Equitech-Bio Inc.</td><td>SD30-0500</td><td></td></tr><tr><td>Sérum d’âne filtré stérile</td><td>Equitech-Bio Inc.</td><td>SD30-0500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>x100-500ML</td><td>Qualité laboratoire</td></tr><tr><td>Trypsine EDTA 0.05</td><td> %Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-062</td><td></td></tr></tbody></table>

génération d’organoïdes mammaires mosaïques par trypsinisation différentielle

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Les organoïdes offrent des structures tissulaires en trois dimensions auto-organisation qui récapitulent les processus physiologiques dans la commodité d’un plat. La glande mammaire trouble trouble murine est composée de deux compartiments cellulaires épithéliaux distincts, servant différentes fonctions : le compartiment myoépitheléial externe et contractile et le compartiment luminal interne et sécréoire. Ici, nous décrivons une méthode par laquelle les cellules comprenant ces compartiments sont isolées et ensuite combinées pour étudier leurs contributions individuelles de lignée à la morphogenèse et à la différenciation de glande mammaire. La méthode est simple et efficace et ne nécessite pas de technologies de séparation sophistiquées telles que le tri des cellules activées par fluorescence. Au lieu de cela, nous récoltons et digérons enzymatiquement le tissu, ensemencent l’épithélium sur les plats de culture de tissu adhérents, puis employons la trypsinisation différentielle pour séparer le myoepithelial des cellules luminales avec la pureté de 90%. Les cellules sont ensuite plaquées dans une matrice extracellulaire où elles s’organisent en organoïdes bilayered, tridimensionnels (3D) qui peuvent être différenciés pour produire du lait après 10 jours dans la culture. Pour tester les effets des mutations génétiques, les cellules peuvent être récoltées à partir de modèles de souris de type sauvage ou génétiquement modifiés, ou elles peuvent être manipulées génétiquement avant la culture 3D. Cette technique peut être utilisée pour générer des organoïdes en mosaïque qui permettent l’étude de la fonction génique spécifiquement dans le compartiment luminal ou myoépélien.

Le protocole présenté ici décrit une méthode pour étudier les contributions spécifiques de lignée des cellules épithéliales mammaires en faisant usage des organoïdes de mosaïque. Pour obtenir les cellules murines primaires pour les organoïdes, l’épithélium de la glande mammaire doit d’abord être isolé du stroma riche en adipocytes environnant(figure 1). Ce processus est décrit brièvement ici et est également décrit dans une étude précédemment publiée<sup clas...

La glande mammaire est une structure bilayered, comprenant des cellules épithéliales myoépitheliales et internes intérieures. Présenté est un protocole pour préparer les organoïdes à l’aide de la trypsinisation différentielle. Cette méthode efficace permet aux chercheurs de manipuler séparément ces deux types de cellules pour explorer les questions concernant leurs rôles dans la forme et la fonction des glandes mammaires.

Génération d’organoïdes mammaires mosaïques par trypsinisation différentielle

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Notre méthode est significative parce qu’elle permet aux chercheurs d’isoler et de manipuler différents types de cellules pour l’étude de leurs contributions individuelles de lignée à la forme et à la fonction des tissus. Cette technique est une méthode douce et efficace pour séparer les types de cellules et, par conséquent, l’intégrité des cellules est préservée pour la culture 3D. Cette technique peut également être appliquée à d’autres systèmes pour isoler les cellules qui n’ont pas de biomarqueurs bien caractérisés.Pour récolter les glandes mammaires numéro deux, trois, quatre et cinq d’une souris femelle de 10 à 14 semaines, faites d’abord une incision d’un centimètre à la ligne médiane entre les deux limites postérieures. Étendre la coupe jusqu’au cou et faire de petites coupures latérales de l’incision médiane vers les membres. Puis étirer la peau enseignée avant de la fixer avec une épingle de chaque côté de l’animal.À l’aide de forceps, recueillir les ganglions lymphatiques à partir des glandes numéro quatre. Pour enlever les glandes mammaires, utilisez des ciseaux pointus pour couper sous chaque région de tissu, plaçant les tissus dans 50 millilitres de quatre degrés Cels

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Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Imagerie time-lapse est utilisé pour évaluer le comportement des principaux pré-néoplasiques des cellules épithéliales mammaires issues de modèles de souris génétiquement modifiées de risque de cancer du sein afin de déterminer s'il existe des corrélations entre certains paramètres comportementaux et génétiques distinctes des lésions.

Imagerie time-lapse de primaires prénéoplasiques cellules épithéliales mammaires issues de modèles de souris génétiquement modifiées de cancer du sein

Culture de cellules primaires en utilisant organites intacts de tissu fournit un système modèle qui imite le microenvironnement in vivo multicellulaire. Nous avons développé un modèle de culture primaire de tissu d'épithélium mammaire sans sérum qui perpétue mixtes lignées de culture cellulaire et des expositions morphologie différenciés, sans interruption de tissu enzymatique. organites mammaires restent viables pendant&gt; 6 mois.

Non enzymatique, sans sérum de culture de tissus de lésions mammaires pré-invasives pour la génération spontanée de mammospheres

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Transfert de la capacité de formation des glandes mammaires entre les cellules épithéliales basales mammaires et les cellules luminesnelles mammaires par des vésicules extracellulaires / des exosomes

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Génération d’organoïdes mammaires mosaïques par trypsinisation différentielle

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