Quantifier la taille du foie chez le poisson zèbre larvaire à l'aide de la microscopie Brightfield

Cette méthode permet de quantifier la taille du foie chez le poisson zèbre larvaire. Il permet également d’évaluer les effets de la manipulation génétique et pharmacologique sur la croissance et le développement du foie. Cette technique fournit un moyen rapide et précis de visualiser et de mesurer le foie ainsi que l’intestin et le pancréas.

En plus de quantifier la taille du foie, cette méthode de dissection peut être utile pour préparer le foie, l’intestin et le pancréas à l’hybridation in situ ou à l’imagerie confocale. Avant de tenter de désakinning sur les larves expérimentales, assurez-vous que vous avez passé suffisamment de temps à pratiquer sur des échantillons non expérimentaux et ont un taux de réussite significatif. Il est essentiel de visualiser l’orientation et le mouvement appropriés des larves et des forceps du poisson zèbre afin d’enlever la peau sans déranger les organes environnants.

À trois à sept jours après la fécondation, après avoir euthanasié les larves, utilisez une pipette en verre et une pompe pipette pour recueillir jusqu’à 15 larves dans un tube de deux millilitres. Laver les larves deux fois avec un millilitre de 1X PBS froid sur la glace. Retirez autant de PBS que possible à l’aide d’une pipette en verre et d’une pompe pipette et ajoutez un millilitre de PFA froid de quatre pour cent dans PBS.

Incuber à quatre degrés Celsius au moins toute la nuit avec un basculement doux. À l’aide d’une pipette en verre et d’une pompe à pipette, retirer le PFA du tube et rincer trois fois avec un millilitre de PBS froid. Faire basculer pendant cinq minutes entre les rinçages.

Pipette plusieurs larves dans PBS dans un puits de neuf puits plat en verre rond-fond. Au microscope, retirer la peau entourant le foie à l’aide de forceps fins pour tenir une larve sur le dos, saisissant de chaque côté de la tête aussi doucement que possible. Ensuite, utilisez des forceps très fins dans l’autre main pour saisir la peau juste au-dessus du cœur.

Tirez la peau vers le bas en diagonale vers la queue du poisson dans le fond du plat sur le côté gauche ou droit du poisson. Répétez l’répétition de l’autre côté. Continuer à saisir les volets de la peau et tirer vers le bas jusqu’à ce que toute la peau et les mélanophores trop ou près du foie ont été enlevés.

Si le jaune est présent pendant cinq à six jours après la fécondation des larves, soulevez le jaune en un seul morceau en tenant le poisson avec des forceps fins sur le dos et en utilisant les forceps très fins pour propulser doucement le jaune. Pour trois à quatre larves de DPF, maintenez le poisson avec de fines forceps sur le dos et utilisez les forceps très fins pour caresser le jaune à partir du côté ventral. Racler le jaune en morceaux.

Placer les larves disséquées dans un PBS frais et froid dans un tube de deux millilitres à l’aide d’une pipette en verre et d’une pompe à pipette. Pour monter les larves, versez quelques millilitres de méthylcellulose à trois pour cent sur le couvercle de la boîte de Pétri propre et en plastique. Utilisez une pipette en verre et une pompe pipette pour ajouter des larves à la méthylcellulose, en ajoutant le moins de PBS possible avec les larves.

Sous un microscope disséquant à faible grossissement, utilisez des forceps fins pour orienter les poissons afin qu’ils soient couchés sur leur côté droit face à gauche. Confirmez que le poisson à photographier est parfaitement aligné avec un œil directement sur le dessus de l’autre œil. Si la queue du poisson est pliée, retirez la queue en la pinçant avec force avec des pincements pour l’enlever de sorte que le poisson s’aplatit.

Zoomez sur le grossissement élevé et concentrez-vous sur le foie, en vous assurant que le contour du foie est clairement visible. Appuyez sur le bouton Capture Image pour prendre une photo et enregistrer le fichier. Répétez l’année pour tous les poissons, en vous assurant que le grossissement est le même pour chaque image.

Prenez une photo d’un micromètre à l’aide du même grossissement. Utiliser le programme R pour aveugler toutes les photos de foie afin d’éviter les biais potentiels des chercheurs et de promouvoir la rigueur scientifique, renommer les fichiers au hasard et créer un fichier de randomisation contenant une liste des noms de fichiers originaux et des noms de fichiers aveugles correspondants. Ouvrez les fichiers randomisés dans l’ordre, en commençant par le premier fichier.

Choisissez l’outil Sélections à main levée et décrivez chaque foie. Contrôle de presse-M pour mesurer la zone de chaque foie. Pour tous les foies qui ne peuvent pas être mesurés avec précision parce qu’ils ont la peau résiduelle, jaune, sont hors de discussion, ou ne sont pas intacts, insérer une mesure placeholder.

Enregistrez les mesures dans un fichier texte. Pour ne pas aveugler et analyser les données, ouvrez le fichier de mesures et le fichier de randomisation dans un programme de feuille de calcul. Insérez une nouvelle colonne dans le fichier de mesures et ajoutez les noms de fichiers originaux pour les fichiers aveuglés à l’aide du fichier Randomisation.

Enregistrez ce fichier sous forme de fichier Mesures non aveuglées. Trier les données par le nom du fichier d’origine. Exclure toute mesure du foie pour laquelle les images n’étaient pas adéquates.

Si nécessaire, convertir les valeurs de mesure en l’échelle désirée en millimètres carrés. Ouvrez la barre d’échelle dans le logiciel de traitement d’image. Utilisez l’outil Straight Line pour mesurer un millimètre sur la barre d’échelle.

Le logiciel de traitement d’image mesure alors dans les mêmes unités que les foies, donnant un facteur de conversion. Utilisez le facteur de conversion pour convertir les mesures dans le fichier Mesures non aveuglées. Déterminez l’écart moyen et type et calculez les valeurs P.

Six jours après la fécondation, les larves non transgéniques du poisson zèbre présentaient une position naturelle et une forme de foie qui survolait l’intestin. Le poisson zèbre transgénique a considérablement augmenté la taille du foie par rapport à ses frères et sœurs non transgéniques. Quelques exemples d’images et de micromètres inadéquats sont montrés ici.

Larve avec la peau couvrant le foie, larve avec le jaune obscurcissant le foie, larve avec des parties du foie pincées, et larve avec le foie disloqué et tombant, larve avec le foie manquant, larve avec le contour de foie qui est difficile à identifier, et larve avec le positionnement incorrect. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important d’utiliser de petits mouvements contrôlés pour prévenir les dommages au foie. En plus de la microscopie à champ lumineux, nous pouvons également utiliser des larves disséquées de cette façon, pour la microscopie confoccale, pour visualiser les protéines fluorescentes de reporter ou la coloration immuno-fluorescente, et pour l’hybridation in situ.

Le formaldéhyde ou PFA est un irritant et soupçonné cancérogène. Les gants doivent être portés lors de la manipulation de la PFA et les solutions concentrées doivent être manipulées dans un capot de fumée chimique.