Dépistage stratégique et caractérisation du complexe de signalisation des protéines VISUAL GPCR-mini-G pour une cristallisation réussie

La transduction du signal est l’un des sujets les plus importants de la recherche biologique et pharmaceutique. Il nécessite des protéines membranaires pour transmettre des signaux à leur protéine partenaire de signalisation intracellulaire. Ce protocole est conçu pour effectuer un criblage systématique des détergents en préparation d’un complexe de signalisation visant à déterminer la structure.

Ce protocole utilise des techniques couramment disponibles dans un laboratoire de biologie bien établi et être facilement exécuté par les débutants dans le domaine. Nous avons composé ces méthodes pour trouver le paramètre le plus critique dans la préparation du complexe protéique membranaire. Pour commencer, décongelez 30 grammes de granulés cellulaires déficients en HEK293 GNT I à température ambiante et transférez-les à un bécher.

Ajouter 120 millilitres de tampon PBS contenant un cocktail inhibiteur de la protéase et homogène à l’aide d’un homogénéiseur Dounce ou d’un homogénéiseur électrique à 13 000 RPM pendant 30 secondes. Réglez le volume à 150 millilitres avec tampon PBS. Ajouter délicatement 10% DDM aux cellules homogénéisées pour donner une concentration finale de 1,25%Remuer sur la glace pendant une heure.

Après solubilisation, centrifugeuse la cellule lysate à quatre degrés Celsius et 150.000 fois G pendant 45 minutes pour enlever les débris non solubles. Transférer le supernatant dans une bouteille de 500 millilitres et ajouter 10 millilitres de la résine d’agarose immuno-affinité de 50%1D4. Mélanger délicatement le lysate de cellules solubilisées et la résine pendant quatre heures ou toute la nuit à quatre degrés Celsius pour permettre la liaison protéique.

Chargez le mélange de résine de lysate sur une colonne ouverte pour recueillir la résine. Lavez la résine avec 10 volumes de colonne de tampon de lavage A pour éliminer le contaminant protéique. Fermez la valve et résuspendez la résine avec deux volumes de colonne de tampon A.Next, dans un état de faible lumière rouge, ajoutez 9 cis Retinal à la résine résuspendée à une concentration finale de 50 micromolaires.

Mélanger délicatement à quatre degrés Celsius pendant quatre à 16 heures dans l’obscurité pour la liaison rétinienne. Après cela, ouvrez la valeur et supprimez le tampon de la colonne. Laver la résine avec 20 volumes de colonnes de tampon A, suivi de 15 volumes de colonnes de tampon B pour éliminer retinal non lié.

Resuspendez la résine en deux volumes de colonne de tampon B, puis divisez également la suspension en résine à 10 colonnes d’élimination de 10 millilitres. Retirez le tampon des 10 colonnes, puis résuspendez la résine chacun en un millilitre de tampon C pour le changement de détergent. Incuber pendant une heure sur la glace.

Répétez le lavage et l’incubation dans le tampon C une fois de plus. Retirez le tampon des colonnes, puis resuspendez la résine en tampon d’élitution de 0,8 millilitres pour chaque colonne. Mélanger délicatement pendant deux heures.

Recueillir l’élitution de chaque colonne dans un tube. Resuspendez la résine en tampon d’élitution de 0,7 millilitres pour chaque colonne. Mélanger délicatement pendant une heure.

Recueillir l’élitution de chaque colonne dans les mêmes tubes. Dans l’obscurité, chargez la protéine échappée à la cuvette de quartz. Mesurer le spectre de l’échantillon de protéines.

Illuminez la protéine directement dans la cuvette pendant deux minutes avec un passage léger à travers le filtre de passage de 495 nanomètres de long. Mesurer le spectre de l’échantillon éclairé. Effectuez la même mesure pour tous les échantillons de protéines purifiés dans les neuf autres détergents.

États sombres et illuminés. Sous la lumière normale, pour chaque état de détergent préparer 100 microlitres de rhodopsine à 0,7 milligramme par millilitre. Sous une faible lumière rouge, préparer 100 microlitres de mélange de rhodopsine à 0,7 milligramme par millilitre et mini-GO à 0,2 milligramme par millilitre.

Compléter le mélange avec un chlorure de magnésium millimolaire. Illuminez le mélange avec la lumière d’un filtre de passage long de 495 nanomètres et incubez pendant 30 minutes. Transférez les échantillons sur les flacons de l’échantillonneur automatique et placez-les dans le bac d’échantillonnage.

Programmez un fichier de méthode pour automatiser les courses séquentielles de la SEC pour chaque échantillon avec l’échantillonneur automatique chargeant 77 microlitres de l’échantillon à la colonne et le purificateur échappant à 25 millilitres de tampon SEC par course. Enregistrez l’absorption à 280 nanomètres et 380 nanomètres. Recueillir les fractions de pointe de rhodopsine et rhodopsine-mini-GO complexe au volume de rétention autour de 12,9 millilitres.

Analyser les échantillons de rhodopsine gauche et les fractions de pointe du complexe rhodopsine-mini-GO sur des gels de gradient de dénaturation SDS à 4 à 12 %, avec coloration bleue Coomassie. Préparer un mélange de 200 microlitres de rhodopsine à un milligramme par millilitre et de PNGase F à 0,01 milligramme par millilitre. Bien mélanger et incuber sur la glace toute la nuit.

Préparer un mélange de 200 microlitres de rhodopsine à un milligramme par millilitre et Endo F1-13 à 0,01 milligramme par millilitre. Bien mélanger et incuber sur la glace toute la nuit. Analyser le résultat de digestion par SDS-Page et Coomassie taches bleues.

Dans cette étude, la configuration de purification à petite échelle a donné suffisamment de protéines pour d’autres analyses. Les spectres visibles ultraviolets de rhodopsine montrent l’état foncé 9-cis Rhodopsin lié rétinien dans les courbes bleues. Après l’illumination, 9-cis Retinal est déprotéiné et isomérise dans tous les trans-Retinal.

Les ratios d’absorbants à 280 nanomètres sur absorbants 488 nanomètres et absorbants à 280 nanomètres sur absorbants à 380 nanomètres représentent la stabilité de la rhodopsine purifiée dans chaque détergent. Des profils chromatography d’exclusion de taille de rhodopsine et de rhodopsine-mini-GO complexe purifié dans 10 détergents différents sont montrés ici. Le profil des protéines marqueur standard est indiqué comme superposition avec l’échantillon DDM.

L’interprétation des profils de pointe est montrée pour DMNG avec le scénario idéal vu pour DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5, et OGNG. Le profil grossi de l’échantillon OGNG montre à la fois rhodopsine et rhodopsine-mini-GO complexe échappé autour du même volume de rétention. L’analyse SDS-Page de rhodopsine et sec échantillons purifiés de rhodopsine-mini-GO complexe est montré ici.

Ce chiffre montre l’analyse SDS-Page de la déglycosylation rhodopsine avec les enzymes Endo F1 et PNGase F. Il est essentiel d’effectuer le criblage systématique du détergent, de sorte que l’impact de chaque détergent individuel puisse être clairement comparé sans ambiguïté. Pour les protéines de diverses quantités, l’analyse de décalage thermique peut également être utilisée pour étudier l’impact du détergent sur la stabilité des protéines.

Grâce à cette méthode, nous sommes en mesure de préparer un complexe protéique stable et éventuellement de résoudre la structure cristalline perdue en géo-assemblage. Il a fourni des informations importantes sur la spécificité d’interaction des protéines GPCR-G.