Name: Évaluation de la fonction de mémoire chez les souris épileptiques induites par pilocarpine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Découvrez un protocole pour évaluer les troubles de la mémoire chez des souris épileptiques induites par pilocarpine. Ces tests comportementaux non invasifs permettent d'étudier le déclin cognitif associé à l'épilepsie.

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Nous remercions le Dr Jae-Min Lee pour son soutien technique. Ces travaux ont été soutenus par les subventions de la National Research Foundation of Korea (NRF) financées par le gouvernement coréen (NRF-2019R1A2C1003958, NRF-2019K2A9A2A08000167).

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce travail décrit des procédures expérimentales pour évaluer la fonction cognitive chez les souris atteintes d’épilepsie chronique. Beaucoup de paradigmes différents de test comportemental sont employés pour évaluer l’apprentissage et les fonctions de mémoire chez les souris18. Le labyrinthe d’eau Morris, le labyrinthe de bras radial, le labyrinthe Y, le conditionnement contextuel de la peur et les essais basés sur des objets sont les tests comportementaux les plus fréquemment utilisés et fourniss...

L’épilepsie est un trouble chronique caractérisé par des crises récurrentes spontanées1,2,3. Parce que les crises répétitives peuvent causer des anomalies structurelles et fonctionnelles dans le cerveau1,2,3, l’activité de crise anormale peut contribuer au dysfonctionnement cognitif, qui est l’une des comorbidités les plus communes associées à l’épilepsie4,5,6. Contrairement aux événements chroniques de saisie, qui sont transitoires et momentanés, les affaiblissements cognitifs peuvent persister tout au long de la vie des patients épileptiques, détériorant leur qualité de vie. Par conséquent, il est important de comprendre les mécanismes pathophysiologic du déclin cognitif associé à l’épilepsie.
Divers modèles animaux expérimentaux de l’épilepsie ont été utilisés pour démontrer les déficits d’apprentissage et de mémoire associés à l’épilepsie chronique7,8,9,10,11,12. Par exemple, le labyrinthe d’eau de Morris, le conditionnement contextuel de la peur, le tableau de trou, l’emplacement d’un objet nouveau (NL) et les tests de reconnaissance d’objets nouveaux (NO) ont souvent été utilisés pour évaluer le dysfonctionnement de la mémoire dans l’épilepsie du lobe temporel (TLE). Parce que l’hippocampe est l’une des régions primaires dans lesquelles TLE montre la pathologie, les tests comportementaux qui peuvent évaluer la fonction de mémoire dépendante de l’hippocampe sont souvent sélectionnés de préférence. Cependant, étant donné que les saisies peuvent induire la neurogenèse hippocampique aberrante et contribuer au déclin cognitif associé à l’épilepsie10, paradigmes comportementaux pour tester la fonction neuronale néonatale dentate (c.-à-d., séparation de modèle spatial, PS)8,13 peuvent également fournir des informations valables sur les mécanismes cellulaires des affaiblissements de mémoire dans l’épilepsie.
Dans cet article, nous démontrons une batterie de tests de mémoire, NL, NO, et PS, pour les souris épileptiques. Les tests sont simples et facilement accessibles et ne nécessitent pas un système sophistiqué.

<table><tbody><tr><td>Seringue de 1 ml</td><td>Sung-shim</td><td></td> À <td>utiliser avec l’aiguille de calibre 26 ou 30</td></tr><tr><td>Éthanol 70 %</td><td>Duksan</td><td>UN1170</td><td>Spray pour nettoyer la boîte et les objets</td></tr><tr><td>rideau</td><td></td><td></td> noir <td>Pour éviter les repères visuels inutiles</td></tr><tr><td>Cresyl violet</td><td>Sigma</td><td>C5042</td><td>Pour le colorage du violet Cresyl</td></tr><tr><td>cryotome</td><td>Leica</td><td>E21040041</td><td>Pour les tissus sectionnement</td></tr><tr><td>ruban adhésif</td><td></td><td></td> double face <td>Pour le placement ferme des objets</td></tr><tr><td>Support de montage DPX</td><td>Sigma</td><td>06522</td><td></td></tr><tr><td>série éthanol</td><td>Duksan</td><td>UN1170</td><td>Make 100 %, 95 %, 90 %, 80 %, 70 % ethanol solutions</td></tr><tr><td>plaque de sol avec des motifs de grille étroits</td><td>Leehyo-bio</td><td></td><td>Équipement d’expérimentation comportementale, taille de la plaque : 42,5 x 42,5 x 0,5 cm, taille de la grille : 2,75 x Plaque de sol de 2,75 cm</td></tr><tr><td>avec de larges motifs de grille</td><td>Leehyo-bio</td><td></td><td>Équipement d’expérimentation comportementale, taille de la plaque : 42,5 x 42,5 x 0,5 cm, taille de la grille : 5,5 x 5,5 cm</td></tr><tr><td>illuminomètre</td><td>TES Electrical Electronic Corp.</td><td>1334A</td><td>Pour la mesure de l’éclairage de la pièce (60 Lux)</td></tr><tr><td>Unité de soins intensifs</td><td>Thermocare</td><td>#W-1</td><td></td></tr><tr><td>chlorhydrate de kétamine</td><td>Yuhan</td><td>7003</td><td>Utilisation pour anesthésier la souris pour la perfusion transcardique</td></tr><tr><td>Lampe LED</td><td>Lungo</td><td>P13A-0422-WW-04</td><td>Éclairage pour les objets</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>de la salle d’essai comportementalPoupée en caoutchouc, tube en plastique de 50 ml, pot Coplin en verre, flacon en T en plastique, bouteille en verre</td></tr><tr><td>boîte à champ ouvert</td><td>Leehyo-bio</td><td></td><td>Matériel d’expérience comportementale, taille : 44 x 44 x 31 cm</td></tr><tr><td>essuie-tout</td><td>Yuhan-Kimberly</td><td>47201</td><td>Utiliser pour sécher la boîte en champ ouvert et les objets</td></tr><tr><td>paraformaldéhyde</td><td>Merck Millipore</td><td>104005</td><td>Fabriquer une solution à 4 %</td></tr><tr><td>chlorhydrate de pilocarpine</td><td>Sigma</td><td>P6503</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> règle <td>Utiliser pour localiser les objets dans la boîte à champ ouvert</td></tr><tr><td>scopolamine méthyle nitrate</td><td>Sigma</td><td>S2250</td><td>Make 10X stock</td></tr><tr><td>Système intelligent 3.0</td><td>Panlab</td><td></td><td>Système de suivi vidéo</td></tr><tr><td>chronomètre</td><td>Junso</td><td>JS-307</td><td>Pour la mesure des activités exploratoires des souris</td></tr><tr><td>saccharose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td>Pour la cryoprotection de coupes de tissus sel d’hémisulfate de</td></tr><tr><td>terbutaline</td><td>Sigma</td><td>T2528</td> Fabriquer une caméra vidéo <td>10X</td></tr><tr><td>(caméra CCD)</td><td>Vision</td><td>VCE56HQ-12</td><td>Placez la caméra directement au-dessus de la boîte à champ ouvert</td></tr><tr><td>xylazine (Rompun)</td><td>Bayer korea</td><td>KR10381</td><td>Utiliser pour anesthésier la souris pour la perfusion transcardique</td></tr><tr><td>xylène</td><td>Duksan</td><td>UN1307</td><td>Pour Coloration au violet de crésyle</td></tr></tbody></table>

Évaluation de la fonction de mémoire chez les souris épileptiques induites par pilocarpine

Assessment of Memory Function in Pilocarpine-induced Epileptic Mice

L’affaiblissement cognitif est l’une des comorbidités les plus communes dans l’épilepsie de lobe temporel. Pour récapituler le déclin cognitif associé à l’épilepsie dans un modèle animal d’épilepsie, nous avons généré des souris épileptiques chroniques traitées par pilocarpine. Nous présentons un protocole pour trois tests comportementaux différents à l’aide de ces souris épileptiques : l’emplacement des objets nouveaux (NL), la reconnaissance d’objets nouveaux (NO), et les tests de séparation des motifs (PS) pour évaluer l’apprentissage et la mémoire des lieux, des objets et des contextes, respectivement. Nous expliquons comment définir l’appareil comportemental et fournir des procédures expérimentales pour les tests NL, NO et PS à la suite d’un essai en terrain ouvert qui mesure les activités locomotrices basales des animaux. Nous décrivons également les avantages techniques des essais de NL, de NO, et de PS en ce qui concerne d’autres essais comportementaux pour évaluer la fonction de mémoire chez les souris épileptiques. Enfin, nous discutons des causes et des solutions possibles pour les souris épileptiques ne parviennent pas à faire 30 s de bon contact avec les objets au cours des séances de familiarisation, qui est une étape critique pour les tests de mémoire réussies. Ainsi, ce protocole fournit des informations détaillées sur la façon d’évaluer les troubles de la mémoire associés à l’épilepsie à l’aide de souris. Les tests NL, NO et PS sont des essais simples et efficaces qui sont appropriés pour l’évaluation de différents types de mémoire chez les souris épileptiques.

Un calendrier expérimental général et la configuration pour évaluer la fonction cognitive sont indiqués dans la figure 1. Six semaines après l’introduction de crises aigues induites par la pilocarpine, les souris ont été soumises aux tests NL, NO et PS dans cet ordre séparé par des périodes de repos de 3 jours entre les tests(figure 1A). Pour le test de NL, deux objets identiques ont été placés dans le champ ouvert pendant la session de familiarisation (F1), et ...

Cet article présente des procédures expérimentales pour évaluer des affaiblissements de mémoire dans les souris épileptiques pilocarpine-induites. Ce protocole peut être utilisé pour étudier les mécanismes pathophysiologic du déclin cognitif associé à l’épilepsie, qui est l’une des comorbidités les plus courantes dans l’épilepsie.

Cognitive impairment is one of the most common comorbidities in temporal lobe epilepsy. To recapitulate epilepsy-associated cognitive decline in an animal ...

L’affaiblissement cognitif est l’une des comorbidités les plus communes dans l’épilepsie de lobe temporel. Nous présenterons un protocole décrivant comment évaluer l’affaiblissement de mémoire utilisant un modèle de souris de l’épilepsie chronique. L’emplacement de l’objet nouveau, la reconnaissance d’objets nouveaux et le test de séparation des motifs sont des as simples et courts qui peuvent mettre au minimum l’accent sur les animaux.Il rend ce test optimal pour évaluer la fonction de mémoire chez les souris épileptiques, sans déclencheurs supplémentaires pour des crises récurrentes spontanées. Pour commencer, acclimater les animaux à la faible lumière dans leurs cages d’origine, pendant au moins 30 minutes. Préparez une boîte ouverte.Le premier jour de l’accoutumation, placez et illuminomètrez au centre de la boîte à champ ouvert. Et ajuster l’éclairage à 60 Lux. Pour évaluer l’activité locomotrice de chaque souris, utilisez un logiciel de suivi vidéo sur le comportement animal.Une fois le logiciel de suivi vidéo ouvert, calibrez la taille de la boîte ouverte. Placez ensuite délicatement une souris expérimentale dans la boîte à champ ouvert face au mur. Ouvrez le programme Smart, cliquez sur Personnalisé et Acceptez.Cliquez sur Source d’image. Après avoir sélectionné l’appareil photo installé, appuyez sur le bouton Définir. Ajustez la résolution de la caméra et appuyez sur, Acceptez.Après notre clic d’étalonnage, faites glisser la souris de l’ordinateur pour s’adapter à la taille de la boîte. Et remplissez la taille de la boîte intérieure. Cliquez sur Définition de zone pour enregistrer et ajuster chaque taille de boîte, puis cliquez sur Enregistrer.La boîte rouge est la gamme suivie, de sorte qu’il s’intègre dans la taille de la boîte intérieure, tandis que la boîte rose s’adapte au contour. Réglage de détection de presse. Cliquez sur Instantané, et appuyez sur Démarrer le test, pour vérifier si une zone spécifique est suivie, puis prés arrêter le test, puis accepter.Cliquez sur Paramètres de temps. Après avoir sélectionné l’heure prédéfinie, réglez le temps de latence, à trois secondes de temps d’acquisition à 15 minutes et appuyez sur Accepter. Appuyez sur Sujets pour définir le nom de code.Cliquez sur Scheduler, pour supprimer les détails existants et faire glisser le nom de code modifié dans les sujets à la première session. Cliquez sur l’acquisition de données. Cliquez sur le bouton Enregistrer et cliquez sur Démarrer.Mettez la souris dans la boîte et suivez-la pendant 15 minutes. Après 15 minutes d’enregistrement, retourner la souris dans sa cage d’origine. Restaurer la lumière vive.Cliquez sur Acquisition de données. Et puis cliquez sur Active Analysis Drag nom de code Sham à la fenêtre à côté de lui. Cliquez sur le bouton Définitions de rapport.Cliquez sur le bouton Nouvelles définitions de rapport puis rapport sommaire et appuyez sur Accepter. Cliquez sur Nom du sujet et distance dans la zone, et l’envoyer sur le côté. Appuyez ensuite sur le bouton Accepter.Cliquez sur la marque de contrôle rouge et cliquez sur Analyser. Vérifiez les résultats. Le deuxième jour et le troisième jour, répétez les séances d’accoutumabilité.Le quatrième jour effectuer la session de familiarisation. Dans la faible lumière, placez chaque souris dans le champ ouvert vide pendant trois minutes. Après cette brève accoutumée, retournez l’animal dans sa cage d’origine.Placez deux objets identiques, des poupées en caoutchouc, dans l’arène en plein champ, à cinq centimètres des murs adjacents. Fixez les objets avec du ruban adhésif à double face. Introduisez la souris expérimentale dans la boîte à champ ouvert face au mur le plus éloigné des objets.Prévoyez une exploration gratuite pendant 20 minutes et mesurez manuellement le temps passé à explorer les deux objets à l’aide de deux chronomètres. Ne pas quantifier comme temps exploratoire, tous les comportements, dans lequel le museau animal ne pointe pas vers l’objet. Une fois que la souris atteint le temps minimum d’exploration de 30 secondes, pour les deux objets, arrêtez la session F1 et transférez la souris dans sa cage d’origine.Si la souris ne parvient pas à explorer les objets pendant 30 secondes dans les 20 minutes, retirez la souris de la boîte ouverte et excluez-la des sessions supplémentaires. Le cinquième jour, effectuez la nouvelle session de test de localisation d’objets. Transférer la souris dans la zone ouverte pour la réhabiliter pendant trois minutes.Puis retournez-le dans sa cage. Déplacez un objet vers la position diagonale et placez la souris expérimentale face au mur de la boîte à champ ouvert. Prévoyez 10 minutes d’exploration et d’enregistrement gratuits avec un système de suivi vidéo.Mesurez, le temps passé à explorer chaque objet, à l’aide de deux chronomètres. Ensuite, transférez la souris dans sa cage d’origine, en saisissant la queue. Pendant trois jours, laissez la souris reposer avec un accès gratuit à la nourriture et à l’eau.Le neuvième jour effectuer une séance d’accoutumabilité de 15 minutes, pour une souris. Le jour 10 effectuer la brève session de réhabituation, pendant trois minutes. Puis retournez-le temporairement dans sa cage d’origine.Placez deux objets identiques, des tubes en plastique de 50 millilitres remplis de 40 millilitres d’eau, en plein champ, à cinq centimètres des murs adjacents. Introduisez la souris expérimentale dans la boîte à champ ouvert, face au mur le plus éloigné des objets. Comme la souris sera exposée aux deux objets différents dans le test NO, un tube en plastique de 50 millilitres rempli de 40 millilitres d’eau, et un pot en verre pots Coplin.Contrebalancer l’objet lors de la séance de familiarisation, en présentant deux objets identiques, des pots coplin en verre, pour la moitié des animaux du groupe. Ensuite, avec deux objets différents, permettre l’exploration gratuite pendant 20 minutes et mesurer manuellement le temps passé à explorer les deux objets à l’aide de deux chronomètres. Une fois que la souris atteint le temps d’expiration minimum de 30 secondes pour les deux objets, arrêtez la session de familiarisation.Le lendemain, effectuez la nouvelle session de test de reconnaissance d’objets. Tout d’abord, transférez la souris sur le champ ouvert pour la réhabituation, pendant trois minutes, puis retournez-la dans sa cage d’origine. À cinq centimètres des murs adjacents, remplacez le tube par un bocal en verre coplin jars, de sorte que les souris sont exposées à un tube et un bocal en verre coplin pots.Pour la moitié des animaux qui ont été exposés à des pots en verre Coplin pots au cours de la première séance de familiarisation, remplacer le pot en verre pots Coplin par un tube en plastique de 50 millilitres rempli de 40 millilitres d’eau. De sorte que les souris sont exposées à un tube et un bocal en verre coplin pots. Prévoyez 10 minutes d’exploration gratuite tout en l’enregistrant à l’aide d’un système de suivi vidéo.Ensuite, prenez la queue de la souris expérimentale, et le transférer dans sa cage d’origine. Pendant trois jours et laissez reposer la souris avec un accès gratuit à la nourriture et à l’eau. Pour l’analyse NL, ouvrez le programme Démarrer personnalisé et acceptez.Cliquez sur Source d’image. Après avoir sélectionné l’appareil photo installé, appuyez sur le bouton Définir. Juste la résolution de la caméra et appuyez sur Accepter.Cliquez sur Ouvrir les vidéos Bouton Dossier pour ouvrir la vidéo enregistrée. Regardez la vidéo enregistrée pendant 10 minutes à partir du moment où la souris entre et mesurez le temps passé à explorer chaque objet. Le jour 15 a d’abord effectué la première session de familiarisation pour le test PS.C’est pour la souris à la zone de champ ouvert pour la réhabituation, pendant trois minutes. Placez la plaque de plancher avec la grille large, et deux objets identiques. Flacons en T en plastique remplis de 50 millilitres d’eau, dans la boîte à champ ouvert.Puis introduit la souris expérimentale dans la boîte à champ ouvert face au mur le plus éloigné des objets. Prévoyez une exploration gratuite pendant 20 minutes. Et mesurez manuellement le temps passé à explorer les deux objets à l’aide de deux chronomètres.Une fois que la souris atteint le temps minimum d’exploration de 30 secondes pour les deux objets, arrêtez la première séance de familiarisation et transférez l’animal dans sa cage d’origine. Pour contrebalancer l’objet et le test de séparation des motifs pour la moitié des animaux placer la plaque de plancher avec la grille large et deux objets identiques, bouteilles en verre pour l’expérience d’équilibrage compteur dans la boîte à champ ouvert. Ensuite, introduisez la souris expérimentale dans la boîte en plein champ et laissez l’exploration libre pendant 20 minutes.Une fois que la souris atteint le temps minimum d’exploration de 30 secondes pour les deux objets, arrêtez la première séance de familiarisation et transférez l’animal dans sa cage d’origine. Le lendemain, transférez la souris sur le terrain pour une réhabituation pendant trois minutes. Et puis le retourner à sa cage d’origine.Ensuite, effectuez la deuxième séance de familiarisation avec deux bouteilles en verre sur le plancher étroit de la grille. Pour les expériences de contrepoids, effectuez la deuxième séance de familiarisation avec deux flacons en T remplis d’eau sur un plancher de grille étroit. Le lendemain, effectuez la session de test de séparation des motifs.Transférez la souris dans la zone ouverte sans objet pour la réhabituation pendant trois minutes. Et puis le retourner à sa cage d’origine. Ensuite, placez le t-flacon rempli d’eau et une bouteille en verre sur le plancher étroit de la grille.Faire les flacons en T remplis d’eau, dans un objet nouveau. Pour contrebalancer les expériences, placez chaque objet sur le plancher étroit de la grille pour faire de la bouteille en verre un objet nouveau dans ce cas. Ensuite, pour la souris expérimentale à la zone en plein champ pendant 10 minutes à explorer.Prévoyez 10 minutes d’exploration et d’enregistrement gratuits à l’aide d’un système de suivi vidéo. Prenez la queue de la souris expérimentale et transférez-la dans sa cage d’origine. Mesurez le temps passé à explorer chaque objet à l’aide de deux chronomètres.Et calculer le rapport de discrimination égalant la différence de temps passé entre l’objet roman et l’objet familier divisé par le temps total d’exploration des deux objets. Six semaines après l’introduction des saisies aiguës induites de pilocarpine. Les souris seront soumises au nouveau test de localisation de l’objet.Nouveau test de reconnaissance d’objets et test de séparation de motifs. Dans cet ordre séparé par trois jours de repos entre les tests. Il a été confirmé qu’il n’y avait pas de préférence significative entre les deux objets présentés ensemble.Les souris épileptiques ont montré une réduction significative, du ratio de discrimination dans les trois tests par rapport aux contrôles Sham. Démontrer l’affaiblissement de mémoire spatiale. La mesure de l’activité locomotrice, a montré une augmentation significative des animaux épileptiques.Alors que la motivation d’explorer les objets était comparable entre Sham et les animaux épileptiques. Enfin la mort hippocampal de cellules a été évaluée après un epilepticus induit par pilocarpine utilisant la coloration violette cristalline pour confirmer les dommages neuronaux induits par saisie. Les animaux traités par pilocarpine ont démontré aux cellules pyknotiques dans le sous-champ ca3 et ca3 de l’hippocampe, contrairement aux contrôles de Sham.Comptez dans le test NO et PS est essentiel pour réduire les biais inhérents possibles dans cet appareil objets spécifiques. En outre, les souris épileptiques chroniques ouvertes montrent une anxiété accrue, ce qui nécessite de multiples étapes d’accoutumation pour une nation suffisamment acclamée vers les milieux expérimentaux. les modifications du temps telles que le nombre ou l’emplacement des objets dans notre protocole peuvent fournir les tests de mémoire.Ce qui peut être utile pour élaborer des mécanismes complexes de l’épilepsie associés au déclin cognitif. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer différents aspects de l’affaiblissement de la mémoire dans l’épilepsie.

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