Name: Croissance des couches cellulaires endothéliales coréennes humaines et brebis sur les membranes biomatériaux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Découvrez la culture de cellules endothéliales cornéennes humaines et ovines sur biomatériaux. Cette méthode préserve le phénotype endothélial et évite la transition épithélio-mésenchymateuse pour la médecine régénérative.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Merci à Noémie Gallorini pour son aide lors de la préparation de la Figure 7. Ces travaux ont été soutenus par une subvention de projet accordée à La DH par le National Health and Medical Research Council of Australia (Project Grant 1099922), et par un financement supplémentaire reçu de la Queensland Eye Institute Foundation.

Des cornées humaines avec le consentement des donateurs pour la recherche ont été obtenues de la Queensland Eye Bank et utilisées avec l’approbation éthique du Comité d’éthique de la recherche humaine du Metro South Hospital and Health Service (HREC/07/QPAH/048). Des cornées de mouton ont été obtenues des animaux euthanasiés au centre médical de recherche de Herston de l’université du Queensland en vertu d’un accord de partage de tissu.
1. Préparation d’outils de dissection
<ol><li>Stérilisez deux paires de forceps d’horloger numéro 4 en les trempant dans une solution de 70% d’éthanol pendant 5 min ou en les autoclantant.</li>
</ol>2. Préparation des plaques de culture moyenne et de culture tissulaire
<ol><li>Préparer 100 ml de milieu de culture contenant opti-MEM 1 (1x) - GlutaMAX-1, 5% de sérum bovin fœtal et 100 U/mL Pen/Strep. Ce milieu de culture est adéquat pour les cultures endothéliales endothéliales de cornée de mouton, cependant, pour les cultures endothéliales endothéliales cornées humaines le milieu devrait être complété avec l’extrait pituitaire bovin de 50 g/mL, 0.08% de sulfate de chondroitin, 200 'g/mL de chlorure de calcium et 0.3 mM d’acide l’ascorbique 2-phosphate. Le milieu de culture peut être stocké dans l’obscurité à 4 oC pendant deux semaines.</li>
	<li>Enrober les puits d’une plaque de culture de tissu de 6 puits avec le facteur d’attachement en utilisant les instructions du fabricant et puis ajouter 1 ml de milieu de culture à chaque bien enduit. Préparer un puits pour chaque cornée.</li>
</ol>3. Dissection d’explantation et procédure de culture cellulaire
<ol><li>Placer la cornée, côté endothélium vers le haut, dans un plat stérile Petri sur la scène d’un microscope disséquant. Ajuster l’éclairage de façon à ce que la surface cornéenne soit bien éclairée avec un contraste suffisant pour mettre en évidence la couche endothéliale. Ajustez le zoom de sorte que le bord et un peu d’endothélium cornéen central est en vue.</li>
	<li>Utilisez des forceps d’horloger stérilisés pour soulever et déchirer doucement la membrane de Descemet du stroma sous-jacent (Figure 1). La membrane se détachera du stroma comme une bande qui se recroqueville immédiatement. Placez la bande dans un puits d’une plaque de culture de tissu de 6 puits qui a été enduite avec le facteur d’attachement et contient 1 ml de milieu de culture. Le couvercle de la plaque de culture tissulaire doit être maintenu en tout temps, sauf lorsque des explants y sont ajoutés, afin de réduire le risque de contamination.</li>
	<li>Enlever les bandes de la membrane de Descemet de la périphérie extrême de l’endothélium d’abord, puis des régions centrales plus tard. Placer toutes les bandes d’une cornée dans un seul puits dans la plaque de 6 puits.</li>
	<li>Incuber les explants dans un incubateur de culture cellulaire humidifié fixé à 5% CO2 et 37 oC. Laissez la culture intacte pendant 2 jours pour permettre aux explants de se déposer et de s’attacher à la surface de la plaque. En règle générale, jusqu’à un tiers des explants ne se fixent pas à la plaque.</li>
	<li>Retirer le milieu et les explants non attachés de la culture après 4 jours et ajouter doucement 2 ml de milieu de culture frais en prenant soin de ne pas déranger les explants attachés. Le média culturel doit être modifié deux fois par semaine.</li>
</ol>4. Production continue de cellules endothéliales cornéennes par culture d’explantation en série
REMARQUE : Les plantes peuvent être transférées dans des plaques de culture de tissus frais après 10 jours afin d’établir d’autres cultures endothéliales endothéliales cornéennes.
<ol><li>Placez la culture d’explantation sur le stade d’un microscope disséquant et ajustez l’éclairage et le zoom de sorte que les explants soient visibles.</li>
	<li>À l’aide de forceps d’horloger stérilisés, arracher délicatement chaque explante de sa plaque de culture et la transférer dans un puits frais d’une plaque de culture de 6 puits qui a été recouverte d’un facteur d’attachement et contient 1 ml de milieu de culture.</li>
	<li>Laisser les explants s’installer sur la surface de leur nouvelle assiette pendant 4 jours avant de remplacer le milieu de culture par 2 ml de milieu de culture frais. Le milieu de la culture du changement a changé deux fois par semaine.</li>
</ol>5. Cultiver des cellules endothéliales cornéennes sur des couvertures en verre pour des analyses d’immunofluorescence
REMARQUE : Les cultures cellulaires qui sont destinées à être analysées à l’aide de l’immunofluorescence doivent être établies sur des couvercles en verre qui peuvent être montés sur des lames de microscope en verre suivant la procédure de coloration.
<ol><li>Stériliser un paquet de couvercles en verre rond de 13 mm de diamètre dans un autoclave ou en trempant à 70 % d’éthanol pendant 15 min, suivi de trois rinçants en salin tamponné par phosphate (PBS).</li>
	<li>Placez les couvertures individuelles dans les puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits, enrobez-les d’un facteur d’attachement, puis ajoutez 0,5 ml de milieu de culture à chaque puits.</li>
	<li>À l’aide de forceps horrisés, les explants retirent les explants de leurs plaques de culture tissulaire et les transfèrent dans des puits contenant des plaques de couverture. Laisser les explants s’installer sur les couvertures pendant 4 jours avant de changer le milieu.</li>
	<li>Après la période d’incubation requise, fixer et tacher les cultures de couverture dans leurs puits de culture. Montez les couvercles tachés sur des lames de microscope en verre pour les analyser au microscope à fluorescence.</li>
</ol>6. Sous-culture des cellules endothéliales cornéennes utilisant Dispase II
REMARQUE : Les grandes cellules fibroblastiques peuvent être sélectivement enlevées des cultures d’explantation dans les plaques de 6 puits avant de subculper utilisant cette procédure. Si toutes les cellules doivent être sous-cultivées, n’effectuez pas les étapes 6.2 à 6.4. Le but de cette procédure est de transférer les cellules dans des plaques fraîches tout en maintenant leurs contacts de cellule à cellule autant que possible. Les cellules doivent être manipulées en douceur. Les puits complètement confluents doivent être passages à un rapport de 1:2, tandis que les puits subconfluents doivent être passages à un rapport de 1:1 ou moins.
<ol><li>Retirez le milieu de la culture et rincez brièvement avec DPBS.</li>
	<li>Ajouter 1 ml de verse. Incuber à température ambiante pendant 30 s.</li>
	<li>Retirer le versene et ajouter 1 ml de TrypLE. Incuber à 37 oC dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 3 min.</li>
	<li>Observez la culture à l’aide d’un microscope à contraste de phase. Appuyez doucement sur la culture pour déloger les cellules de la plaque. Dès que les grandes cellules fibroblastiques se sont détachées de la plaque, retirez-les et le TrypLE à l’aide d’une pipette de 1 ml. Laver trypLE résiduel des cellules restantes en rinçant deux fois avec 2 ml de DPBS.</li>
	<li>Ajouter 1 ml de 1 mg/mL de dispase II à la culture et incuber dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 1 à 2 h ou jusqu’à ce que toutes les cellules se soient détachées de la plaque. Les cellules doivent progressivement flotter loin de la plaque en touffes.</li>
	<li>Recueillir les cellules à l’aide d’une pipette de 1 ml et transférer à 20 ml de DPBS dans un tube de centrifugeuse de 50 ml. Centrifugeuse de 5 min à 300 x g à température ambiante.</li>
	<li>Retirer le supernatant et resuspendre doucement le granule cellulaire par trituration avec une pipette de 1 ml dans 1 ml de milieu de culture. Transférer la suspension cellulaire à un ou deux puits d’une plaque de 6 puits, au passage à un ratio de 1:1 ou 1:2 respectivement.</li>
	<li>Rehaussez le milieu dans chaque puits pour faire 2 ml et placez les cultures dans l’incubateur de culture tissulaire. Remplacer le milieu par 2 ml de milieu frais deux fois par semaine.</li>
</ol>7. Croissance des couches de cellules endothéliales cornéennes sur les membranes biomatériaux
REMARQUE : La procédure suivante décrit les étapes impliquées dans le montage d’un biomatériau membranaire dans un dispositif de montage sur mesure, appelé chambre micro-Boyden, pour la culture cellulaire. Veuillez consulter notre publication récente6 pour plus d’informations sur l’appareil et pour l’achat de détails.
<ol><li>Assembler la chambre supérieure de la chambre micro-Boyden en plaçant un anneau O rouge en son centre.</li>
	<li>Utilisez une trephine de 18 mm de diamètre pour percer un disque d’une feuille de biomatériau sur une planche à découper en polytétrafluoroéthylène (PTFE). Placez ce disque sur l’anneau O rouge dans la chambre haute de la chambre micro-Boyden.</li>
	<li>Visser la chambre inférieure sur la chambre supérieure, en fixant le disque de biomatériau entre les deux.</li>
	<li>Faire tremper la chambre micro-Boyden assemblée dans 70% d’éthanol pendant 1 h pour la stériliser.</li>
	<li>Immerger complètement la chambre micro-Boyden assemblée dans le HBSS stérile pendant 10 min pour enlever l’éthanol. Répétez cette étape de lavage deux fois. Effectuer une dernière étape de lavage pendant 10 min dans un milieu de culture non complété.</li>
	<li>Transférer la chambre micro-Boyden stérilisée au milieu de culture dans le puits d’une plaque de 6 puits en veillant à ce que la chambre haute soit la plus haute. Ajuster le niveau du milieu de culture afin qu’il entre en contact avec la surface inférieure de la membrane biomatériau, mais ne coule pas dans la chambre supérieure.</li>
	<li>Préparer une suspension des cellules endothéliales cornéennes en utilisant la procédure décrite à la section 6. Une densité cellulaire suffisante dans la suspension devrait être atteinte pour permettre une densité d’ensemencement d’au moins 100 000 cellules par cm2 sur la membrane de la chambre micro-Boyden. La surface de la culture dans la chambre micro-Boyden est de 0,5 cm2 et elle peut contenir un volume de 100 L. Par conséquent, une suspension contenant 500 000 cellules/mL doit être préparée.</li>
	<li>Pipette 100 l de suspension cellulaire (50 000 cellules) sur la membrane de la chambre micro-Boyden. Incuber dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 4 h avant de remplir le milieu pour immerger complètement la chambre. Incuber la culture pendant la période de temps requise, en remplaçant le milieu deux fois par semaine. REMARQUE : Une fois que les cellules endothéliales cornéennes se sont attachées à la surface supérieure de la membrane de biomatériau la chambre micro-Boyden peut être renversée au sein de la culture bien de sorte que la chambre inférieure soit la plus haute. Plus de cellules peuvent alors être ajoutées à la chambre pour initier des cultures cellulaires sur l’autre surface de la membrane. Par exemple, les cellules stromales cornéennes peuvent être facilement appliquées à la surface alternative imitant ainsi l’emplacement relatif des types de cellules cornéennes comme on le voit dans la cornée postérieure.</li>
</ol>

<ol><li>Güell, J. L., El Husseiny, M. A., Manero, F., Gris, O., Elies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Historical+Review+and+Update+of+Surgical+Treatment+for+Corneal+Endothelial+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Historical Review and Update of Surgical Treatment for Corneal Endothelial Diseases.</a> Ophthalmology and Therapy. 3, 1-15 (2014).</li>
<li>Tan, D. T. H., Dart, J. K. G., Holland, E. J., Kinoshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Corneal transplantation.</a> The Lancet. 379 (9827), 1749-1761 (2012).</li>
<li>Soh, Y. Q., Peh, G. S. L., Mehta, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+issues+for+human+corneal+endothelial+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regnerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Translational issues for human corneal endothelial tissue engineering.</a> Journal of Tissue Engineering and Regnerative Medicine. 11 (9), 2425-2442 (2017).</li>
<li>Senoo, T., Joyce, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Cycle+Kinetics+in+Corneal+Endothelium+from+Old+and+Young+Donors%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology%2C+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Cell Cycle Kinetics in Corneal Endothelium from Old and Young Donors.</a> Investigative Ophthalmology, Visual Science. 41 (3), 660-667 (2000).</li>
<li>Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Thériault, M., Proulx, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+process+of+corneal+endothelial+morphological+change+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology%2C+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro.</a> Investigative Ophthalmology, Visual Science. 56, 1228-1237 (2015).</li>
<li>Harkin, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mounting+of+Biomaterials+for+Use+in+Ophthalmic+Cell+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Mounting of Biomaterials for Use in Ophthalmic Cell Therapies.</a> Cell Transplantation. 26 (11), 1717-1732 (2017).</li>
<li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2 (4), 2369-2392 (2012).</li>
<li>Walshe, J., Harkin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+explant+culture+provides+novel+insights+into+the+potential+location+and+phenotype+of+corneal+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Serial explant culture provides novel insights into the potential location and phenotype of corneal endothelial progenitor cells.</a> Experimental Eye Research. 127, 9-13 (2014).</li>
<li>Al Abdulsalam, N. K., Barnett, N. L., Harkin, D. G., Walshe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+corneal+endothelial+cells+from+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cultivation of corneal endothelial cells from sheep.</a> Experimental Eye Research. 173, 24-31 (2018).</li>
<li>Parekh, M., Ferrari, S., Sheridan, C., Kaye, S., Ahmad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+An+Update+on+the+Culture+of+Human+Corneal+Endothelial+Cells+for+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Concise Review: An Update on the Culture of Human Corneal Endothelial Cells for Transplantation.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (2), 258-264 (2016).</li>
<li>Peh, G. S., Toh, K. P., Wu, F. Y., Tan, D. T., Mehta, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+human+corneal+endothelial+cells+isolated+from+paired+donor+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cultivation of human corneal endothelial cells isolated from paired donor corneas.</a> PLoS One. 6 (12), 28310(2011).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Un défi technique important lié à l’établissement et à l’expansion des cellules endothéliales cornéennes humaines empêche l’EMT de se produire dans les cultures. L’EMT peut être déclenchée dans les cellules endothéliales cornéennes par la perte du contact cellule-cellule, pourtant la plupart des protocoles de culture cellulaire pour ces cellules impliquent la dissociation enzymatique aux cellules simples pendant l’isolement et la sous-culture10. Ici nous présentons un protocole alternatif de cultu...

La cornée est un tissu transparent qui est situé à l’avant de l’œil. Il est composé de trois couches principales : une couche épithéliale sur la surface extérieure, une couche de stroma moyenne, et une couche intérieure appelée l’endothélium cornéen. L’endothélium cornéen est une monocouche de cellules qui se trouve sur une membrane de sous-sol appelée membrane de Descemet et il maintient la transparence de la cornée en régulant la quantité de liquide qui pénètre dans le stroma de l’humour aqueux sous-jacent. Trop de liquide dans le stroma provoque un gonflement cornéen, l’opacité et la perte de vision. L’endothélium est donc essentiel pour maintenir la vision.
L’endothélium cornéen peut devenir dysfonctionnel pour un certain nombre de raisons, y compris le vieillissement, la maladie et les blessures, et le seul traitement actuel est la chirurgie de transplantation. Pendant cette chirurgie, l’endothélium et la membrane de Descemet sont enlevés de la cornée du patient et remplacés par une greffe de l’endothélium et de la membrane de Descemet obtenues d’une cornée de distributeur. Beaucoup de greffes d’endothélium contiennent également une fine couche de tissu stromal pour faciliter la manipulation et l’attachement à la cornée hôte1.
Dans le monde entier, la demande de tissus de donneurs cornéens pour les chirurgies de transplantation est supérieure à la quantité qui peut être fournie par les banques oculaires2. Il y a donc eu une volonté de développer des greffes d’endothélium cornéen tissulaire qui pourraient être utilisées pour pallier ce manque à gagner3. La raison d’être de ceci est basée sur le fait qu’actuellement, l’endothélium d’une cornée individuelle ne peut être transféré à un seul patient, cependant, si les cellules endothéliales cornéennes ont été d’abord étendues et cultivées sur des échafaudages de biomatériaux dans la culture de tissu, elles pourraient être employées pour traiter plusieurs patients.
Les principaux défis qui doivent être relevés avant que les greffes d’endothélium cornéen tissulal deviennent une option réalisable pour les chirurgiens comprennent: (1) l’établissement de techniques pour l’expansion des cellules endothéliales cornéennes de haute qualité et pour la production de maturité et couches endothéliales endothéliales cornées fonctionnelles in vitro, et (2) établissant des techniques pour cultiver les cellules sur des échafaudages de biomatériaux pour produire des greffes tissulaires qui sont égales, ou meilleures que, les greffes cornées de donneur qui sont actuellement employées.
Les cellules endothéliales cornéennes ont un très faible potentiel de prolifération in vivo, mais peuvent être stimulées pour diviser in vitro4. Néanmoins, ils ont une forte tendance à subir une transition épithéliale-mésenchymale in vitro (EMT), ce qui réduit leur capacité à former une couche endothéliale fonctionnelle et mature. Les déclencheurs connus de l’EMT dans les cellules endothéliales cornéennes comprennent l’exposition à certains facteurs de croissance et la perte de contact cellule-cellule5. Il est donc presque inévitable que les cultures endothéliales endothéliales cornéennes qui sont enzymatiquement dissociées pendant la sous-culture subiront des changements associés à l’EMT. Ici, nous présentons une méthode de culture cellulaire pour les cellules endothéliales cornéennes humaines ou brebis qui est conçue pour minimiser la perturbation des contacts de cellule à cellule pendant les étapes d’isolement, d’expansion et de sous-culture, afin de réduire le potentiel d’EMT. En outre, nous démontrons comment les greffes tissulaires qui ressemblent à l’endothélium/greffes de tissu stromal de la cornée dérivée de la cornée de donneur peuvent être produites en cultivant des couches de cellules cultivées des deux côtés d’une membrane de biomatériau dans un dispositif de montage fait sur mesure.

<table><tbody><tr><td>Facteur d’attachement</td><td>Gibco</td><td>S006100</td><td>Une solution stérile 1X contenant de la gélatine qui est utilisée pour recouvrir les surfaces de culture tissulaire. Conserver à 4 °C.</td></tr><tr><td>Extrait hypophysaire bovin</td><td>Gibco</td><td>13028014</td><td>Un seul flacon contient 25 mg. Congeler en aliquotes.</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Merck</td><td>C5670</td><td>Dissoudre dans HBSS pour obtenir une solution mère de 1 mM. Filtrer la stérilisation.</td></tr><tr><td>Tube à centrifuger, 50 ml</td><td>Labtek</td><td>650.550.050</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de chondroïtine</td><td>LKT Laboratories</td><td>C2960</td><td>Il s’agit du sulfate de chondroïtine bovine. Dissoudre dans HBSS pour obtenir une solution mère de 0,08 g/mL. Filtrer, stériliser et congeler dans des aliquotes.</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>Dissoudre dans le DPBS pour obtenir une solution mère de 2 mg/mL. Filtrer, stériliser et congeler dans des aliquotes.</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Labtek</td><td>EA043</td><td>L’éthanol 100 % non dénaturé doit être dilué à 70 % dans de l’eau déminéralisée pour la stérilisation des instruments et des surfaces.</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>GE Healthcare Australia Pty Ltd</td><td>SH30084.03</td><td>Il s’agit d’une marque HyClone de sérum fœtal bovin.</td></tr><tr><td>Coverglass n° 1, & Oslash ; 13 mm</td><td>Proscitech</td><td>G401-13</td><td>Place le couvercle stérilisé se glisse dans des plaques à 24 puits pour la culture tissulaire.</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>Solution saline équilibrée de Hank, 1X, contenant du chlorure de calcium et du chlorure de magnésium.</td></tr><tr><td>Acide L-ascorbique 2-phosphate</td><td>Merck</td><td>A8960</td><td>Dissoudre dans HBSS pour obtenir une solution mère de 150 mM. Filtrer la stérilisation.</td></tr><tr><td>Chambre Micro-Boyden</td><td>CNC Components Pty. Ltd.</td><td>Anneau supérieur : QUT-0002-0006, Anneau de base : QUT-0002-0007</td><td>Les deux composants sont en polytétrafluoroéthylyne (PTFE).</td></tr><tr><td>Joint torique pour micro-chambre Boyden</td><td>Ludowici Sealing Solutions</td><td>RSB012</td><td>Composé de caoutchouc de silicone.</td></tr><tr><td>Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1</td><td>Gibco</td><td>51985-034</td><td>Un milieu sérique réduit contenant de la glutamine.</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco, 1X, sans chlorure de calcium ni chlorure de magnésium.</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Une solution antibiotique 100X contenant 10 000 unités/ml de pénicilline et 10 000 &micro ; g/mL de streptomycine.</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>Sarstedt</td><td>82.14473.001</td><td>Boîte de Pétri stérile, 92 X 16 mm, pour dissections de tissus.</td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire, 24 puits</td><td>Corning Incorporated</td><td>Costar 3524</td><td>Une plaque contenant 24 puits, chacun d’une surface de 2 cm2.</td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire, 6 puits</td><td>Corning Incorporated</td><td>Costar 3516</td><td>Une plaque contenant 6 puits, chacun d’une surface de 9 cm2.</td></tr><tr><td>TrypLE Select</td><td>Gibco</td><td>12563-011</td><td>Une solution enzymatique 1X pour la dissociation des cellules.</td></tr><tr><td>Versene</td><td>Gibco</td><td>15040-066</td><td>Une solution EDTA 1X pour la dissociation des cellules.</td></tr><tr><td>Pince d’horloger</td><td>Labtek</td><td>BWMF4</td><td>La pince d’horloger numéro 4 fonctionne bien pour retirer les bandes de membrane d’endothélium/Descemet des cornées.</td></tr></tbody></table>

croissance des couches cellulaires endothéliales coréennes humaines et brebis sur les membranes biomatériaux

Growth of Human and Sheep Corneal Endothelial Cell Layers on Biomaterial Membranes

Les cultures épithéliales de cellules endothéliales cornéennes ont tendance à subir la transition épithéliale-à-mesenchymal (EMT) après perte du contact de cellule-à-cellule. EMT est délétère pour les cellules car il réduit leur capacité à former une couche mature et fonctionnelle. Ici, nous présentons une méthode pour établir et subculper les cultures endothéliales endotales cornées humaines et breturantes qui minimisent la perte de contact de cellule à cellule. Les explants de l’endothélium cornéen/de la membrane de Descemet sont prélevés sur des cornées donneuses et placés dans la culture tissulaire dans des conditions qui permettent aux cellules de migrer collectivement sur la surface de la culture. Une fois qu’une culture a été établie, les explantations sont transférées dans des assiettes fraîches pour initier de nouvelles cultures. Dispase II est utilisé pour soulever doucement des amas de cellules des plaques de culture tissulaire pour la subculturing. Les cultures de cellules endothéliales cornéennes qui ont été établies en utilisant ce protocole sont appropriées pour le transfert aux membranes de biomatériaux pour produire des couches cellulaires tissulaires pour la transplantation dans les essais sur les animaux. Un dispositif fait sur mesure pour soutenir des membranes de biomatériau pendant la culture de tissu est décrit et un exemple d’une greffe tissulaire-engineered composée d’une couche des cellules endothéliales cornéennes et d’une couche des cellules stromal cornéennes de chaque côté d’une membrane de type de collagène I est présentée.

La méthode d’isoler et d’élargir les cellules endothéliales cornéennes des cornées humaines ou brebis est résumée dans la figure 1 et la figure 2. La plupart des explants qui sont dérivés des cornées de moutons de 1 à 2 ans ou de donneurs humains de moins de 30 ans se fixent aux plaques de culture tissulaire enduites de facteur d’attachement dans une semaine, cependant, il n’est pas rare de constater que jusqu’à un tiers des explants ne se fixent pas dans ce dél...

Ce protocole décrit les étapes critiques nécessaires pour établir et cultiver les cultures endothéliales cornéennes de cellules des explants des tissus humains ou de mouton. Une méthode pour subculturing cellules endothéliales cornéennes sur les biomatériaux membranaires est également présentée.

Croissance des couches cellulaires endothéliales coréennes humaines et brebis sur les membranes biomatériaux

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is ...

Ce protocole de culture cellulaire est conçu pour empêcher les cellules endothéliales cornéeles de subir une transition épithéliale à mésenchymale pendant l’isolement, l’expansion et la sous-culture. Les cultures cellulaires sont établies à partir d’explantations de tissus cornéens, qui peuvent être réutilisées pour assurer un approvisionnement continu en cellules primaires à partir d’un donneur. Commencez par enduire les puits d’une plaque de culture tissulaire de six puits avec le facteur d’attachement en utilisant les instructions du fabricant.Ajoutez ensuite un millilitre de milieu de culture à chaque bien codé. Placer le côté endothélium de la cornée vers le haut dans une boîte de Pétri stérile sur la scène d’un microscope disséquant. Ajustez l’éclairage de sorte que la surface cornéenne soit bien éclairée avec un contraste suffisant pour mettre en évidence la couche endothéliale, et ajustez le zoom de sorte que le bord et un certain endothélium cornéen central est en vue.Utilisez des forceps d’horlogers stérilisés pour soulever et arracher doucement la membrane de Descemet du stroma sous-jacent. Placez la bande membranaire dans l’un des puits préparés de la plaque de culture, en vous assurant de remplacer immédiatement le couvercle de la plaque afin de réduire le risque de contamination. Retirez d’abord les bandes de la membrane de Descemet de la périphérie extrême de l’endothélium, puis des régions centrales, en plaçant toutes les bandes d’une cornée dans un seul puits.Une fois terminé, incuber les explants dans un incubateur humidifié de culture cellulaire fixé à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Assembler la chambre haute de la chambre micro Boyden en plaçant un anneau rouge O dans son centre. Utilisez une tréphine de 18 millimètres de diamètre pour percer un disque à partir d’une feuille de biomatériau sur une planche à découper PTFE.Ensuite, placez le disque sur l’anneau rouge O dans la chambre haute de la chambre boyden micro. Vissez la chambre basse sur la chambre haute, en sécurisant le disque du matériau bio entre les deux. Et tremper la chambre micro Boyden assemblée dans 70% d’éthanol pendant une heure pour la stériliser.Après le trempage, plonger complètement la chambre dans le HBSS stérile pendant 10 minutes pour enlever l’éthanol. Ensuite, laver la chambre dans le milieu de la culture pendant 10 minutes. Et le transfert à la culture milieu à l’intérieur d’un puits d’une plaque de six puits, en s’assurant que la chambre haute est orientée vers le haut.Ajustez le niveau du milieu de sorte qu’il entre en contact avec la surface inférieure de la membrane biomatériale, mais ne s’écoule pas dans la chambre haute. Pipette 100 microlitres de suspension cellulaire sur la membrane dans la chambre micro Boyden, et l’incuber dans l’incubateur de culture tissulaire pendant quatre heures, avant d’ajouter moyen pour submerger complètement la chambre. La plupart des explants qui ont été dérivés des cornées d’un à deux ans moutons ou donneurs humains de moins de 30 ans attachés à des plaques de culture de tissu codé facteur d’attachement dans la semaine.Après six semaines, de nombreuses petites cellules serrées étaient présentes à côté de l’explant. Les petites cellules serrées dans les cultures cellulaires endothéliales cornéeles sont résistantes à la digestion avec triple, tandis que les plus grandes cellules fibroblastiques sont plus sensibles à elle. Cette différence a été exploitée pour éliminer sélectivement les grosses cellules des cultures avant de transférer les cellules plus petites vers de nouvelles plaques.Des analyses immunisées de flourescence ont été conduites sur des cultures endothéliales cornéennes de cellules pour localiser ZO-1, une protéine serrée de jonction, et N-cadherin, une protéine de jonction d’adhérence. Les mêmes anticorps ont été utilisés pour les cellules ovines et humaines, et les deux protéines ont été détectées dans les membranes plasmatiques des cellules des deux espèces. La chambre de micro Boyden sur mesure permettait aux deux côtés d’une membrane d’être utilisés simultanément comme surfaces de culture cellulaire.Une vue transversale d’une construction de cellule machinée de tissu montre une seule couche des cellules endothéliales cornéeles sur une surface, et une culture multicouche des cellules stromal cornéeles de l’autre. Lorsque vous essayez ce protocole, il est important d’éviter de racler l’endothélium avec vos forceps lorsque vous épluchez la membrane de Descemet loin de la cornée. Après cette procédure, l’intégrité d’une couche de cellules endothéliales cornéeennes sur une membrane peut être vérifiée en mesurant sa résistance électrique.

growth-human-sheep-corneal-endothelial-cell-layers-on-biomaterial

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

La stimulation mécanique induite par le calcium propagation des ondes dans des monocouches de cellules: l&#39;exemple de bovins cellules endothéliales de la cornée

Nous rapportons une technique pour la fabrication de micropoches dans les membranes électrofilées dans lequel étudient le comportement des cellules. Plus précisément, nous décrivons une combinaison de microstéréolithographie électrofilage et pour la production de PLGA (poly (lactide-co-glycolide)), des dispositifs de biomatériaux équipés de micro-caractéristiques de la cornée.

Combinaison de Microstéréolithographie et Électrofilage à produire des membranes Equipé Niches pour la régénération de la cornée

Un exemple de thérapie génique adénovirale dans les cornées cultivées d’organes diabétiques humains est présenté vers la normalisation du retard de cicatrisation des plaies et une expression nettement réduite des marqueurs des cellules souches épithéliales dans ces cornées. Il décrit également l’optimisation de ce processus dans les cultures épithéliales limbiques enrichies en cellules souches.

Adénovirus thérapie génique diabétique Kératopathie: Effets sur la cicatrisation des plaies et des cellules souches Marker Expression dans Human cornées Organ-culture et de cellules épithéliales limbiques

Une culture primaire de cellules endothéliales de cornée bovine a été utilisée pour étudier le mécanisme de transition endotheliale de la cornée mésenchymateuses. En outre, un modèle d'endothélium cornéen cryolésion de rat a été utilisé pour démontrer la transition de l' endothélium de la cornée mésenchymateuses in vivo.

In vitro et dans des modèles in vivo pour étudier la transition cornéenne endothéliale-mésenchymateuses

Ce protocole décrit un roman en trois dimensions in vitro model, où les cellules du stroma cornéens et différenciés de cellules neuronales sont élevées ensemble afin d’aider à l’examen et la compréhension des interactions entre les deux types cellulaires.

Ingénierie du tissu cornéen : Un In Vitro modèle des Interactions stroma-nerf de la cornée humaine

Les auteurs décrivent une méthode pour un tissu rétinien composé de cellules épithéliales pigmentaire rétinien dérivés des cellules souches pluripotentes humaines cultivées sur le dessus des membranes amniotiques humaines et de sa préparation pour les greffes dans des modèles animaux de l’ingénieur.

Ingénierie de tissu d’épithélium pigmentaire rétinien Transplantation-convient dérivées de cellules souches embryonnaires humaines

Un protocole pour un ancien modèle de culture de cornée orgue vivo utile pour la cicatrisation des études est exposée. Ce système de modèle peut servir à évaluer les effets des agents pour favoriser la guérison régénératrice ou toxicité des médicaments dans un environnement 3D organisé de multicellulaire.

Ex Vivo, modèle de Culture d’organes cornéenne pour la cicatrisation des études

Ici, un protocole étape par étape pour la préparation et la culture des boutons cornéens fendus porcins est présenté. Comme ce modèle de culture d'organes organo-typiquement cultivé montre des taux de mortalité cellulaire dans les 15 jours, comparables aux cornées de donneurs humains, il représente le premier modèle permettant la culture à long terme de cornées non humaines sans ajouter de dextran toxique.

Un modèle de culture d'orgue endothéliale de porc cornée utilisant des boutons cornéens fendus

Ici, nous présentons un protocole pour détacher les cellules endothéliales cornéennes (CEC) de la membrane de Descemet (DM) à l’aide d’un neodymium:YAG (Nd:YAG) laser comme modèle de maladie ex vivo pour la kératompathie bullous (BK).

Développement d’un modèle expérimental non invasif assisté au laser de la perte de cellules endothéliales cornéennes

Le Stripping Only de Descemet est une procédure expérimentale dans laquelle les patients atteints de guttase cornéenne centrale résultant d’une dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs ont la membrane de Descemet dépouillée pour que les cellules périphériques régénèrent la couche endothéliale. Nous présentons une nouvelle méthodologie simulant le DSO dans les cornées humaines dystrophiques ex vivo avec une guérison accélérée stimulée par eFGF1 (NM141).

Un modèle de culture d’organes cornéens humains du décapage de Descemet uniquement avec une guérison accélérée stimulée par le facteur de croissance des fibroblastes 1

Ici, nous présentons un protocole pour obtenir des suspensions unicellulaires de haute qualité à partir de cornées entières de souris par digestion séquentielle avec collagénase A et trypsine. Cette méthode permet de produire des cellules uniques viables avec une grande intégrité ARN, les rendant compatibles avec des applications en aval telles que le séquençage à ARN monocellulaire et le cytomètrey en flux.

Un protocole pour la récolte de la suspension unicellulaire sur les cornées de souris

Découvrez la culture de cellules endothéliales cornéennes humaines et ovines sur biomatériaux. Cette méthode préserve le phénotype endothélial et évite la transition épithélio-mésenchymateuse pour la médecine régénérative.

Croissance des couches cellulaires endothéliales coréennes humaines et brebis sur les membranes biomatériaux

Explorer plus de vidéos