Étiquetage Dextran et prise en vie et fonctionnelle cellules courines Murine
8 février 2020
Ici, nous présentons une méthode pour visualiser l’apaisement de 3 kDa Texas Red-labeled dextran dans les cellules ciliées auditives avec des canaux fonctionnels de mécannotransduction. En outre, dextrans de 3 à 10 kDa peuvent être utilisés pour étudier l’endocytose dans les cheveux et les cellules de soutien de l’organe de Corti.
L’objectif global de ce protocole est d’étudier l’absorption de dextran régulier étiqueté fluorescent avec Texas Red dans les cellules cils vivantes avec des canaux de mécanotransduction fonctionnelle. Le principal avantage de cette technique est que les trois kilodalton Texas Red dextran peuvent être utilisés pour évaluer la fonction du canal de mécanotransduction dans les cellules cils vivantes. Pour récolter la cochlée, placez le crâne d’une souris postnatale de six jours dans un plat de culture de 60 millimètres contenant le milieu L-15 de Leibovitz et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire une coupe superficielle de l’extrémité antérieure à l’extrémité postérieure du crâne et à travers les canaux auditifs externes.
Pliez la peau vers le nez pour exposer le crâne et faire une incision de l’arrière à l’avant du crâne et à travers la ligne des yeux. Séparez le crâne en deux moitiés et utilisez une petite spatule pour enlever le cerveau. Lorsque les os temporels peuvent être observés, utilisez de petits ciseaux pour couper autour de ces os pour exciser le tissu.
Submergez les os temporels dans le plat de 35 millimètres contenant du L-15 frais moyen et placez le plat sous un microscope stéréo équipé d’un oculaire large champ et d’une source de lumière halogène alternée externe. Utilisez des forceps pour enlever le tissu cochléaire environnant, les canaux semi-circulaires et les organes vestibulaires. Une fois que la cochlée a été disséquée et placée dans un nouveau plat avec les médias frais de L-15, utilisez des forceps chirurgicaux pour faire une blessure de perforation sur la fenêtre ronde et une ponction à la région cochléaire apical.
Lorsque toutes les cochlées ont été récoltées, placez le tissu dans un puits d’une plaque de dépression en verre de neuf puits contenant 200 microlitres de L-15 frais moyen. Pour l’étiquetage dextran des tissus isolés, remplacez le milieu de chaque puits d’échantillon par 200 microlitres de L-15 frais moyen complété par deux milligrammes par millilitre de la fluorescence conjuguée dextran d’intérêt. Incuber les échantillons pendant deux heures à température ambiante et 25 rotations par minute dans un shaker tridimensionnel à un angle incliné de 25 degrés protégé de la lumière.
À la fin de l’incubation, laver les tissus une fois à l’heure moyenne et une fois avec le HBSS pendant deux minutes par lavage. Après le deuxième lavage, fixer les spécimens en paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 minutes à température ambiante, suivi de deux lavages rapides et doux dans le HBSS. Après le deuxième lavage, utilisez des forceps à pointe fine pour enlever l’os cochléaire, le ligament spirale et la membrane tectoriale et laver l’organe isolé de Corti dans HBSS.
Prenez un soin supplémentaire lors de l’enlèvement de la membrane tectorial transparente puisque le tissu sur les cellules cils peuvent être facilement endommagés au cours de cette étape. Pour étiqueter la F-actine, perméabilizez les échantillons dans 0,5%Triton X-100 en PBS complété par 100 à 200 dilution de phalloidin étiqueté fluorescent pendant 30 minutes à température ambiante protégée de la lumière. À la fin de l’incubation, lavez les tissus deux à trois fois dans le HBSS frais par lavage tel que démontré suivi d’un seul lavage dans PBS.
Utilisez un support de montage approprié pour monter l’organe des tissus Corti sur le microscope en verre glisse stéréocilia cheveux vers le haut et l’image des échantillons sur un microscope confocal fluorescent en utilisant l’objectif d’immersion d’huile 63X. Après une incubation de deux heures avec trois kilodalton dextran conjugués fluorescentement avec Texas Red, organe de Corti explant de type sauvage postnatal jour six souris démontrent un étiquetage robuste et spécifique des cellules capillaires intérieures et externes. L’imagerie des cellules capillaires stéréocilia et des corps cellulaires révèle que seules les cellules qui ont incorporé trois kilodaltons dextran Texas Red dans leur corps cellulaire ont également démontré l’étiquetage fluorescent de leur stéréocilia.
Fait important, un signal fluorescent uniforme est observé le long de la stéréocilia avec enrichissement à l’extrémité des rangées stéréocilia plus courtes où se trouve le canal de mécanotransduction. Des structures vésicules dans le corps cellulaire des cellules cils et les cellules voisines de soutien sont également observées suggérant que dextran Texas Red peut également être pris par endocytose. Plus grand dextrans de 10 kilodalton a également produit un modèle vesicle-like dans le corps cellulaire des cellules de cheveux et des cellules de soutien.
Notamment, la présence d’un chélateur de calcium ou de inhibiteurs de la mécanotransduction empêche l’étiquetage stéréocilia et l’absorption de trois kilodaltons dextran Texas Red dans les cellules cils. Le modèle vesicle-like est toujours observé en présence du blocus de canal de méchanotransduction, cependant, indiquant que ce modèle d’absorption est indépendant des canaux fonctionnels de MET. Il est très important de disséquer soigneusement l’organe du tissu corti et de confirmer l’orientation correcte des cellules cils avant de monter le tissu pour l’imagerie.
Après l’étiquetage dextran des cellules cils vivantes et fonctionnelles, l’immunostaining du tissu fixe peut être exécuté pour identifier des types spécifiques de cellules de protéines d’intérêt.
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Aperçu
Cet article présente une méthode permettant de visualiser l'absorption de dextrane marqué au Texas Red de 3 kDa dans les cellules ciliées auditives possédant des canaux de mécanotransduction fonctionnels. Cette technique permet d'évaluer la fonction des canaux de mécanotransduction dans des cellules ciliées vivantes.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Recherche auditive
Contexte
- La compréhension de la mécanotransduction dans les cellules ciliées auditives est essentielle pour la fonction auditive.
- Les dextranes de tailles variées peuvent être utilisés pour étudier des processus cellulaires tels que l’endocytose.
- L’organe du Corti est une structure clé de la cochlée impliquée dans l’audition.
- Le marquage fluorescent facilite la visualisation des processus d’absorption cellulaire.
Objectif de l'étude
- Visualiser la prise en charge du dextran marqué au Texas Red dans les cellules ciliées auditives vivantes.
- Évaluer le fonctionnement des canaux de mécanotransduction dans ces cellules.
- Explorer l'utilisation des dextrans pour l'étude de l'endocytose dans les cellules ciliées et les cellules de soutien.
Méthodes utilisées
- Prélèvement des cochlées de souris au sixième jour après la naissance.
- Utilisation de techniques chirurgicales pour exposer les structures cochléaires.
- Application de dextrane marqué par le Texas Red sur les cellules ciliées auditives.
- Visualisation de l'absorption par microscopie de fluorescence.
Résultats principaux
- Visualisation réussie de la prise en charge de la dextrane dans les cellules ciliées vivantes.
- Démonstration de la fonctionnalité des canaux de mécanotransduction.
- Apport de connaissances sur les mécanismes d'endocytose dans l'organe de Corti.
- Mise en place d'une méthode fiable pour l'étude de la biologie cellulaire auditive.
Conclusions
- La méthode visualise efficacement la prise de dextrane par les cellules ciliées auditives.
- Cette approche peut améliorer la compréhension de la transduction mécanique dans l'audition.
- Des études futures pourront s'appuyer sur cette technique pour explorer des processus cellulaires connexes.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
L'évaluation de la fonction des canaux de mécanotransduction dans les cellules ciliées auditives vivantes est essentielle pour la validation ciblée dans le développement de thérapeutiques contre la perte auditive. Cette méthode fournit une mesure directe et quantitative de l'activité des canaux par l'absorption de dextran fluorescent, permettant ainsi d'éliminer les risques mécanistiques liés aux cibles impliquées dans la transduction sensorielle. L'approche renforce la confiance prédictive en phase précoce de découverte en reliant la fonction moléculaire au phénotype cellulaire dans un système pertinent pour la maladie.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Interroge des hypothèses thérapeutiques en mesurant directement l'activité fonctionnelle des canaux de mécanotransduction dans des cellules ciliées vivantes.
- Valeur opérationnelle : Permet la détection biologique des risques associés aux cibles grâce à un test robuste, basé sur l'imagerie, de la fonction des canaux.
- Valeur prédictive : Facilite le tri du portefeuille en distinguant les composés qui préservent ou modulent la fonction des canaux MET de ceux qui ne le font pas.
Développement de criblages et de tests
- Préparation du test : Prépare des systèmes biologiques validés pour le criblage de composés en aval en confirmant la prise en charge dépendante du MET de dextran comme biomarqueur fonctionnel.
- Production quantitative : Génère des signaux de fluorescence mesurables dans les stéréocils et le corps cellulaire, corrélés à l'activité des canaux et pouvant être normalisés entre les échantillons.
- Extensibilité et réutilisabilité : Permet l'adaptation de la plateforme à une analyse à haut contenu des cinétiques de prise en charge de colorant dans des explants de l'organe de Corti.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Utilise des explants postnataux de l'organe de Corti de souris comme système pertinent pour étudier la fonction des cellules ciliées auditives.
- Continuité translationnelle : Établit un lien entre les découvertes et la validation préclinique en fournissant un indicateur cohérent de l'activité du canal MET à travers les différentes étapes expérimentales.
- Progression ajustée au risque : Guide les décisions d'aller ou de ne pas aller plus loin en identifiant les composés qui perturbent la capture de la dextrane par blocage du canal MET.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de la découverte, allant du test d'hypothèses sur une cible à l'identification d'un composé précurseur, où la validation fonctionnelle des canaux de mécanotransduction précède le criblage et l'optimisation des composés.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies en fournissant un indicateur direct de l'absorption cellulaire dépendante des canaux MET dans les cellules ciliées.
- Écrans : Permet la préparation de tests grâce à des protocoles normalisés d'étiquetage par la dextrane, produisant des signaux fluorescents reproductibles et quantitatifs dans les stéréocils et le corps cellulaire.
- Analyse : Fournit des variables dépendantes mesurables (intensité de fluorescence dans les rangées de stéréocils et motifs de type vésiculaire) permettant la comparaison entre conditions expérimentales et effets de composés.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans la continuité préclinique en utilisant le même indicateur d'activité MET pour évaluer l'interaction avec la cible dans des modèles de maladie.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une capacité réutilisable pour évaluer la fonction de transduction sensorielle dans divers programmes de recherche auditive.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Fournit une confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique dans l'analyse des voies de mécanotransduction.
- Valeur opérationnelle : Garantit la standardisation et la reproductibilité grâce à des paramètres définis d'incubation, de lavage et d'acquisition d'images pour l'absorption de dextran.
- Valeur stratégique : Améliore la prise de décision « aller/ne pas aller » en associant la modulation de la cible à des mesures fonctionnelles des cellules ciliées, réduisant ainsi les risques biologiques en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation des composés ajustée au risque, fondée sur leur effet sur l'absorption de dextran dépendante du MET dans un système pertinent pour la maladie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en dissection cochléaire murine, en isolement de l'organe de Corti et en microscopie fluorescente.
- Dépend d'une infrastructure d'imagerie confocale dotée de paramètres laser et de détection adaptés à la fluorescence du Texas Red.
- Exige une standardisation de la concentration de dextran, du temps d'incubation et des conditions d'agitation entre les laboratoires.
- Implique des adaptations à prendre en compte lors de l'application de la méthode à différents modèles de mammifères ou à divers stades de développement.
- Est limitée par la nécessité d'une préparation de tissu vivant et par la sensibilité des cellules ciliées au stress mécanique et environnemental durant la dissection.
