Préparation de pastilles de cellules mononucléaires de sang périphérique et de plasma à partir d’une seule prise de sang sur des sites d’essais cliniques pour l’analyse de biomarqueurs

Les échantillons de PBMC et de plasma sont simples à acquérir et très instructifs au début du développement clinique. Ce protocole robuste minimise la variabilité pré-analytique introduite aux sites cliniques. Ce protocole est rapide et facile, nécessitant un équipement de laboratoire de base et une expertise minimale de l’opérateur pour transformer le sang en PBMC et en plasma.

Il est compatible avec les journées de laboratoire occupées dans les hôpitaux. L’analyse en aval des composants sanguins résultant de ce protocole peut éclairer les relations pharmacocinétiques et pharmacodynamiques, l’établissement du calendrier des doses de médicaments et la preuve de l’engagement de la cible et fournir des informations sur les mécanismes d’action des médicaments, soutenant à la fois l’analyse en temps réel et l’analyse introspective. Nous utilisons ce protocole pour les études oncologiques, en particulier pour analyser les mécanismes de réponse aux dommages à l’ADN.

Cependant, les matériaux rassemblés par ce protocole peuvent être pertinents dans de nombreux domaines de la maladie et de multiples modalités thérapeutiques. Après avoir reçu huit millilitres de sang de donneur par échantillon, noter l’heure à laquelle le sang a été prélevé et inverser doucement chaque tube huit à 10 fois avant de transférer les échantillons de sang traités par anticoagulant dans chacun des tubes marqués pour la radiation. Pour les échantillons cliniques, centrifuger les tubes juste après les avoir inversés.

Placez les tubes gris 0,2 dans une armoire à rayons X préchauffée, fermez la porte et appliquez une dose grise de 0,2 sur les tubes. Remplacer les tubes irradiés à faible dose par les sept tubes gris et ajuster la dose pour appliquer une dose de rayonnement gris de sept sur les échantillons d’irradiation à forte dose. Une fois que les deux échantillons ont été irradiés, incuber les trois tubes à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Transférer les échantillons dans des tubes de préparation cellulaire avant de séparer les cellules par centrifugation à grande vitesse, en vous assurant de régler les unités sur x g ou rcf équivalent. Après la centrifugation, visualisez les tubes sur un fond sombre pour identifier le plasma, les globules rouges et les couches de manteau chamois. À l’aide d’une pipette sérologique, transférer environ la moitié du plasma dans une centrifugeuse conique de 15 millilitres étiquetée sans perturber la couche de manteau chamois et stocker le tube de plasma sur de la glace humide.

Ensuite, utilisez une pipette de pâturage pour transférer toute la couche de revêtement chamois contenant du PBMC dans un nouveau tube de 15 millilitres et ajoutez du PBS à température ambiante au PBMC à un volume final de 15 millilitres par échantillon. Mélangez doucement les cellules par inversion cinq fois et collectez les cellules par centrifugation à une vitesse inférieure, en vous assurant de vérifier les unités de centrifugation. Aspirez tous les microlitres de surnageant sauf les 500 derniers sans déranger les pastilles.

Ajouter du PBS frais à un volume final de 10 millilitres à chaque tube et le ressusciter en inversant doucement les tubes. Utilisez 40 aliquotes microlitres des cellules pour le comptage. Après le comptage, recueillir les cellules avec une autre centrifugation et enlever autant de surnageant que possible sans perturber les pastilles.

Pour stocker le PBMC en vue d’un traitement ultérieur, remettre les pastilles dans 50 microlitres de PBS frais par échantillon avec un pipetage doux et transférer chaque suspension cellulaire entière dans un cryovial marqué de 1,5 millilitre sur de la glace humide. Ensuite, gelez les cellules par la méthode préférée et placez-les dans une boîte de congélation à moins 80 degrés. Notez l’heure à laquelle les cellules ont été gelées.

Vous pouvez également ressusciter les granulés dans un millilitre ou un mélange de congélation par échantillon et transférer les suspensions cellulaires dans des cryovials marqués individuels. Ensuite, placez les tubes et les boîtes de congélation pré-refroidies pour un stockage de moins 80 degrés Celsius. Pour congeler le plasma, ajoutez jusqu’à un millilitre aliquotes beaucoup de plasma jusqu’à chacun des cinq microtubes de deux millilitres sans perturber la pastille résiduelle et enregistrez le volume total de plasma dans chaque tube.

Ensuite, congelez immédiatement les aliquotes plasmatiques dans une orientation verticale dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius. Pour l’analyse western des échantillons, ressusciter la pastille dans chaque tube avec un volume approprié de tampon de lyse complété par des inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase égal à celui du volume de la pastille cellulaire avec pipetage doux et incuber les échantillons cellulaires pendant 10 minutes sur de la glace. À la fin de l’incubation, transférer les échantillons dans des tubes de 1,5 millilitre et les soniquer avec trois cycles de 30 secondes sur 30 secondes à quatre degrés Celsius.

Prélever les échantillons par centrifugation et transférer les surnageants dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre. Ensuite, mélanger 40 microgrammes par échantillon avec un tampon de chargement et faire bouillir les échantillons pendant cinq minutes. Chargez 20 microgrammes de chaque échantillon par voie en double dans un gel protéique Bis-Tris à 4-12% et exécutez une FDS-PAGE.

Le nombre de cellules obtenues à partir de huit millilitres de sang varie selon le patient et l’ensemble de la maladie. En général, la pastille cellulaire est de petite taille et de couleur blanche transparente. Parfois, les granulés peuvent avoir une certaine contamination des globules rouges, ce qui a un effet négatif sur la qualité de la préparation.

Un rendement typique d’un patient lymphocytique chronique de leucémie utilisant ce protocole varie de 1,62 fois 10 au quatrième à 1,99 fois 10 aux neuvièmes cellules par huit millilitres préparation mononucléaires de cellules avec une concentration finale en protéine s’étendant entre 1,62 à 19,77 milligrammes par millilitre. Dans cette analyse représentative de trois échantillons de patients, on a observé une augmentation des modifications poteau-traductionnelles à des doses plus élevées de rayonnement ionisant. Intéressant, la phosphorylation de l’ataxie-télangiectasie a muté et RAD50 était substantielle à la faible dose de 0,2 gris, ce qui suggère que ces modifications post-traductionnelles peuvent être interrogeables comme biomarqueurs pharmacodynamiques pour les traitements impliquant la génération de ruptures de double brin d’ADN avec une bonne plage dynamique dans la tumeur, aussi bien que des échantillons de sang périphériques.

Pour une préparation optimale de l’échantillon, traitez le sang dans l’heure suivant le prélèvement à température ambiante, centrifugez correctement les échantillons et visualisez le tube sur le fond sombre pour pouvoir distinguer le pelage chamois.