Name: Passer à l’étape suivante : un modèle de transplantation orthotopique orthotopique des membres de l’utérus pour maximiser la récupération fonctionnelle chez les rats (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: Découvrez la transplantation orthotopique de membre postérieur chez le rat pour étudier l'immunologie et la récupération fonctionnelle. Ce modèle utilise des techniques microchirurgicales précises pour anastomoser vaisseaux et nerfs.

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Ces travaux ont été financés par la Fondation Frankel et le Northwestern Memorial Hospital McCormick Grant (Opération RESTORE). La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par l’Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health sous le numéro de prix T32GM008152. Ce travail a été soutenu par le Northwestern University Microsurgery Core and Behavioral Phenotyping Core.

Toutes les expériences ont été menées conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals des National Institutes of Health (NIH) et ont été approuvées par le Northwestern University Animal Care and Use Committee. Les procédures spécifiques ont été effectuées dans le cadre du protocole IS00001663.
NOTE: Deux souches de rats ont été utilisés, les rats Lewis et Août Copenhague x Irlandais (ACI) rats. Les animaux ont été divisés en trois groupes de traitement : allotransplant sans suppression immunitaire (ACI à Lewis), allotransplant avec suppression immunitaire conventionnelle (ACI à Lewis), et isotransplant (Lewis à Lewis ou ACI à ACI). Lewis est une souche consanguine, tandis que les rats ACI représentent un type sauvage sur-élevé, donc cette combinaison a été choisie pour modéliser la réponse de rejet pire-cas. L’immunosuppression conventionnelle a été administrée sous-cutanéement soit sous forme de rapamycine 1 mg/kg du jour postopératoire (POD) moins 1 à POD 28 ou sous forme de FK506 3 mg/kg de POD 0 à POD 14, puis une fois par semaine par la suite. Les rats mâles et femelles étaient des receveurs admissibles âgés de 8 à 16 semaines, pesant entre 250 et 400 grammes au moment de la chirurgie.
1. Récolte des membres postérieurs droits du donneur
<ol><li>Induire l’anesthésie générale avec 5% d’isoflurane dans l’oxygène pur par un vaporisateur avec un système de nettoyage approprié.</li>
	<li>Confirmer la profondeur adéquate de l’anesthésie avec pincement aux orteils, puis utiliser des tondeuses à cheveux pour couper la fourrure hors du membre arrière droit et le site chirurgical de l’aine droite</li>
	<li>Baisser l’isoflurane à travers un cône de nez de rongeur à 2-2,5%.</li>
	<li>Placez la supine de rat avec des membres écartés collés sur les côtés sur une planche d’opération avec un coussin chauffant en dessous. Désinfecter la peau sans poils avec 70% d’alcool à friction et protéger le champ chirurgical avec de la gaze stérile.</li>
	<li>À l’aide d’un microscope microchirurgical approprié, des instruments microchirurgicaux, et avec un accès facile à l’électrocautésie bipolaire et monopolaire, commencer la dissection.</li>
	<li>Utilisez des ciseaux pour faire une incision circonférentielle de peau/tissu sous-cutané autour du derrière droit. Commencez dans le pli inguinal medially au même niveau que le ligament inguinal et prolongez dorsale-laterally pour compléter l’incision circumférentielle.</li>
	<li>Après avoir exposé la couche musculaire directement sous l’incision, disséquer et cautériser les vaisseaux épigastriques superficiels qui mènent de la couche musculaire à la peau proximale / rabat sous-cutané vient de créer.</li>
	<li>Refléter le rabat proximal superomedially au ligament inguinal et la peau distale / rabat sous-cutané infernal au genou.</li>
	<li>Utilisez un rétractateur de fil ou une gaze roulée pour aider à exposer le champ.</li>
	<li>Observez que l’anatomie inguinale du rat est similaire à celle des humains; du côté au médial se trouvent le nerf, l’artère et la veine.</li>
	<li>Disséquer le nerf fémoral, le diviser brusquement au ligament inguinal, proximal à la bifurcation si possible. Rétractez le nerf divisé de façon inférieure, en le gardant en toute sécurité hors de la voie, couvert sous la gaze humide.</li>
	<li>En ce qui concerne l’artère fémorale et la veine, utilisez des attaches de soie de 4 cm 7-0 pour rétracter les vaisseaux au lieu de les manipuler directement.</li>
	<li>Lier toutes les branches des vaisseaux fémoraux comme ils se posent avec 7-0 cravates de soie; diviser les branches entre les liens. Pour les très petites branches, la cautérisation bipolaire peut être utilisée au lieu des liens. REMARQUE : Les branches artérielles et veineuses qui nécessitent une division comprennent l’iliaque circonflexe superficielle et les vaisseaux musculaires. L’iliaque circonflexe superficielle est généralement plus grand et semble plonger profondément comme le serait le fémoral profunda chez l’homme, mais le profunda est absent dans le rat15. Les branches plus distales des vaisseaux fémoraux, comme la branche géniculaire la plus élevée et la branche saphéneuse, ne nécessitent généralement pas de division.</li>
	<li>Injecter systématiquement 500 unités internationales d’héparine par la veine du pénis dans un donneur de rat mâle. Utilisez la veine épigastrique superficielle si le rat donneur est femelle.</li>
	<li>Laisser l’héparine circuler systématiquement pendant 2 min avant de passer aux prochaines étapes.</li>
	<li>Lier l’artère fémorale avec des liens de soie 7-0 aussi proximal au ligament inguinal que possible et diviser entre les liens.</li>
	<li>Semblable à l’artère, lier et diviser la veine fémorale.</li>
	<li>Refléter à la fois l’artère et la veine de façon inférieure, en toute sécurité hors de la voie, couvert sous la gaze humide avec le nerf fémoral couvert précédemment. Disséquer les groupes musculaires ventraux, en prenant soin de cautériser tout vaisseau visible qui se pose. Attention à l’hémostase ici permettra de minimiser la perte de sang receveur après reperfusion.</li>
	<li>Profondément aux groupes de muscle ventral, identifier et diviser fortement le nerf sciatique proximal à ses branches. Trois branches sciatiques sont généralement visibles : tibial, péronéal et sural. Tous les trois doivent être conservés dans le membre donneur. Une quatrième branche cutanée n’est généralement pas observée dans cette dissection15,16.</li>
	<li>Terminer à diviser les groupes de muscle ventral et dorsal restants au niveau mi-cuisse avec l’hémostase méticuleuse. Il peut être nécessaire de rétracter le membre medially pour compléter la division des muscles.</li>
	<li>Transect l’os du fémur à l’étage intermédiaire à l’aide d’une scie rotative sans fil tenue à la main.</li>
	<li>Après avoir enlevé la greffe de membre du donneur, couper les extrémités liées de soie de l’artère fémorale côté greffe et les souches veineuses, ré-ouvrant ainsi les vaisseaux.</li>
	<li>Insérez un angiocatheter de calibre 24 dans la souche de l’artère de greffe et rincez la greffe avec 250 unités internationales d’héparine diluées dans 5 mL de solution saline normale glacée, en la regardant s’écouler à travers la veine ouverte.</li>
	<li>Lentement, rincer doucement la greffe pendant environ 3 min. Un rinçage puissant excessif peut endommager l’endothélium.</li>
	<li>Placer la greffe dans un plat saline réfrigéré imbriqué dans un seau à glace jusqu’à la transplantation.</li>
	<li>Euthanasier le rat donneur avec la thoracotomie bilatérale.</li>
	<li>Nettoyez tous les instruments chirurgicaux de manière appropriée.</li>
</ol>2. Amputation du membre arrière droit natif du receveur
<ol><li>Induire l’anesthésie avec l’isoflurane à 5%, confirmer la profondeur, couper la fourrure, positionner l’animal, et désinfecter la peau avec de l’alcool comme décrit pour le rat donneur.</li>
	<li>Isoflurane à 2-2,5% et injection d’analgésie préopératoire sous-cutanée avec buprénorphine 1,2 mg/kg, et prophylaxie préopératoire avec enrofloxacine 7,5 mg/kg.</li>
	<li>Même pour le donneur, faire une incision circonférentielle dans le pli inguinal, refléter les volets de la peau assurant l’hémostase, et disséquer le nerf fémoral, l’artère et la veine, ligatant les mêmes vaisseaux de branche que ci-dessus.</li>
	<li>Divisez le nerf fémoral plus distally que pour le donneur, mais proximalement à la bifurcation si possible.</li>
	<li>Disséquer l’artère fémorale et la veine avec assez d’espace pour serrer chacun séparément au niveau du ligament inguinal. Pincez la veine et l’artère avec des pinces de bouledogue microchirurgicale. Une fois serré, diviser fortement chaque récipient à l’une des ciseaux.</li>
	<li>Divisez les muscles ventraux et dorsaux de la cuisse au niveau mi-cuisse avec une hémostase méticuleuse, rétractant le membre medially si nécessaire.</li>
	<li>Identifier et diviser les nerfs sciatiques proximal à leurs points de branche comme ci-dessus.</li>
	<li>Transect le fémur à mi-arbre à l’aide de la scie.</li>
	<li>Retirez le membre postérieur droit natif du receveur et disposez-les de façon appropriée.</li>
	<li>Baisser l’isoflurane à 1-1,5% à travers le cône de nez.</li>
</ol>3. Implantation du donneur au receveur des membres
<ol><li>À l’aide de la scie à puissance à main, raser toutes les irrégularités du donneur et des extrémités de coupe du fémur receveur.</li>
	<li>À l’aide de la scie, couper l’extrémité du moyeu d’une aiguille de calibre 18, qui deviendra la tige intramédullaire du fémur.</li>
	<li>Avant de manipuler l’os, appliquer une petite quantité de cire osseuse sur l’extrémité coupée du femur pour réduire le saignement de moelle pendant le processus de ramage.</li>
	<li>Coapt le donneur et les os fémoraux receveurs à l’aide de l’aiguille de calibre 18 comme tige intramédullaire. Une certaine force est nécessaire, mais ne rame pas l’os dans la mesure où fracturer le cortex.</li>
	<li>Au besoin, retirez l’aiguille et coupez-la à une longueur appropriée de sorte que les deux os s’adaptent en douceur sur l’aiguille sans qu’aucune aiguille ne se manifeste entre l’os.</li>
	<li>Placez un petit support comme un tampon de gaze ou une petite roche ou de l’argile de modélisation sous le membre donneur pour le garder hors tension.</li>
	<li>Reapproximate les groupes de muscle ventral avec huit à dix sutures simples interrompues 5-0 polyglactine de sorte que la greffe ne tourne pas autour de l’aiguille du fémur. Cela donne la stabilité des membres pour les anastomoses.</li>
	<li>Irriguer périodiquement la greffe et le champ chirurgical avec de la solution saline glacée pour une meilleure visualisation et pour réduire les lésions de reperfusion ischémiques chaudes.</li>
	<li>Alignez les artères fémorales du donneur et du receveur et anastomosez-les de façon de bout en bout à l’aide d’une simple suture en nylon interrompue 10-0, évitant à la fois la tension et la boucle. L’artère nécessite en moyenne six sutures.</li>
	<li>Semblable à l’artère, anastomose le donneur et les veines fémorales de fin à fin. La veine nécessite six à huit sutures. REMARQUE : L’irrigation saline froide généreuse, la technique de manutention des navires atraumatiques et le fait de laisser de longues queues servir de sutures de séjour pour la rétraction des navires sont des outils importants pour des anastomoses microchirurgicales efficaces.</li>
	<li>Placez une petite quantité de poudre de cellulose hémostique autour des deux anastomoses, puis retirez les pinces microchirurgicales proximales de bouledogue sur la veine et l’artère.</li>
	<li>Inspecter les deux anastomoses pour une bonne patence et le débit. Utilisez des bâtonnets de coton-tige pour pousser doucement la veine et assurer une bonne hémostase des deux anastomoses. Maintenez la pression sur les sites de saignement et placez plus de poudre de cellulose hémostatique si nécessaire. Une autre suture peut être placée à travers un trou de saignement au risque de « back-walling » l’aiguille seulement en dernier recours.</li>
	<li>Lorsque les deux anastomoses sont confirmées satisfaisantes, couper les queues de suture longue séjour restant court pour correspondre aux autres.</li>
	<li>Repositionnez le rat à la position latérale gauche de decubitus, utilisez l’électrocautéuté libéral pour atteindre l’hémostase méticuleuse de n’importe quel saignement de muscle de reperfusion.</li>
	<li>Tournez l’attention vers les anastomoses nerveuses une fois que l’hémostase musculaire est assurée. Coupez en arrière toutes les extrémités de coupe de nerf qui semblent en lambeaux.</li>
	<li>Reapproximate les groupes de muscle dorsal sous le nerf sciatique avec des sutures simples interrompues de polyglactine 5-0.</li>
	<li>Reapproximate le nerf sciatique. Huit à dix 10-0 neural simple sutures interrompues de nylon suffira habituellement.</li>
	<li>Reapproximate les groupes de muscles dorsaux rappelant, puis fermer la peau dorsale avec 4-0 polyglactine suture continue.</li>
	<li>Repositionnez le rat en position de supination et reapproximate le nerf fémoral. Deux à trois 10-0 nealnal en nylon simple sutures interrompues suffiront habituellement.</li>
	<li>Fermez la peau ventrale avec la suture continue de 4-0 polyglactine. Évitez l’excès de suture, ce qui peut irriter le rat une fois réveillé.</li>
</ol>4. Soins postopératoires
<ol><li>Récupérer les animaux dans leurs cages avec un coussin chauffant sous la cage et un accès facile à la nourriture et à l’eau, en surveillant les complications précoces tous les jours pendant la première semaine.</li>
	<li>Fournir une analgésique postopératoire avec une injection sous-cutanée de meloxicam 1 mg/kg par injection quotidienne par l’intermédiaire du POD 2. Fournir une prophylaxie antibiotique postopératoire dilue enrofloxacine. Fournir un facteur dissuasif pour l’autotomie (automutilation) avec Bitter Safe Mist pulvérisé deux fois par jour à la greffe par pod 7.</li>
	<li>Maintenir les rats transplantés dans des cages avec d’autres rats, pour stimuler le retour aux activités quotidiennes et réhabiliter le membre transplanté.</li>
</ol>5. Test de sensation postopératoire
<ol><li>Appliquer l’essai Hargreaves du protocole de sensation thermique, également décrit ailleurs17,18.</li>
	<li>Placez le rat dans le récipient d’essai et lui permettez de s’acclimater pendant 20 minutes. Le verre de l’appareil est confirmé propre, et la source de chaleur a confirmé travailler avec le doigt de l’enquêteur.</li>
	<li>Avant de tester, confirmez que le rat est éveillé et que la patte testée est positionnée au-dessus du détecteur de mouvement infrarouge.</li>
	<li>Transmettre l’énergie thermique au niveau d’intensité 90. Le délai dans le déplacement de la patte de l’animal loin de la source de chaleur est enregistré. Si aucun mouvement ne se produit dans les 20 secondes, le test est interrompu pour prévenir les blessures.</li>
	<li>Obtenir cinq essais par membre testé, à l’exclusion de la valeur la plus élevée et la plus basse avant de calculer le temps de latence moyen de retrait pour chaque animal.</li>
</ol>6. Essais moteurs postopératoires
<ol><li>À l’aide d’un tapis roulant d’analyse de démarche et d’une plate-forme intégrée d’analyse logicielle, sélectionnez les candidats aux tests sur tapis roulant à quatre à six semaines après la chirurgie.</li>
	<li>Couper tous les ongles d’orteil des rats un ou deux jours avant l’essai.</li>
	<li>Acclimater les animaux à la salle d’essai pendant une heure avant les tests, et laisser une minute de caresses pré-test pour calmer l’anxiété.</li>
	<li>Placer le rat à l’intérieur du tapis roulant, exécuter le tapis roulant à des essais de vitesse croissante, de 10 cm/s, à 14 cm/s, à l’objectif 18 cm/s. Si le rat est réticent et ne peut pas être incité à marcher, interrompre les tests ce jour-là pour éviter le conditionnement négatif. Permettre aux personnes performantes de marcher jusqu’à 24 cm/s.</li>
	<li>Rincez l’appareil tapis roulant avec 70% d’éthanol entre les animaux testés.</li>
	<li>Les paramètres de Gait sont issus du logiciel propriétaire de la plate-forme d’analyse.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La greffe de membre, dans la catégorie plus large de l’allotransplantation vascularisée de composant (VCA), a la promesse thérapeutique largement applicable encore non remplie. Les principaux obstacles se trouvent dans les questions immunologiques non résolues propres à vca et les techniques de récupération neuromoteur utilisés actuellement. Le développement de nouvelles techniques dépendra de la modélisation animale qui est flexible, robuste et reproductible.
De nombreux modèles animaux ont é...

La greffe de membre dans la catégorie plus large de l’allotransplantation vascularisée-composite (VCA) ou de l’allotransplantation composite de tissu (CTA) n’a pas encore rempli sa promesse thérapeutique. Depuis les premières greffes de mains humaines réussies à Lyon, france et Louisville, Kentucky en 1998 et 1999, plus de 100 greffes d’extrémité supérieure ont été effectuées dans le monde entier chez des patients soigneusement sélectionnés1. L’applicabilité plus large a été bloquée par l’immunosuppression substantielle et la récupération neuromotrice fonctionnelle limitée. Les stratégies actuelles d’immunosuppression entraînent une incidence de 85 % du rejet aigu face à l’incidence de 77 % de l’infection opportuniste2. D’autre part, la récupération fonctionnelle après la greffe de main se produit ; les scores moyens de l’incapacité de l’épaule et de la main (DASH) passent de 71 à 43, mais ce niveau de fonction peut tout de même être considéré comme un handicap2. Compte tenu de la nature non salvatrice de la greffe des membres, les techniques actuelles doivent être affinées dans les modèles animaux pour passer à l’étape suivante de l’ACV.
Depuis le premier modèle de rat de greffe de membre en 19783, de nombreux modèles animaux innovants ont été développés pour faire progresser le domaine de VCA4, incorporant anastomoses vasculaires menottées pour minimiser le temps opératoire5,6, hétéro greffes ostéomyocutanées topic pour minimiser l’insulte physiologique à l’animal receveur7,8,9,10,11, et nouvelles approches immunologiques7,12,13,14. Le modèle de rat de la greffe orthotopique du membre arrière droit mi-cuisse présentée ici met l’accent sur les techniques microchirurgicales méticuleuses et éprouvées comme les anastomoses vasculaires cousues à la main et la coaptation neuronale comme investissement initial dans une plate-forme modèle robuste et reproductible pour étudier simultanément les deux aspects de la limitation actuelle de vca : stratégies d’immunosuppression et récupération neuromotrice fonctionnelle.

<table><tbody><tr><td>Appareil d’anesthésie</td><td>Vet Equip</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>seringue de calibre</td> 24 <td>Exel</td><td>26018</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille de calibre 18</td><td>BD</td><td>305196</td> seringue de 1 309659 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de calibre 22</td><td>BD</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>angiocathéter de calibre 24</td><td>Sur-Vet</td><td>SROX2419V</td><td></td></tr><tr><td>de 25- aiguille de jauge</td><td>Exel</td><td>26403</td><td></td></tr><tr><td>Seringue 3 cc</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>seringue 5cc</td><td>Exel</td><td>26230</td><td></td></tr><tr><td>Alcool</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC-600-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Chambre d’induction d’anesthésie</td><td>Vet Equip</td><td>941443</td><td></td></tr><tr><td>Système de piégeage de gaz anesthésique</td><td>Vet Equip</td><td>931401</td><td></td></tr><tr><td>Bipolaire électrocautérisation</td><td>Aura</td><td>26-500</td><td></td></tr><tr><td>Brume amère</td><td>Henry Schein</td><td>5553</td><td></td></tr><tr><td>Cire d’os</td><td>CP Médical</td><td>CPB31A</td><td></td></tr><tr><td>Circuit respiratoire</td><td>Vet Equip</td><td>921413</td><td></td></tr><tr><td>Buprenophine</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>12496075705</td><td></td></tr><tr><td>Castro-Viejos Needle drivers</td><td>Roboz</td><td>RS-6416</td><td></td></tr><tr><td>Scie rotative sans fil</td><td>Dremel</td><td>8050-N/18</td><td></td></tr><tr><td>Bâtonnet de coton-tige</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td>Pour l’hémostase</td></tr><tr><td>DigiGait Appparatus et logiciel</td><td>Souris Spécificités</td><td>MSI-DIG, DIG-SOFT</td><td></td></tr><tr><td>Dumont forceps (#4)</td><td>Roboz</td><td>RS-4972</td><td></td></tr><tr><td>Dumont forceps (#5)</td><td>Roboz</td><td>RS-5035</td><td></td></tr><tr><td>Enrofloxacine</td><td>Norbrook</td><td>ANADA 200-495</td><td></td></tr><tr><td>FK-506</td><td>Astellas</td><td>301601</td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Kendall</td><td>1903</td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Covidien</td><td>8044</td><td></td></tr><tr><td>Gants</td><td>Microflex</td><td>DGP-350-M</td><td></td></tr><tr><td>Tondeuse</td><td>à cheveux Oster</td><td>078005-010-003</td><td></td></tr><tr><td>Electrocautérisation monopolaire</td><td>portable Bovie</td><td>AA00</td><td></td></tr><tr><td>Hargreaves Apparatus</td><td>Ugo Basile S.R.L. Gemonio, Italie</td><td>37370</td><td></td></tr><tr><td>Coussin chauffant</td><td>Walgreens</td><td>126987</td><td></td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Fresenius Kabi</td><td>42592K</td><td></td></tr><tr><td>Plaque chauffante</td><td>Corning</td><td>PC-351</td><td>Pour réchauffer le fluide de réanimation</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Sonneurs lactés</td><td>Baxter</td><td>2B2074</td><td></td></tr><tr><td>Grande boîte de Pétri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>Pour greffe de donneur en solution saline réfrigérée</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Henry Schein</td><td>49755</td><td></td></tr><tr><td>micro Collin Hartmann écarteur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro ciseaux de dissection</td><td>Roboz</td><td>RS-5841</td><td></td></tr><tr><td>Poudre de collagène microfibrillaire</td><td>BD</td><td>1010590</td><td>Pour l’hémostase</td></tr><tr><td>Pinces microvasculaires</td><td>Roboz</td><td>RS-5420</td><td></td></tr><tr><td>Saline normale</td><td>Baxter</td><td>2F7124</td><td></td></tr><tr><td>Lubrifiant ophtalmique</td><td>Dechra</td><td>IS4398</td><td></td></tr><tr><td>Rapmycin</td><td>MedChem Express</td><td>HY-10219</td><td></td></tr><tr><td>Petite boîte de Pétri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td>Pour liquide</td></tr> <tr><td>de réanimation réchaufféChamps stériles</td><td>ProAdvantage</td><td>N207100</td><td></td></tr><tr><td>Blouse chirurgicale</td><td>Cardinal Health</td><td>9511</td><td></td></tr><tr><td>Masque chirurgical</td><td>3M</td><td>1805</td><td></td></tr><tr><td>Microscope chirurgical, modèle optique OPMIMD</td><td>Zeiss</td><td>169756</td><td></td></tr><tr><td>Microscope chirurgical, universel S3</td><td>Zeiss</td><td>243188</td><td></td></tr><tr><td>Suture 10-0 nylon</td><td>Covidien</td><td>N2512</td><td></td></tr><tr><td>Suture 5-0 vicryl</td><td>Ethicon</td><td>J213H</td><td></td></tr><tr><td>Suture 7-0 cravate en soie</td><td>Teleflex</td><td>103-S</td><td></td></tr><tr><td>Tape</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur d’instruments à ultrasons</td><td>Roboz</td><td>RS-9911</td><td></td></tr><tr><td>Pince à dilatation des vaisseaux</td><td>Roboz</td><td>RS-5047</td><td></td></tr></tbody></table>

passer à l’étape suivante : un modèle de transplantation orthotopique orthotopique des membres de l’utérus pour maximiser la récupération fonctionnelle chez les rats

Taking the Next Step: a Neural Coaptation Orthotopic Hind Limb Transplant Model to Maximize Functional Recovery in Rat

La greffe de membre en particulier et l’allotransplantation composite vascularisée (VCA) en général ont la promesse thérapeutique large qui ont été bloquées par les limitations actuelles dans l’immunosuppression et la récupération neuromotrice fonctionnelle. De nombreux modèles animaux ont été développés pour étudier les caractéristiques uniques de VCA, mais ici nous présentons un modèle reproductible robuste de greffe orthotopique de membre postérieur chez les rats conçus pour étudier simultanément les deux aspects de la limitation actuelle de VCA : stratégies d’immunosuppression et rétablissement neuromoteur fonctionnel. Au cœur du modèle repose un engagement à des techniques microchirurgicales méticuleuses et éprouvées comme les anastomoses vasculaires cousues à la main et la coaptation neuronale cousue à la main du nerf fémoral et du nerf sciatique. Cette approche permet de générer des reconstructions durables des membres qui permettent aux animaux plus vivants capables de se réadapter, de reprendre les activités quotidiennes et d’effectuer des tests fonctionnels. Avec le traitement à court terme des agents immunosuppresseurs conventionnels, les animaux allotransplantés ont survécu jusqu’à 70 jours après la transplantation, et les animaux isotransplantés fournissent des contrôles de longue durée au-delà de 200 jours postopératoirement. Les preuves de la récupération fonctionnelle neurologique sont présentes par 30 jours après opératoirement. Ce modèle fournit non seulement une plate-forme utile pour interroger des questions immunologiques propres à la VCA et la régénération nerveuse, mais permet également de tester in vivo de nouvelles stratégies thérapeutiques spécifiquement adaptées à vca.

La survie et la récupération dépendent d’une technique chirurgicale méticuleuse. L’attention aux anastomoses vasculaires et aux anastomoses neuronales, ainsi qu’à la coaptation osseuse telle que décrite ci-dessus est cruciale pour maximiser le succès de ce modèle. La conception opérationnelle et les résultats anastomotiques représentatifs sont indiqués à la figure 1.
La mortalité globale dépendait de la stratégie d’immunosuppression, la majorité des animaux isotra...

Ce protocole présente un modèle robuste et reproductible d’allotransplantation composite vascularisée (VCA) orienté vers l’étude simultanée de l’immunologie et de la récupération fonctionnelle. Le temps investi dans la technique méticuleuse dans une greffe orthotopique droite de membre postérieur de mi-cuisse avec des anastomoses vasculaires cousues à la main et la coaptation neuronale donne la capacité d’étudier la récupération fonctionnelle.

Passer à l’étape suivante : un modèle de transplantation orthotopique orthotopique des membres de l’utérus pour maximiser la récupération fonctionnelle chez les rats

Limb transplant in particular and vascularized composite allotransplant (VCA) in general have wide therapeutic promise that have been stymied by current ...

Cette vidéo fournira une description détaillée, comment effectuer un membre orthotopique arrière droit, rat transplanté au milieu de la cuisse. Le membre postérieur droit du rat donneur est amputé au niveau du milieu de la cuisse, puis stocké sur de la glace. Le membre postérieur droit du rat receveur est également amputé au niveau du milieu de la cuisse.Le membre du rat donneur est ensuite fixé au rat receveur. Nous allons décrire comment rattacher l’os, l’artère, la veine, les nerfs, les muscles et les systèmes cutanés. La greffe de membre, plus spécifiquement, l’allotransplant composite vascularisé, VCA, a la promesse thérapeutique large.Mais il est actuellement limité par les techniques, l’immunosuppression, et la récupération neuromotrice fonctionnelle pauvre. Notre modèle met l’accent sur des techniques microchirurgical méticuleuses éprouvées par le temps, telles que l’anastomose vasculaire cousue à la main et la coaptation neurale. Nous avons effectué plus de 200 de ces chirurgies en plus d’un an.Bien qu’il y ait une courbe d’apprentissage initiale au microchirurgien de début, en utilisant cette vidéo pour apprendre notre méthode et leur engagement à la pratique dédiée, n’importe quel microchirurgien sera en mesure de maîtriser ce modèle. Toutes les expériences ont été menées conformément au guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health, NIH, et ont été approuvées par le Northwestern University Animal Care and Use Committee. Les procédures spécifiques ont été effectuées sur un protocole IS 00001663.Choisissez un rat âgé de 8 à 16 semaines pesant entre 250 et 400 grammes au moment de la chirurgie. Induire une anesthésie générale avec 5% d’isoflurane à travers un vaporisateur avant de couper la fourrure du rat membre postérieur. À l’aide d’un cône avant pour maintenir l’anesthésie entre 2 et 2,5 %, placez le rat sur la planche d’opération avec un radiateur en dessous.Désinfectez la peau glaçante avec 70% d’alcool à friction et protégez le champ chirurgical avec de la gaze stérile. À l’aide d’un microscope microchirurgical approprié et des instruments microchirurgaux présentés ici, ainsi que d’une électroctérité bipolaire et monopolisaire facile d’accès, vous serez prêt à commencer la dissection. Utilisez un ciseaux pour faire une incision circonférentielle et cutanée autour du membre arrière droit.Commencez dans le pli inguinal immédiatement au même niveau que le ligament inguinal et prolongez dorsalement latéralement pour compléter l’incision circonférentielle. Et puis exposer la couche musculaire directement sous l’incision, disséquer et cautériser les vaisseaux épigastriques superficiels, qui mènent de la couche musculaire à l’aileron proximal de la peau vient de créer. Refléter le rabat proximal superomedially au ligament inguinal et le volet distal de peau inferolaterally au genou.Utilisez un rétracteur de fil ou une gaze roulée pour aider à exposer le champ. Observé que l’anatomie inguinale du rat est semblable à l’homme; de latéral à médial se trouvent le nerf, l’artère, et la veine. Disséquer le nerf fémoral, le diviser fortement au ligament inguinal proximal à la bifurcation, si possible.Rétractez le nerf divisé de façon inférieure, en le gardant en sécurité hors de la route, couvert sous la gaze humide. En attirant l’attention sur l’artère fémorale et la veine utiliser quatre centimètres de long 7-0 liens de soie pour rétracter atraumatically les navires au lieu de les manipuler directement. Prêter une attention particulière maintenant permettra d’améliorer votre résultat anastomotic final.Ligate toutes les branches des vaisseaux fémoraux avec des attaches de soie 7-0. Répartir les branches entre les liens. Les branches artérielles et veineux qui nécessitent la division incluent l’iliaque circonflexe superficiel et les vaisseaux musculaires.Le circonflexe superficiel iliaque est généralement plus grand et semble plonger profondément comme le ferait le fémoral profunda chez l’homme, mais la profunda est absente chez le rat. Les branches plus distales des vaisseaux fémoraux, telles que le plus haut géniculaire et la branche saphenous n’exigent habituellement pas la division. Maintenant ligate l’artère fémorale avec des liens de soie 7-0 aussi proximal au ligament inguinal que possible et diviser entre les liens.Semblable à l’artère, ligate et diviser la veine fémorale. Réfléchissez à la fois l’artère et la veine de façon inférieure, en toute sécurité à l’extérieur, recouverte sous la gaze humide ainsi que le nerf fémoral couvert précédemment. Disséquer les groupes musculaires ventraux, en prenant soin de cautériser tout vaisseau visible qui se pose.Attention à l’hémostase maintenant permettra de minimiser la perte de sang receveur lors de la reprofusion plus tard. Profondément aux groupes musculaires ventraux, identifier et diviser brusquement le nerf sciatique proximal à ses branches. Les trois branches sciatiques sont généralement visibles, tibiales, périonales et surales.Tous les trois doivent être conservés dans le membre donneur. Une quatrième branche cutanée n’est généralement pas observée dans cette dissection. Finissez de diviser les groupes musculaires ventrals et dorsal restants au niveau du milieu de la cuisse avec une hémostase méticuleuse.Il peut être nécessaire de rétracter le membre avec méditation pour compléter la division des muscles. Transect l’os du fémur au milieu de l’arbre à l’aide d’une scie rotative sans fil portative. Le membre est maintenant libre du donneur.Après avoir enlevé la greffe de membre du donneur, couper les extrémités attachées en soie de l’artère fémorale côté greffe et souches veineuses, ouvrant ainsi les vaisseaux. Insérez un angiocathéter de calibre 24 dans la souche de l’artère greffière et rincez la greffe avec 250 unités internationales d’héparine diluées en 5 millilitres de solution saline normale glacée, en prenant soin de la regarder sortir de la veine ouverte. Rincer doucement la greffe pendant environ trois minutes.Un rinçage excessif et énergique peut endommager l’endothélium. Placer la greffe dans un plat salin réfrigéré niché dans un seau à glace jusqu’à la transplantation. Euthanasier le rat donneur avec thoracotomie bilatérale.La chirurgie du receveur commence semblable à la chirurgie du donneur, anesthésier le rat, couper la fourrure, faire une incision circonférentielle dans le pli inguinal, reflétant les volets de la peau, disséquant le nerf fémoral, l’artère et la veine. Et ligating les mêmes navires de branche comme décrit précédemment. Cependant, pendant cette opération, divisez le nerf fémoral plus distally que pour le donateur, mais proximalement à la bifurcation si possible.Divisez et libérez l’artère et la veine fémorales et serrez-les de façon immédiate respectivement au niveau du ligament inguinal avec des pinces microchirurgicales de bouledogue. Continuer la chirurgie comme décrit précédemment, en divisant les muscles ventral approuvant de la cuisse au niveau du milieu de la cuisse avec une hémostase méticuleuse, tout en rétractant le membre médiocrement si nécessaire. Identifier et diviser le nerf sciatique proximal jusqu’au point de branche et transecter le fémur au milieu de l’arbre à l’aide de la scie rotative.Retirez le membre arrière droit natif du receveur et disposez-le de façon appropriée conformément aux lignes directrices locales du Comité de soins et d’utilisation des animaux. Il est très important à ce stade de baisser l’isoflurane à un à 1,5% par le cône avant. Trop d’anesthésie au cours de cette partie moins douloureuse de la procédure conduira à la mort du rat.Il est temps de coaptiser les os ensemble. À l’aide de la scie rotative portative, raser toute irrégularité du donneur et du receveur des extrémités coupées du fémur. Coupez l’extrémité du moyeu d’une aiguille de calibre 18, qui deviendra la tige intramédullaire du fémur.Avant de manipuler l’os, appliquez une petite quantité d’une cire osseuse sur l’extrémité coupée du fémur pour réduire les saignements de moelle pendant le processus de reaming. Coapt les os fémoraux donneurs et receveurs à l’aide de l’aiguille de calibre 18 comme tige intramédullaire. Une certaine force est nécessaire, mais ne ream ni l’os jusqu’à fracturer le cortex.Au besoin, retirez l’aiguille et coupez-la à une longueur inappropriée de sorte que les deux os s’adaptent en douceur sur l’aiguille sans aiguille montrant entre l’os. Placez un petit support tel qu’un tampon de gaze ou une petite roche ou de l’argile de modélisation sous le membre donneur pour le garder hors tension. Reapproximate les groupes musculaires ventraux avec huit à 10 sutures simples interrompues de polyglactine 5-0 de sorte que la greffe ne tourne pas autour de l’aiguille du fémur.Cela donne à la branche la stabilité des anastomoses. Maintenant, commencez les anastomoses. Irriguer périodiquement la greffe et le champ chirurgical avec la solution saline glacée pour une meilleure visualisation et pour réduire des dommages ischémiques de reperfusion.Alignez les artères fémorales et l’anastomose du donneur et du receveur de bout en bout à l’aide d’une simple suture en nylon interrompue de 10 à 0, en évitant à la fois la tension et le looping. L’artère nécessite en moyenne six sutures. Semblable à l’artère, anastomose les veines fémorales de donateur et de destinataire de bout en bout.La veine nécessite de six à huit sutures. L’irrigation saline froide généreuse, la technique atraumatique de manipulation de navire, et laisser de longues queues pour servir de sutures de séjour pour la rétractation de navire sont des outils importants pour les anastomoses microchirurgical efficaces. Placez une quantité modérée de poudre hémostatique de cellulose sur les deux anastomoses, et retirez par la suite les pinces microchirurgical proximales de bouledogue sur la veine et l’artère.Inspecter les deux anastomoses pour une bonne patency et le flux. Utilisez des bâtonnets d’écouvillon de coton pour propulser doucement la veine et inspecter la bonne hémostase sur les deux anastomoses. Lorsque les deux anastomoses sont confirmées satisfaisantes, coupez les queues de suture de long séjour restantes pour correspondre aux autres.Repositionnant le rat à la position latérale gauche de decubitus, emploiez l’électrocautery libéral pour atteindre l’hémostase méticuleuse de n’importe quel saignement de muscle de reperfusion. L’attention est tournée vers les anastomoses nerveuses une fois l’hémostase musculaire assurée. Reapproximate les groupes musculaires dorsal qui se trouvent directement sous le nerf sciatique avec des sutures de polyglactine simples interrompues 5-0.Coupez toutes les extrémités coupées par les nerfs qui semblent en lambeaux. Reapproximate le nerf sciatique avec des sutures de nylon 10-0 s’efforçant de morsures épinéurales. Huit à dix sutures simples interrompues suffiront habituellement.Reapproximate les groupes musculaires dorsal restants avec des sutures de polyglactine 5-0. Ensuite, fermez la peau dorsale avec 4-0 polyglactine suture continue en cours d’exécution. Repositionner le rat à la position supinée, ré reapproximate le nerf fémoral avec suture en nylon 10-0, encore une fois, la lutte pour les morsures épinéurales.Deux à trois sutures simples interrompues suffiront habituellement. Fermez le reste de la peau ventrale de la même manière que la peau dorsale. Évitez l’excès de queue de suture, qui peut être irritant pour le rat une fois éveillé.Une fois que les animaux sont sortis de la fenêtre postopératoire immédiate, ils peuvent être testés pour la récupération neuromotrice. Le test Hargreaves est utilisé pour tester la sensation thermique. Placez le rat dans le récipient d’essai et lui a permis de s’acclimater pendant 20 minutes.Le verre de l’appareil est confirmé propre, et la source de chaleur est confirmée pour travailler avec le doigt de l’enquêteur. Avant de tester, confirmez que le rat est éveillé et que la patte testée est positionnée au-dessus du détecteur de mouvement infrarouge. Transmettre l’énergie thermique au niveau d’intensité 90.Le retard dans le déplacement de la patte par l’animal loin de la source de chaleur est enregistré. Si aucun mouvement ne se produit dans les 20 secondes, le test est interrompu pour prévenir les blessures. Obtenez cinq essais par membre testé, à l’exclusion de la valeur la plus élevée et la plus basse avant de calculer le temps moyen de latence de retrait pour chaque animal.Voici la conception opérationnelle représentée dans le format de dessin animé. Le membre postérieur droit des rats donneurs et receveurs est amputé au niveau du milieu de la cuisse sous forme de coupe transversale sciatique. L’artère fémorale, la veine, et le nerf, aussi bien que le nerf sciatique et l’os de fémur doivent alors être reconnectés dans la chirurgie de destinataire.Le modèle peut être utilisé pour montrer les effets différentiels de survie de la suppression immunitaire et de la stratégie de transplantation. Avec cette technique, la survie à long terme est réalisable. Le modèle peut être employé pour étudier la récupération sensorielle de nerf, qui peut être évidente par quatre semaines postopératoirement.La fonction motrice peut également être interrogée à l’aide d’une plate-forme d’analyse de la démarche. Ici, nous avons présenté une plate-forme modèle de rat avec des caractéristiques de survie favorables, que nous utilisons pour sonder la récupération sensorielle et motrice comme on le voit dans les chiffres de la procédure. Greffe de membre dans la catégorie plus large de VCA, allotransplantation vasculaire de composant a la promesse thérapeutique largement applicable n’est pas encore remplie.Les principaux obstacles sont les techniques actuelles d’immunosuppression et de récupération neuromotrice. Le développement de nouvelles techniques dépendra d’une modélisation animale flexible, robuste et reproductible. En utilisant cette plate-forme, nous espérons que les chercheurs seront en mesure de faire progresser de multiples facettes de la greffe des membres.Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos prochaines étapes.

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