Caractérisation des changements conformationnels à molécule unique sous le flux de cisaillement avec microscopie fluorescence

La quantification des changements conformationnels dans les biomolécules simples sous le flux de cisaillement est utile pour comprendre la fonction et la biophysique des macromolécules comme les protéines et l’ADN. La microscopie par fluorescence permet la visualisation in situ en temps réel de molécules uniques dans des environnements de flux physiologiques à haute résolution temporelle et spatiale. Cela est inégalé par d’autres techniques comme l’AFM.

En caractérisant la force de cisaillement sous laquelle les protéines de notre ADN ont des changements conformationnels mondiaux, on peut mieux concevoir des médicaments qui imitent ces propriétés biophysiques. Ce protocole peut être largement appliqué pour étudier le comportement ou d’autres polymères, en particulier les polymères biologiques, dans des conditions d’écoulement variables et pour étudier la rhéologie des fluides complexes. Le moment des étapes est essentiel au succès.

Nous suggérons de pratiquer le traitement de surface du dispositif microfluidique et la microscopie de fluorescence étapes de nombreuses fois pour les exécuter d’une manière efficace. Capturer les changements conformationnels dans les biomolécules est un phénomène visuel et dynamique mieux vu sur le film. Les scientifiques comprendront mieux cette méthode après avoir vu la microscopie protéique et ADN en temps réel présentée dans cette vidéo.

Pour préparer l’appareil microfluidique, ajouter cinq parties de la base de l’élastomer en silicone à un agent de séchage de pièce dans un bateau de pesage. et remuer soigneusement le contenu pendant une minute pour créer une solution PDMS pré-durcie. Placez la plaquette de silicium maître dans une boîte de Pétri en plastique et versez la solution PDMS sur la gaufrette pour créer une couche de cinq millimètres.

Couvrir le plat et le laisser dans un dessiccateur sous vide pendant une heure pour enlever les bulles d’air. Puis incuber la boîte de Pétri couverte à 60 degrés Celsius pendant la nuit pour guérir le PDMS dans un solide flexible, ce qui se traduira par des canaux microfluidiques étant moulés dans le PDMS à l’interface de gaufrette PDMS. Le lendemain, utilisez un rasoir pour couper 20 rectangles de 10 millimètres autour de chaque canal microfluidique dans le PDMS et retirez les blocs rectangulaires à l’aide d’une pince à épiler.

Utilisez une aiguille à extrémité émoussée de calibre 25 avec des bords aiguisés pour percer un trou de 0,5 millimètre de diamètre à une extrémité du chenal, en vous assurant que le trou passe complètement à travers le bloc PDMS. Utilisez une aiguille fine pour perforer le PDMS hors du trou et répéter le processus à l’autre extrémité du canal. Placez le bloc PDMS avec le côté canal vers le haut et le coverslip dans la chambre d’une machine de liaison plasmatique et commencer le traitement.

Lorsque le traitement est terminé, placez rapidement le bloc PDMS sur un coverslip de sorte que le canal est en contact avec le glissement. Appliquer une pression sur les bords du bloc, puis placer l’assemblage PDMS coverslip sur une plaque chaude à 115 degrés Celsius pendant 15 minutes pour renforcer la liaison permanente. Enfin, insérez un 10 centimètres de long.

Tube de diamètre intérieur de 0,25 millimètre dans le trou de sortie en haut du bloc PDMS pour permettre au fluide de sortir facilement du canal. Pour le facteur von Willebrand ou vwf expériences injecter jusqu’à 10 microlitres de 10 microgrammes par millilitre BSA-Biotin dissous dans stérile 1X PBS dans l’entrée de l’appareil microfluidique. Retenir quelques microlitres de BSA-Biotin dans la pointe de la pipette après l’injection et laisser la pointe rester encastrée dans l’entrée.

Laissez le BSA-Biotin couver dans l’appareil pendant deux heures, ce qui entraînera une liaison non spécifique bsa à la surface du coverslip. Retirez ensuite la pointe pipette et injectez jusqu’à 10 microlitres de solution de blocage de la caséine dans le canal. Laissez la solution de caséine couver pendant 30 minutes afin qu’elle puisse bloquer tous les sites libres et réduire la liaison non spécifique des biomolécules à la surface.

Retirer la pointe et injecter jusqu’à 10 microlitres de streptavidine dans le canal stérile PBS, qui se liera aux groupes de biotine de la BSA-Biotine. Ensuite, injectez jusqu’à 10 microlitres de solution détergente pour laver l’excès de streptavidine. Retirer la pointe et injecter soit VWF dans la solution casein ou lambda ADN.

Incuber vwf pendant trois minutes ou lambda ADN pendant 45 minutes. Injectez ensuite cinq millimolaires de biotine libre pour bloquer l’excès de streptavidine. Chargez un millilitre de solution de blocage de la caséine dans une seringue et fixez-le dans une pompe à seringues.

Fixez ensuite une extrémité du tube à l’aiguille de seringue et coulez dans la solution pour enlever les bulles d’air. Environ trois minutes après l’injection gratuite de biotine, fixez l’autre extrémité du tube à l’entrée du dispositif microfluidique. Sélectionnez l’objectif de grossissement le plus élevé du microscope à fluorescence TIRF ou confocal.

Si nécessaire, ajouter une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif. Placez le dispositif microfluidique sur l’étape du microscope de sorte que le coverslip est rincé avec l’objectif. Démarrez la microscopie à champ lumineux et ajustez la mise au point de sorte que des caractéristiques telles que les débris et les bulles soient visibles.

Ajustez ensuite la scène dans les directions X et Y jusqu’à ce que le bord du canal microfluidique soit visible et coupe le cadre en deux. Passez au canal FITC et ajustez le niveau Z et l’angle TIRF au besoin jusqu’à ce que les molécules globulaires vertes individuelles puissent être distinguées. Ajustez l’intensité du laser et le temps d’exposition pour visualiser les molécules fluorescentes sans les photobleaching trop rapidement.

Ajustez ensuite le contraste pour mieux visualiser les molécules. Exactement cinq minutes après le début de l’injection gratuite de biotine et l’arrêt du flux de la pompe à seringues pour observer les changements dans la conformation moléculaire en utilisant des débits entre 5000 et 30.000 microlitres par heure. Avec VWF, il est essentiel d’appliquer au moins une petite quantité de flux, comme 30 secondes de 10 000 microlitres par heure exactement cinq minutes après l’injection gratuite de biotine.

Répétez cette activité dans diverses zones du dispositif microfluidique et localisez les molécules qui peuvent s’étendre et se détendre sur plusieurs cycles de démarrage et d’arrêt du débit. Notez combien de temps il faut aux molécules pour atteindre l’extension maximale et la relaxation complète et enregistrer des vidéos du comportement continu des molécules sous le flux de cisaillement. La flexibilité d’une molécule pour changer la confirmation est souvent démontrée par sa capacité à s’allonger à mesure que des taux de cisaillement plus élevés sont appliqués en raison de l’augmentation du débit.

La courbe de taux d’extension par rapport au cisaillement d’une molécule de facteur von Willebrand est utile pour caractériser les propriétés biomécaniques de la protéine. Les images de microscopie de fluorescence de l’ADN de lambda montrent également l’extension accrue sur des taux plus élevés de cisaillement à 30 secondes et la relaxation graduelle plus de deux minutes après que le flux soit arrêté. Lorsque vous travaillez avec VWF, n’oubliez pas de l’incuber seulement pendant trois minutes et de libérer la biotine pendant cinq minutes avant de commencer le flux.

Ceci est essentiel pour former le nombre optimal ou les liens biotine-streptavidine nécessaires pour le dénouement réversible. Cette méthode peut être adaptée pour visualiser les interactions en temps réel entre plusieurs biomolécules et caractériser leurs fonctions. Par exemple, on pourrait mieux comprendre la formation de bouchons de plaquettes en visualisant VWF démêler sous le cisaillement élevé et sa liaison avec la molécule d’adhérence plaquettaire GPIb-alpha avec cette méthode.