Essai combiné de formation conditionnelle et de formation de sphère adapté pour étudier un gène associé à la stemness des cellules souches du cancer gastrique dérivés par le patient

Les cellules souches cancéreuses sont impliquées dans la métastase rechute du cancer sur la résistance aux médicaments. Ce protocole fournit une méthode efficace pour étudier les fonctions des gènes clés dans les cellules souches cancéreuses. À l’aide d’un système de knockdown conditionnel et d’un test de formation de sphère adapté, cette méthode est facilement adaptée pour étudier les fonctions in vitro et in vivo sur les gènes associés à la stemness dans différents types de cellules souches cancéreuses.

La démonstration de la procédure sera Yuting Li et Xiangyu Tan, assistants de recherche de mon laboratoire. Pour générer des particules de lentivirus, les graines de quatre millions de cellules d’emballage lentiviral 293T dans une boîte petri de 100 millimètres avec 10 millilitres de DMEM complétés par 10% FBS. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone, en s’assurant que les cellules sont 50 à 80% confluent le jour de la transfection.

Apporter un sérum réduit à température moyenne à ambiante et préparer les tubes A et B selon les directives manuscrites. Ajouter le contenu du tube A au tube B.Mélanger bien et incuber le tube pendant 15 minutes à température ambiante pour préparer des complexes lipidiques-ADN. Retirer cinq millilitres de milieu du plat de culture cellulaire.

Puis ajouter cinq millilitres du complexe lipidique-ADN dans le plat de culture cellulaire goutte sage et tourbillonner doucement le plat. Incuber le plat de culture pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après l’incubation, retirer soigneusement le milieu de transfection et le remplacer par 10 millilitres de DMEM préchauffé complété par 10% FBS.

Incuber les cellules pendant encore 24 heures. Environ 48 heures après la transfection, récoltez 10 millilitres de lentivirus contenant des supernatants et filtrez-les à l’aide d’un filtre à verser de 0,45 micromètre pour enlever les débris cellulaires. Tous les vaisseaux de culture cellulaire, les pointes, les filtres et les seringues peuvent contenir le lentivirus et doivent être traités avec 10% d’eau de Javel avant l’élimination.

Transférer un supernatant clarifié dans un contenant stérile. Ajouter le concentrateur Lenti-X et mélanger avec une inversion douce. Incuber le mélange à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, centrifugez l’échantillon à 1500 fois G pendant 45 minutes à quatre degrés Celsius. Retirez soigneusement le surnatant, en prenant soin de ne pas déranger la pastille au fond. Suspendre doucement la pastille en un millilitre de DMEM complétée par 10 % de FBS et la conserver à moins 80 degrés Celsius.

Graines 6 millions de cellules souches cancéreuses gastriques ou GCSC dans une boîte de 100 millimètres Petri avec 10 millilitres de DMEM complété par 10%FBS. Culture des cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Lorsque les cellules atteignent 70 à 80% de confluence, aspirer le milieu du plat et ajouter les particules lentivirales concentrées diluées avec quatre millimètres de milieu DMEM complet, contenant du réaccente polybrene.

Remettre les cellules dans l’incubateur pendant 18 heures. Le polybrene doit être testé dans différentes conditions pour déterminer la concentration effective, qui est habituellement de l’âge de deux à 10 milligrammes par millilitre. Après 18 heures, remplacer le milieu par 10 millilitres de DMEM par 10% FBS et retourner les cellules à l’incubateur pendant 24 heures.

Ensuite, aspirez le supernatant avec les débris cellulaires et ajoutez du DMEM frais complété par 10% FBS et 2,5 microgrammes par millilitre de Puromycine. Incuber les cellules pendant encore 24 heures. Ensuite, changer le milieu à nouveau en DMEM frais complété par 10%FBS et cinq microgrammes par millilitre Puromycine.

Après une autre incubation de 24 heures, rincer les CSGC adhérents deux fois avec cinq millilitres de DPBS sans calcium et magnésium. Dissocier les cellules avec un millilitre de solution de dissociation cellulaire préchauffée et les incuber pendant deux à trois minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de milieu de culture complet gcsc frais préchauffé à la suspension cellulaire.

Distribuez trois millilitres de cette suspension dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres pour la cryopréservation, et les trois autres millilitres dans un autre tube pour l’induction avec la doxycycline. Centrifugeuse les deux tubes à 800 fois G pendant cinq minutes. Ensuite, aspirez le supernatant du tube B et suspendez les cellules en un millilitre de milieu de culture complet gcsc frais préchauffé.

Ensemencer un nombre approprié de cellules dans une nouvelle boîte de Pétri de 100 millimètres avec 10 millilitres de milieu de culture complet gcsc frais préchauffé et 2,5 microgrammes par doxycycline millilitre. Ensuite, incuber le plat pendant 48 heures. Utilisez un compteur cellulaire automatisé pour déterminer la densité d’un échantillon de cellules de 10 microlitres.

Ensuite, ajustez le volume avec le milieu de culture complet du GCSC préchauffé pour obtenir une concentration de 20 000 cellules viables par millilitre. Distribuez 100 microlitres de la suspension cellulaire dans chaque puits d’une nouvelle plaque de culture de puits à fixation ultra faible 96. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.

La formation de la sphère devrait se produire dans les trois à dix jours. Image de la formation de sphère de tumeur tous les deux jours. Des cellules souches gastriques de cancer de l’adénocarcinome gastrique humain primaire ont été cultivés dans le milieu libre de culture de sérum.

Après six jours, les cellules se sont développées de la cellule unique comme le phénotype à de grandes sphères. Pour évaluer la fonction de la clusterine dans les CGCC, des séquences courtes d’ARN en épingle à cheveux contre la clusterine ont été clonées dans le vecteur Tet-GV307-RFP-Puro. Les cellules transfectées avec le vecteur d’expression ont été traitées avec de la doxycycline pendant 48 heures.

Ensuite, l’expression de clusterin a été vérifiée par tache occidentale et quantifiée par densitométrie. La présence de doxycycline et le knockdown de clusterin dans les GCSCs ont empêché la formation de sphère de tumeur. Tandis qu’aucune inhibition de la formation de sphère de tumeur n’a été observée dans les cellules transduced avec les contrôles brouillés de shRNA, indiquant que la doxycycline seule n’a pas empêché la formation de sphère de tumeur.

Ces résultats suggèrent qu’après le silencing de clusterin, les GCSCs se développent lentement et ne peuvent pas former des sphères de tumeur. Sur la base de ces données, la clusterine joue un rôle essentiel dans la promotion de l’activité d’auto-renouvellement des CSGC, ce qui indique qu’elle pourrait être une cible prometteuse pour la suppression des cellules souches cancéreuses chez les patients atteints de cancer gastrique. Les sphères de tumeurs devraient être des structures rondes solides sur des cellules individuelles ou agrégées, ne devraient pas être considérées des sphères de tumeur.

Cependant, certaines cellules souches cancéreuses peuvent ne pas former des structures typiques de sphère de tumeur. Cette procédure peut être suivie avec d’autres méthodes pour examiner les cellules souches cancéreuses pour le potentiel renouvelable in vitro. Par exemple, l’expression de marqueurs liés à la stemness peut être étudiée.

Le protocole peut être étendu pour étudier les fonctions des gènes critiques dans les cellules souches cancéreuses telles que la stemness sur la survie.