Name: Identification des récepteurs de surface cellulaire à l’aide d’écrans génétiques CRISPR/Cas9 à l’échelle du génome (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Découvrez une méthode de criblage génétique CRISPR/Cas9 à l'échelle du génome pour identifier les interactions récepteur-ligand en surface cellulaire. Cette approche sans biais permet d'étudier les processus de signalisation et de reconnaissance cellulaires.

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Ce travail a été soutenu par le numéro de subvention Wellcome Trust 206194 attribué à GJW. Nous remercions l’installation Cytometry Core : Bee Ling Ng, Jennifer Graham, Sam Thompson et Christopher Hall pour l’aide de FACS.

<ol><li>Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+initiation+in+biological+systems%3A+the+properties+and+detection+of+transient+extracellular+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+bioSystems%22%5BJournal%5D)">Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions.</a> Molecular bioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).</li>
<li>van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+intercellular+adhesion%3A+the+importance+of+weak+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Transient intercellular adhesion: the importance of weak protein-protein interactions.</a> Trends in Biochemical Sciences. 19 (9), 354-358 (1994).</li>
<li>Wood, L., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+identify+extracellular+receptor-ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Approaches to identify extracellular receptor-ligand interactions.</a> Current Opinion in Structural Biology. 56, 28-36 (2019).</li>
<li>Bushell, K. M., Söllner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screening+for+novel+low-affinity+extracellular+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions.</a> Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).</li>
<li>Visser, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extracellular+biochemical+screen+reveals+that+FLRTs+and+Unc5s+mediate+neuronal+subtype+recognition+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An extracellular biochemical screen reveals that FLRTs and Unc5s mediate neuronal subtype recognition in the retina.</a> eLife. 4, e08149(2015).</li>
<li>Özkan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extracellular+interactome+of+immunoglobulin+and+LRR+proteins+reveals+receptor-ligand+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An extracellular interactome of immunoglobulin and LRR proteins reveals receptor-ligand networks.</a> Cell. 154 (1), 228-239 (2013).</li>
<li>Martinez-Martin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Unbiased+Screen+for+Human+Cytomegalovirus+Identifies+Neuropilin-2+as+a+Central+Viral+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An Unbiased Screen for Human Cytomegalovirus Identifies Neuropilin-2 as a Central Viral Receptor.</a> Cell. 174 (5), 1158-1171 (2018).</li>
<li>Bianchi, E., Doe, B., Goulding, D., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juno+is+the+egg+Izumo+receptor+and+is+essential+for+mammalian+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Juno is the egg Izumo receptor and is essential for mammalian fertilization.</a> Nature. 508 (7497), 483-487 (2014).</li>
<li>Mullican, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFRAL+is+the+receptor+for+GDF15+and+the+ligand+promotes+weight+loss+in+mice+and+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">GFRAL is the receptor for GDF15 and the ligand promotes weight loss in mice and nonhuman primates.</a> Nature Medicine. 23 (10), 1150-1157 (2017).</li>
<li>Turner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+malaria+is+associated+with+parasite+binding+to+endothelial+protein+C+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Severe malaria is associated with parasite binding to endothelial protein C receptor.</a> Nature. 498 (7455), 502-505 (2013).</li>
<li>Frei, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+identification+of+ligand-receptor+interactions+on+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Direct identification of ligand-receptor interactions on living cells and tissues.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 997-1001 (2012).</li>
<li>Sobotzki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HATRIC-based+identification+of+receptors+for+orphan+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">HATRIC-based identification of receptors for orphan ligands.</a> Nature Communications. 9 (1), 1519(2018).</li>
<li>Sharma, S., Petsalaki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+CRISPR-Cas9+Based+Genome-Wide+Screening+Approaches+to+Study+Cellular+Signalling+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li>
<li>Gebre, M., Nomburg, J. L., Gewurz, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+Genetic+Analysis+of+Virus-Host+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 Genetic Analysis of Virus-Host Interactions.</a> Viruses. 10 (2), (2018).</li>
<li>Zotova, A., Zotov, I., Filatov, A., Mazurov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+antigen+specificity+of+a+monoclonal+antibody+using+genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+library%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Determining antigen specificity of a monoclonal antibody using genome-scale CRISPR-Cas9 knockout library.</a> Journal of Immunological Methods. 439, 8-14 (2016).</li>
<li>Puschnik, A. S., Majzoub, K., Ooi, Y. S., Carette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR+toolbox+to+study+virus-host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR toolbox to study virus-host interactions.</a> Nature Reviews. Microbiology. 15 (6), 351-364 (2017).</li>
<li>Kerr, J. S., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidity-based+extracellular+interaction+screening+%28AVEXIS%29+for+the+scalable+detection+of+low-affinity+extracellular+receptor-ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Avidity-based extracellular interaction screening (AVEXIS) for the scalable detection of low-affinity extracellular receptor-ligand interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3881(2012).</li>
<li>Tzelepis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR+Dropout+Screen+Identifies+Genetic+Vulnerabilities+and+Therapeutic+Targets+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A CRISPR Dropout Screen Identifies Genetic Vulnerabilities and Therapeutic Targets in Acute Myeloid Leukemia.</a> Cell Reports. 17 (4), 1193-1205 (2016).</li>
<li>Sharma, S., Bartholdson, S. J., Couch, A. C. M., Yusa, K., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+identification+of+cellular+pathways+required+for+cell+surface+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Genome-scale identification of cellular pathways required for cell surface recognition.</a> Genome Research. 28 (9), 1372-1382 (2018).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+pooled+CRISPR+genetic+screens+using+MAGeCKFlute%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of pooled CRISPR genetic screens using MAGeCKFlute.</a> Nature Protocols. 14 (3), 756-780 (2019).</li>
<li>R Core team. A language and environment for statistical computing. , http://www.R-project.org (2013).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Design+of+Genome-Wide+CRISPR%2FSpCas9+Knockout+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knockout Screens.</a> G3. 7 (8), 2719-2727 (2017).</li>
<li>Kuleshov, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichr%3A+a+comprehensive+gene+set+enrichment+analysis+web+server+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update.</a> Nucleic Acids Research. 44 (W1), W90-W97 (2016).</li>
<li>Crosnier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basigin+is+a+receptor+essential+for+erythrocyte+invasion+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Basigin is a receptor essential for erythrocyte invasion by Plasmodium falciparum.</a> Nature. 480 (7378), 534-537 (2011).</li>
<li>Kirk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD147+is+tightly+associated+with+lactate+transporters+MCT1+and+MCT4+and+facilitates+their+cell+surface+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">CD147 is tightly associated with lactate transporters MCT1 and MCT4 and facilitates their cell surface expression.</a> The EMBO Journal. 19 (15), 3896-3904 (2000).</li>
<li>Chong, Z. S., Ohnishi, S., Yusa, K., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pooled+extracellular+receptor-ligand+interaction+screening+using+CRISPR+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Pooled extracellular receptor-ligand interaction screening using CRISPR activation.</a> Genome Biology. 19 (1), 205(2018).</li>
<li>van der Meer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Model+Passports-a+hub+for+clinical%2C+genetic+and+functional+datasets+of+preclinical+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cell Model Passports-a hub for clinical, genetic and functional datasets of preclinical cancer models.</a> Nucleic Acids Research. 47 (D1), D923-D929 (2019).</li>
<li>Bausch-Fluck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometric-derived+cell+surface+protein+atlas%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometric-derived cell surface protein atlas.</a> PloS One. 10 (3), e0121314(2015).</li>
<li>Behan, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prioritization+of+cancer+therapeutic+targets+using+CRISPR-Cas9+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prioritization of cancer therapeutic targets using CRISPR-Cas9 screens.</a> Nature. 568 (7753), 511-516 (2019).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Une stratégie de dépistage basée sur CRISPR pour identifier les gènes codant des composants cellulaires impliqués dans la reconnaissance cellulaire est décrite. Une approche similaire utilisant l’activation CRISPR fournit également une alternative génétique pour identifier les récepteurs directement interagissant des protéines recombinantes sans avoir besoin de générer de grandes bibliothèques de protéines26. Cependant, un avantage majeur de cette approche est qu’elle s’applique aux interactions négociées par des molécules de surface affichées localement sur la cellule et ne dépend pas de la surexpression des récepteurs, ce qui peut influencer l’avidité contraignante du récepteur. Contrairement à d’autres méthodes, cette technique ne fait donc aucune hypothèse concernant la nature biochimique ou la biologie cellulaire des récepteurs et offre l’occasion d’étudier les interactions médiatisées par des protéines qui sont normalement difficiles à étudier à l’aide d’approches biochimiques, telles que les très grandes protéines, ou celles qui traversent la membrane plusieurs fois ou forment des complexes avec d’autres protéines, et des molécules autres que des protéines telles que les glycans, les glycolipids et les phosphospholipides. Compte tenu de la nature à l’échelle du génome de la méthode, cette approche a également l’avantage non seulement d’identifier le récepteur, mais aussi d’autres composants cellulaires qui sont nécessaires pour l’événement contraignant, fournissant ainsi un aperçu de la biologie cellulaire du récepteur.
Une des principales limites de cette méthode lors de son utilisation pour identifier le récepteur d’une protéine orpheline est l’exigence initiale d’identifier d’abord une lignée cellulaire qui se lie à la protéine. Ce n’est pas toujours facile et l’identification d’une lignée cellulaire qui affiche un phénotype de liaison qui est également permissif aux écrans génétiques peut être l’étape limite de temps pour le déploiement de cet essai. Certaines lignées cellulaires ont tendance à se lier à plus de protéines que d’autres. Ceci est particulièrement pertinent pour les protéines qui lient HS, parce que ces protéines ont tendance à se lier à n’importe quelle lignée cellulaire qui affiche des chaînes latérales HS, indépendamment du contexte de liaison indigène. En outre, nous avons observé que l’amélioration de la réglementation des syndécans (c’est-à-dire les protéoglycans qui contiennent du HS) dans les lignées cellulaires conduit à une liaison accrue des protéines HS-contraignantes26. Cela pourrait être un facteur à prendre en considération lors de la sélection de la ligne cellulaire pour le dépistage. Cependant, il est également important de noter que la liaison additive de HS n’interfère pas avec la liaison à un récepteur spécifique. Cela signifie que si la liaison est observée, il est possible qu’elle soit négociée uniquement par HS parce que la liaison négociée par HS dans cet essai est additive plutôt que codépendant19. Dans un tel scénario, l’approche de blocage de l’héparine décrite peut identifier de tels comportements sans avoir besoin d’effectuer un écran génétique complet.
Une ressource utile pour le choix des lignées cellulaires est Cell Model Passport, qui contient de la génomique, de la transcriptomique et de l’information sur l’état de la culture pour 1 000 lignées de cellules cancéreuses27. Selon le contexte biologique, les cellules peuvent être choisies en fonction de leurs profils d’expression. Pour faciliter la sélection des lignées cellulaires, nous avons regroupé 1 000 lignées cellulaires dans Cell Model Passport selon l’expression de 1 500 glycoprotéines de surface des cellules humaines préannotées28 (figure supplémentaire 2; des informations de cluster pour chaque lignée cellulaire ainsi que des conditions de croissance sont fournies dans le tableau supplémentaire 2). Lors de l’essai de la liaison d’une protéine avec une fonction inconnue, il est utile de sélectionner un panel de lignées cellulaires représentatives de chaque cluster pour augmenter les chances de couvrir un large éventail de récepteurs. Étant donné le choix, il est recommandé de choisir des lignées cellulaires faciles à culture et faciles à transduire. Comme ces lignées cellulaires seront utilisées dans le criblage à l’échelle du génome, il est préférable qu’elles puissent être cultivées facilement en grandes quantités et sont permissives à la transduction lentivirale, parce qu’il s’agit de la méthode la plus couramment disponible pour la livraison du sgRNA pour le dépistage génétique à base de CRISPR dans les étapes ultérieures.
En général, les sélections de phénotypes sont effectuées en une seule sorte. Cependant, cela est déterminé par la luminosité de la population de cellules tachées par rapport au contrôle. Des rondes itératives de sélections pourraient être adoptées pour des scénarios dans lesquels le rapport signal-bruit du phénotype désiré est faible, ou lorsque le but de l’écran est d’identifier les mutants qui ont des phénotypes forts. Lors de l’utilisation d’une approche de sélection itérative pour les écrans à base de FACS, il est important de considérer que le processus de tri peut causer la mort cellulaire, principalement en raison de la force pure du trieur. Ainsi, toutes les cellules collectées ne seront pas représentées dans la prochaine série de tri.
La complexité de la bibliothèque est un facteur très important dans l’exécution des écrans génétiques réussis, en particulier pour les écrans de sélection négatifs parce que l’ampleur de l’épuisement dans ceux-ci ne peut être déterminée qu’en comparant les résultats à ce qui était présent dans la bibliothèque de départ. Pour les écrans de sélection négatifs, il est courant de maintenir des bibliothèques de 500 à 1 000 x complexité. Les écrans de sélection positifs, cependant, sont plus robustes pour les tailles de bibliothèque, parce que dans ces écrans seulement un petit nombre de mutants sont censés être sélectionnés pour un phénotype particulier. Par conséquent, dans l’écran de sélection positif décrit ici, la taille de la bibliothèque peut être réduite à la complexité 50-100x sans compromettre la qualité de l’écran. En outre, dans ces écrans, il est également possible d’utiliser une bibliothèque de contrôle pour une ligne cellulaire donnée un jour donné comme un « contrôle général » pour tous les échantillons triés le jour pour cette ligne cellulaire donnée. Cela réduira le nombre de bibliothèques de contrôle qui doivent être produites et séquencées.
Une autre considération importante pour l’utilisation de cette approche est les limites des écrans de perte de fonction dans l’identification des gènes qui sont essentiels pour la croissance des cellules in vitro. Le moment des écrans est crucial à cet égard, car plus les cellules mutantes sont maintenues dans la culture, plus la probabilité que les cellules avec des mutations dans les gènes essentiels deviennent non viables et ne sont plus représentés dans la bibliothèque mutante. Les récents tests génétiques effectués dans le cadre de l’initiative Project Score dans plus de 300 lignées cellulaires montrent que plusieurs gènes de la sécrétion de protéines annotée keGG et de la voie de la N-glycosylation sont souvent identifiés comme étant essentiels pour un certain nombre de lignées cellulaires(figure supplémentaire 3)29. Cela peut être pris en considération lors de la conception des écrans si l’effet des gènes nécessaires à la prolifération et la viabilité doit être étudié dans le cadre du processus de reconnaissance cellulaire. Dans ce cas, l’exécution d’écrans à un point d’heure précoce (p. ex., posttransduction du jour 9) serait généralement appropriée. Toutefois, si l’approche est utilisée pour identifier quelques cibles ayant de forts effets de taille plutôt que des voies cellulaires générales, il pourrait être approprié d’effectuer des écrans à un moment ultérieur (p. ex., posttransduction du jour 15-16).
Les résultats du dépistage sont très solides; dans huit écrans recombinés de liaison de protéine exécutés dans le passé, le récepteur de surface de cellules a été le coup supérieur dans chaque cas19. Lorsque vous utilisez cette approche pour identifier le partenaire d’interaction, il faut donc s’attendre à ce que le récepteur et les facteurs contribuant à sa présentation à la surface soient identifiés avec une confiance statistique élevée. Une fois que l’écran est exécuté et qu’un coup est validé à l’aide d’un seul knock-out d’ARN, d’autres suivis peuvent être effectués à l’aide de méthodes biochimiques existantes telles que l’AVEXIS4 et la liaison saturable directe des protéines purifiées à l’aide d’une résonance plasmon de surface. L’approche décrite ici s’applique à toutes les protéines pour lesquelles il est possible de générer une sonde recombinante soluble.
En résumé, il s’agit d’une approche à élimination directe CRISPR à l’échelle du génome pour identifier les interactions négociées par les protéines de surface cellulaire. Cette méthode s’applique généralement pour identifier les voies cellulaires requises pour la reconnaissance de surface cellulaire dans un large éventail de contextes biologiques différents, y compris entre les propres cellules d’un organisme (p. ex., la reconnaissance neuronale et immunologique), ainsi qu’entre les cellules hôtes et les protéines pathogènes. Cette méthode offre une alternative génétique aux approches biochimiques conçues pour l’identification des récepteurs, et parce qu’elle ne nécessite aucune hypothèse préalable concernant la nature biochimique ou la biologie cellulaire des récepteurs, elle a un grand potentiel pour faire des découvertes complètement inattendues.

Les interactions extracellulaires par les protéines des récepteurs de surface cellulaire dirigent des processus biologiques importants tels que l’organisation des tissus, la reconnaissance hôte-pathogène et la régulation immunitaire. L’étude de ces interactions est d’intérêt pour l’ensemble de la communauté biomédicale, parce que les récepteurs membranaires sont des cibles exploitables de thérapeutiques systématiquement livrés tels que les anticorps monoclonaux. Malgré leur importance, l’étude de ces interactions reste techniquement difficile. C’est principalement parce que les récepteurs membranés sont amphipathiques, ce qui les rend difficiles à isoler des membranes biologiques pour la manipulation biochimique, et leurs interactions sont caractérisées par les affinités d’interaction faibles (KDs dans la gamme M-mM)1. Par conséquent, de nombreuses méthodes couramment utilisées ne sont pas adaptées pour détecter cette classe d’interactions protéiques1,2.
Une gamme de méthodes a été développée pour étudier spécifiquement les interactions extracellulaires de récepteur-ligand qui prennent leurs propriétés biochimiques uniques en considération3. Un certain nombre de ces approches consistent à exprimer l’ectodomain entier d’un récepteur comme protéine recombinante soluble dans les systèmes à base de mammifères ou d’insectes à base de cellules pour s’assurer que ces protéines contiennent des modifications posttranslationnelles qui sont structurellement importantes, telles que les glycanes et les liens de disulfide. Pour surmonter la liaison de faible affinité, les ectodomains sont souvent oligomés pour augmenter leur avidité liante. Les ectodomains de protéine avide ont été utilisés avec succès comme sondes contraignantes pour identifier les partenaires d’interaction dans les écrans d’interaction protéine-protéine recombinants directs4,5,6,7. Bien que largement réussies, les méthodes recombinantes à base de protéines exigent que l’ectodomain d’un récepteur membranaire soit produit comme protéine soluble. Par conséquent, il ne s’applique généralement qu’aux protéines qui contiennent une région extracellulaire contigue (p. ex., le type I, le type II ou l’IPG) et ne convient généralement pas aux complexes de récepteurs et aux protéines membranaires qui couvrent la membrane plusieurs fois.
Les techniques de clonage d’expression dans lesquelles une bibliothèque de DNA complémentaires (ACS) est transposée en cellules et testées pour un phénotype de gain-of-binding ont également été employées pour identifier les interactions extracellulaires protéine-protéine8. La disponibilité de grandes collections de plasmides d’expression cDNA clonés et séquencés ces dernières années a facilité les méthodes dans lesquelles les lignées cellulaires surexprimant les CDNA codant les récepteurs de surface cellulaire sont examinés pour la liaison des protéines recombinantes pour identifier les interactions9,10. Les approches basées sur la cDNA, contrairement aux méthodes recombinantes à base de protéines, offrent la possibilité d’identifier les interactions dans le contexte de la membrane plasmatique. Cependant, le succès de l’utilisation des constructions d’expression cDNA dépend de la capacité des cellules à surexprimer la protéine sous la forme correctement pliée, mais cela nécessite souvent des facteurs d’accessoires cellulaires tels que les transporteurs, les chaperons, et l’assemblage oligomeric correct. Transfecter une seule CDNA pourrait donc ne pas suffire à obtenir l’expression de la surface cellulaire.
Les techniques de criblage à l’aide de constructions d’ADN ou de sondes de protéines recombinantes exigent de grandes collections de bibliothèques de protéines cDNA ou recombinantes. Des méthodes basées sur la spectrométrie de masse spécialement conçues ont été utilisées récemment pour identifier les interactions extracellulaires qui ne nécessitent pas l’assemblage de grandes bibliothèques. Cependant, ces techniques nécessitent une manipulation chimique de la surface cellulaire, qui peut modifier la nature biochimique des molécules présentes à la surface des cellules et ne sont actuellement applicables que pour les interactions négociées par des protéines glycosylated11,12. La majorité des méthodes actuellement disponibles se concentrent également fortement sur les interactions entre les protéines tout en ignorant largement la contribution du microenvironnement membranaire, y compris des molécules telles que les glycanes, les lipides et le cholestérol.
Le développement récent d’un ciblage bialléléique très efficace à l’aide d’approches basées sur CRISPR a permis aux bibliothèques à l’échelle du génome de cellules dépourvues de gènes définis dans un seul bassin qui peut être examiné de manière systématique et impartiale pour identifier les composants cellulaires impliqués dans différents contextes, y compris la dissection des processus de signalisation cellulaire, l’identification des perturbations qui confèrent une résistance aux médicaments, toxines et agents pathogènes, et la détermination de la spécificité des anticorps13,14,15,16. Ici, nous décrivons un essai de dépistage par KO à l’échelle du génome à base de CRISPR qui offre une alternative aux approches biochimiques actuelles pour identifier les interactions extracellulaires de récepteur-ligand. Cette approche d’identification des interactions négociées par les récepteurs membranaires par des écrans génétiques est particulièrement adaptée aux chercheurs qui ont un intérêt ciblé sur les ligands individuels, car il évite la nécessité de compiler de grandes bibliothèques de cDNA ou de protéines recombinantes.
Cet essai se compose de trois étapes majeures : 1) Des sondes de liaison de protéine recombinantes très avides composées des régions extracellulaires d’un récepteur d’intérêt sont produites et utilisées dans les essais de liaison à base de cytométrie de débit à base de fluorescence ; 2) Les essais de liaison sont employés pour identifier une ligne cellulaire qui exprime le partenaire d’interaction de la sonde de protéine recombinante ; 3) Une version Cas9-exprimant de la lignée cellulaire qui interagit avec la protéine d’intérêt est produite et un écran à élimination directe à l’échelle du génome CRISPR/Cas9 est effectué(figure 1). Dans cet écran génétique, la liaison d’une protéine recombinante aux lignées cellulaires est utilisée comme phénotype mesurable dans lequel les cellules de la bibliothèque knock-out qui ont perdu la capacité de lier la sonde sont triées à l’aide de tri cellulaire activé à base de fluorescence (FACS) et les gènes qui ont causé la perte du phénotype de liaison identifié par le séquençage. En principe, les gènes codant le récepteur responsable de la liaison de la sonde avide et ceux requis pour son affichage de surface cellulaire sont identifiés.
La première étape de ce protocole implique la production de sondes de protéines recombinantes avides représentant l’ectodomain des récepteurs liés à la membrane. Ces récepteurs sont connus pour conserver fréquemment leurs fonctions de liaison extracellulaire lorsque leurs ectodomains sont exprimés comme une protéine soluble recombinante1. Pour une protéine d’intérêt, les protéines recombinantes solubles peuvent être produites dans n’importe quel système approprié d’expression des protéines eucaryotes dans n’importe quel format à condition qu’il puisse être oligoméized pour une avidité contraignante accrue, et il contient des étiquettes qui peuvent être utilisées dans les essais de liaison à base de cytométrie de flux à base de fluorescence (par exemple, FLAG-tag, biotin-tag). Des protocoles détaillés pour la production d’ectodomains solubles de récepteurs membranaires utilisant le système d’expression protéique HEK293, ainsi que différentes techniques de multimerisation et les constructions d’expression protéinées pour la production de protéines pentamériques et de protéines monomériques ont été précédemment décrites1,17. Le protocole ici décrira les étapes pour générer des sondes fluorescentes avides à partir de protéines biotinylated monomériques en les conjuguant à la streptavidin conjuguée à un fluorochrome (par exemple, la phycoerythrine, ou PE), qui peut être utilisé directement dans les essais de liaison à base de cellules et a l’avantage de ne pas avoir besoin d’un anticorps secondaire pour la détection. Les protocoles généraux pour l’exécution des écrans à l’échelle du génome ont déjà été décrits20,21, de ce fait, le protocole se concentre principalement sur les spécificités de l’exécution des écrans de liaison de protéines recombinantes à base de cytométrie d’écoulement à l’aide du système de dépistage à élimination directe CRISPR/Cas9 à l’aide de la bibliothèque human V1 (« Yusa »)18.

<table><tbody><tr><td>Anti-phosphatase alcaline</td><td>de souris Sigma</td><td>A4656</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidine</td><td>Chem-Cruz</td><td>SC-204655</td><td></td></tr><tr><td>Sang & Maxi Kit Maxi de Culture Cellulaire</td><td>Qiagen</td><td>13362</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>Diéthanolamine</td><td>Sigma</td><td>398179</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Kit Sang et Tissus</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-96 Aimant latéral</td><td>Invitrogen</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T emballage cellules</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Héparine</td><td>Sigma</td><td>H4784-1G</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>Kapa</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine LTX avec réactif PLUS</td><td>Invitrogen</td><td>15338100</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo XDP trieur de cellules</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni2+-NTA billes d’agarose</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-501-25</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps OX-68</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA1022R</td><td></td></tr><tr><td>p-nitrophényl phosphate</td><td>Sigma</td><td>1040-506</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes de dessalage-10</td><td></td> GE <td>healthcare 17085101</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Tubes en polypropylène avec lit de 5 mL</td><td>Qiagen</td><td>34964</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K, recombinante, PCR Grade</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2&times ; Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR kit de purification</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Filtre SCFA</td><td>Nalgene</td><td>190-2545</td><td></td></tr><tr><td>Sony Trieur de cellules</td><td>Sony</td><td></td><td></td></tr><tr><td>billes SPRI (billes Agencourt AMPure XP)</td><td>Beckman</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de microtitration enrobées de streptavidine</td><td>Nalgene</td><td>734-1284</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-PE</td><td>Biolegend</td><td>405204</td><td></td></tr></tbody></table>

identification des récepteurs de surface cellulaire à l’aide d’écrans génétiques crispr/cas9 à l’échelle du génome

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

La communication intercellulaire médiée par des interactions directes entre les récepteurs de surface des cellules intégrées par la membrane est cruciale pour le développement normal et le fonctionnement des organismes multicellulaires. La détection de ces interactions reste toutefois techniquement difficile. Ce manuscrit décrit une approche systématique de dépistage génétique CRISPR/Cas9 à l’échelle du génome qui révèle les voies cellulaires requises pour des événements spécifiques de reconnaissance de surface cellulaire. Cet essai utilise des protéines recombinantes produites dans un système d’expression protéique des mammifères comme sondes de liaison avides pour identifier les partenaires d’interaction dans un écran génétique à base de cellules. Cette méthode peut être utilisée pour identifier les gènes nécessaires aux interactions de surface cellulaire détectées par des sondes liants recombinantes correspondant aux ectodomains des récepteurs membranaires. Fait important, étant donné la nature à l’échelle du génome de cette approche, il a également l’avantage non seulement d’identifier le récepteur direct, mais aussi les composants cellulaires qui sont nécessaires pour la présentation du récepteur à la surface cellulaire, fournissant ainsi des informations précieuses sur la biologie du récepteur.

Ce manuscrit décrit une approche de dépistage à l’échelle du génome basée sur les cellules pour identifier les interactions extracellulaires de récepteur-ligand.

Identification des récepteurs de surface cellulaire à l’aide d’écrans génétiques CRISPR/Cas9 à l’échelle du génome

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

La détection des interactions de surface cellulaire à l’aide d’approches biochimiques actuellement disponibles pose encore des défis techniques. Ce protocole fournit une alternative génétique en utilisant l’approche de dépistage cellulaire à l’échelle du génome pour identifier les interactions ligand récepteur à la surface cellulaire. Contrairement à la plupart des autres méthodes existantes, cette méthode ne fait aucune hypothèse concernant la biologie des récepteurs.Il offre l’occasion d’identifier les interactions médiatisées par un large éventail de molécules de surface cellulaire. Les molécules de surface cellulaires sont directement accessibles aux médicaments tels que les anticorps monoclonaux. Par conséquent, l’identification des interactions médiatisées par ces molécules peut avoir d’importantes implications thérapeutiques.Cette méthode s’applique généralement aux chercheurs intéressés à explorer les processus cellulaires de signalisation et de reconnaissance dans un large éventail de contextes biologiques, y compris les interactions neuronales et immunologiques ainsi que les interactions avec les pathogènes hôtes. Le protocole nécessite une machine de tri cellulaire à haut débit et des machines de séquençage de prochaine génération. Assurez-vous que ces installations sont disponibles avant de commencer le protocole.Commencez par faire huit dilutions périodiques des échantillons de protéines biotinylées dans une plaque de 96 puits assurant que le volume final de chaque dilution est d’au moins 200 microlitres et qu’un contrôle tag-only est inclus. Faites une plaque en double des échantillons en enlevant 100 microlitres de chaque puits et en le transférant dans une nouvelle plaque de 96 puits. Incluez un contrôle des protéines uniquement qui sera utilisé comme sonde de contrôle dans tous les essais contraignants.Ajouter 100 microlitres de 0,1 microgramme par millilitre streptavidine-PE aux puits dans l’une des plaques, et 100 microlitres de tampon de dilution aux puits de l’autre plaque. Incuber la plaque pendant 20 minutes à température ambiante. Pendant ce temps, bloquer les puits de la plaque codée streptavidine avec le tampon de dilution pendant 15 minutes.Après avoir lavé l’assiette, assurez-vous qu’elle est sèche. Transférez ensuite le volume total de l’échantillon des deux plaques aux puits individuels de la plaque codée streptavidine et incubez-le pendant une heure à température ambiante. Après l’incubation, laver la plaque trois fois avec 200 microlitres de tampon de lavage.Ajouter 100 microlitres de souris anti-rat Cd4d3+4 IgG Et incuber la plaque pendant une autre heure. Répétez les lavages. Ajouter 100 microlitres d’une phosphatase alcaline anti-souris conjuguée et laisser la plaque à température ambiante pendant une heure.Lavez ensuite les puits trois fois avec un tampon de lavage et une fois avec un tampon de dilution. Préparer le phosphate de p-nitrophenyl à un milligramme par millilitre dans le tampon d’éthanolamine de colorant et ajouter 100 microlitres à chaque puits. Après une incubation de 15 minutes, mesurer l’absorption ont chacun bien à 405 nanomètres.Utilisez la dilution minimale à laquelle il n’y a pas de signal sur la plaque comme facteur de dilution approprié pour créer des tétramers. Incuber la streptavidine-PE et la dilution appropriée des protéines biotinylées pendant 30 minutes à température ambiante. Conservez ensuite les protéines conjuguées dans un tube protégé léger à quatre degrés Celsius jusqu’à nouvel usage.Faites tourner les tubes coniques avec les échantillons traités et de contrôle à 200 fois G pendant cinq minutes. Retirer le surnatant et congeler l’un des tubes à moins 20 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Suspendre à nouveau la pastille dans l’autre tube dans 10 millilitres de PBS avec 1%BSA et mettre de côté 100 microlitres de cellules comme un contrôle négatif sur une plaque de 96 puits.Ajouter ensuite la protéine recombinante préconjuguée à la suspension cellulaire dans le tube conique et dans la plaque de 96 puits. Effectuez la coloration cellulaire pendant au moins une heure à quatre degrés Celsius sur un rotor de banc avec rotation douce. Puis pelleter les cellules à 200 fois G pendant cinq minutes et enlever le surnatant.Après avoir lavé les cellules deux fois, suspendez-les en cinq millilitres de PBS. Filtrer les cellules à travers une passoire de 30 micromètres pour enlever les grappes cellulaires. Ensuite, analysez-les avec un flux Sodor.Utilisez l’échantillon de contrôle négatif pour la porte pour les cellules négatives BFP positives et PE. Puis trier l’échantillon et recueillir 500.000 à 1 million de cellules négatives BFP positives et PE dans un tube de centrifugation de 1,5 millilitre. La cage endolorie dépendra de la liaison des cellules à la protéine, mais normalement un à 5% des échantillons négatifs pe sont collectés.Maintenant, laissez les cellules triées en centrifugant pendant 500 fois G pendant cinq minutes, puis retirez soigneusement le supernatant. La pastille peut être stockée à moins 20 degrés Celsius jusqu’à six mois. Utilisez la fonction de compt compte de magie pour cartographier les séquences de la population non triée et triée à la bibliothèque de référence, ce qui donnera un fichier de compt compte brut.Exécutez la fonction d’essai de la magie en utilisant les dénombrements bruts de l’échantillon de contrôle non trié comme contrôle et les comptes de l’échantillon trié comme traitement. Ouvrez le fichier récapitulatif génétique généré et classez la colonne de classement de pause dans l’ordre ascendant. Identifiez ensuite les coups avec un faux taux de découverte inférieur à 0,05 point.Le récepteur est généralement classé très souvent dans la première position. Enfin utiliser R ou un logiciel équivalent pour tracer le score algorithme de classement robuste pour la sélection positive. Des écrans de knockdown d’échelle de génome pour l’identification du partenaire liant des cellules humaines TNFSF9 et P falciparum ou H5 de TNFSF9 humain et de P falciparum Rh5 ont été exécutés dans les cellules NCI-SNU-1 et HEC-293 respectivement.Le comportement contraignant de Rh5 a été affecté par le sulfate d’héparan et son récepteur connu BSG tandis que TN-FRSF-9 n’a pas perdu la liaison à son récepteur connu TN-FSF-9. Lors de la pré-incubation avec héparine soluble. La distribution du GNA dans la bibliothèque mutante de contrôle a révélé que la complexité de la bibliothèque a été maintenue tout au long de l’expérience.La qualité technique des écrans a été évaluée en examinant la distribution des changements de pli observés du ciblage par G-ARN d’un ensemble de référence de gènes non essentiels, par rapport à la distribution d’un ensemble de référence de gènes essentiels. De plus, l’enrichissement du niveau des sentiers a révélé que les voies essentielles prévues ont été identifiées et considérablement enrichies dans la population d’abandon scolaire. Lors de la comparaison de l’échantillon de contrôle à la bibliothèque plasmide d’origine.L’algorithme de classement robuste ou score RRA fournit une mesure dont les ARN G sont constamment classés plus haut que prévu. Dans l’écran pour TNFRSF9, le premier succès a été TNFSF9, qui est un partenaire de liaison connu. En outre, un certain nombre de gènes liés à la voie TP53 ont également été identifiés.Dans le cas de RH5, en plus du récepteur connu, et du gène requis pour la production de bâillons sulfated, le gène SLC16A1 a également été identifié. L’approche de dépistage est généralement très robuste et le récepteur en interaction directe devrait être classé sur la liste des gènes enrichis dans cet ordre de population. Il est crucial de valider les coups obtenus à partir de l’écran.Si l’interaction est médiée par des protéines, des approches biochimiques conçues pour étudier les interactions binaires des protéines protéiques, par exemple, pourraient être utilisées pour d’autres études de validation. En raison de la nature impartiale de cette approche à l’échelle du génome, nous prévoyons qu’elle aidera à explorer les interactions médiatisées par des molécules cellulaires difficiles à étudier comme les lipides, les protéines membranaires multipass et les glycanes. Il peut également révéler de nouvelles voies nécessaires pour le trafic de récepteurs et la biologie.

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JoVE Journal

Genetics

Génétique

La technique de génotypage décrit ici, qui couple de réaction en chaîne par polymérase fluorescente (PCR) à une électrophorèse sur gel capillaire, permet de génotypage à haut débit des clones knock-out à médiation par nuclease. Il évite les limitations rencontrées par d'autres techniques de génotypage et est plus rentable que les méthodes de séquençage.

L&#39;utilisation d&#39;un PCR-capillaire fluorescent Gel Electrophoresis Technique pour Génotype CRISPR / cas9 médiation Knockout Mutants dans un format à haut débit

Ce protocole décrit les étapes nécessaires pour concevoir et effectuer le ciblage multiplexé des rehausseurs avec la protéine de fusion désactivant SID4X-dCas9-KRAB, également connu sous le nom des interférences enhancer (Enhancer-i). Ce protocole permet l’identification des activateurs qui régulent l’expression des gènes et facilite la dissection des relations entre les exhausteurs de réglementer un gène cible commun.

Dissection de la fonction de Enhancer utilisant le Multiplex Enhancer CRISPR axée sur les interférences dans les lignées cellulaires

Nous présentons ici un protocole pour optimiser CRISPR-Cas9 pour parvenir à une plus grande spécificité sans la perte d’activité sur la cible. Nous utilisons une approche d’évolution dirigée appelée Sniper-écran pour trouver un mutant Cas9 avec les caractéristiques souhaitées. Sniper-Cas9 est compatible avec tronqué ARN simple-guide et livraison dans un format ribonucléoprotéines, célèbres stratégies pour atteindre les spécificités plus élevées.

À l’aide de Sniper-Cas9 pour minimiser les effets hors cible de CRISPR-Cas9 sans la perte d’activité sur la cible Via évolution dirigée

Une bibliothèque CRISPR/sgRNA a été appliquée à interroger des gènes codant pour des protéines. Toutefois, la faisabilité d’une bibliothèque de sgRNA afin de découvrir la fonction d’une limite de la FCCT dans la régulation des gènes reste inexplorée. Nous décrivons ici une bibliothèque de sgRNA spécifiques de locus HOX afin d’élucider la fonction des limites de la FCCT dans loci HOX .

HOX Locus Focused CRISPR/sgRNA bibliothèque préalable identifier critique FCCT limites

La technologie CRISPR-Cas9 fournit une méthode efficace pour modifier précisément le génome des mammifères dans n'importe quel type de cellule et représente un nouveau moyen d'effectuer des écrans génétiques à l'échelle du génome. Un protocole détaillé discutant des étapes requises pour la réussite des écrans CRISPR-Cas9 à l'échelle du génome sont fournis ici.

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La Biotinylation par illumination restreinte par localisation spécifique à AviTag (ALIBi) est une méthode novatrice activée par l’optogénétique développée pour marquer et purifier par affinité les populations subcellulaires de ribosomes pour le séquençage en aval et l’analyse protéomique.

Isolement des sous-populations de ribosomes subcellulaires basé sur la biotinylation enrichie par éclairage restreinte par peptide peptidique spécifique à la marque de recombinaison

Un obstacle important aux technologies comme CRISPR est les événements hors cible qui peuvent perturber les gènes vitaux. La « circularisation pour la notification in vitro des effets de clivage par séquençage » (CIRCLE-seq) est une technique conçue pour identifier les sites de clivage non intentionnels. Cette méthode cartographie l’activité à l’échelle du génome de CRISPR-Cas9 avec une sensibilité élevée et sans biais.

CIRCLE-Seq pour l’interrogation de l’édition de gènes hors cible

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Réalisation d’un criblage CRISPR in vitro à l’échelle du génome dans des cellules T à récepteur d’antigène chimérique

Ici, nous présentons un protocole qui intègre la technologie CRISPR/Cas9 avec le test Cell Counting Kit-8 (CCK-8) pour identifier les gènes candidats qui sont cruciaux pour la capacité de prolifération anormale des cellules souches hématopoïétiques et progénitrices.

Évaluation de gènes anormaux liés à la croissance de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques en combinant la technologie CRISPR/Cas9 avec le comptage cellulaire

Une approche méticuleuse et structurée est donnée pour sélectionner les gènes résistants et sensibles des rayonnements grâce à l’application d’une méthode de criblage CRISPR/Cas9 à l’échelle du génome. Ce protocole a également le potentiel de servir de cadre polyvalent pour d’autres efforts de recherche portant sur les mécanismes de résistance aux médicaments chimiques administrés cliniquement.

Écran CRISPR à l’échelle du génome pour dévoiler les gènes radiosensibles et radiorésistants

Nous avons développé un protocole optimisé de dépistage CRISPR-Cas9 pour les cellules CAR T primaires. En réduisant la transmission d’ADNgDNA par la digestion enzymatique et le pulldown des cassettes d’ARNsg, cette approche minimise les artefacts PCR, assurant une détection précise des sgRNA et une identification robuste des cibles géniques fonctionnelles.

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Découvrez une méthode de criblage génétique CRISPR/Cas9 à l'échelle du génome pour identifier les interactions récepteur-ligand en surface cellulaire. Cette approche sans biais permet d'étudier les processus de signalisation et de reconnaissance cellulaires.

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