Identification des récepteurs de surface cellulaire à l’aide d’écrans génétiques CRISPR/Cas9 à l’échelle du génome

La détection des interactions de surface cellulaire à l’aide d’approches biochimiques actuellement disponibles pose encore des défis techniques. Ce protocole fournit une alternative génétique en utilisant l’approche de dépistage cellulaire à l’échelle du génome pour identifier les interactions ligand récepteur à la surface cellulaire. Contrairement à la plupart des autres méthodes existantes, cette méthode ne fait aucune hypothèse concernant la biologie des récepteurs.

Il offre l’occasion d’identifier les interactions médiatisées par un large éventail de molécules de surface cellulaire. Les molécules de surface cellulaires sont directement accessibles aux médicaments tels que les anticorps monoclonaux. Par conséquent, l’identification des interactions médiatisées par ces molécules peut avoir d’importantes implications thérapeutiques.

Cette méthode s’applique généralement aux chercheurs intéressés à explorer les processus cellulaires de signalisation et de reconnaissance dans un large éventail de contextes biologiques, y compris les interactions neuronales et immunologiques ainsi que les interactions avec les pathogènes hôtes. Le protocole nécessite une machine de tri cellulaire à haut débit et des machines de séquençage de prochaine génération. Assurez-vous que ces installations sont disponibles avant de commencer le protocole.

Commencez par faire huit dilutions périodiques des échantillons de protéines biotinylées dans une plaque de 96 puits assurant que le volume final de chaque dilution est d’au moins 200 microlitres et qu’un contrôle tag-only est inclus. Faites une plaque en double des échantillons en enlevant 100 microlitres de chaque puits et en le transférant dans une nouvelle plaque de 96 puits. Incluez un contrôle des protéines uniquement qui sera utilisé comme sonde de contrôle dans tous les essais contraignants.

Ajouter 100 microlitres de 0,1 microgramme par millilitre streptavidine-PE aux puits dans l’une des plaques, et 100 microlitres de tampon de dilution aux puits de l’autre plaque. Incuber la plaque pendant 20 minutes à température ambiante. Pendant ce temps, bloquer les puits de la plaque codée streptavidine avec le tampon de dilution pendant 15 minutes.

Après avoir lavé l’assiette, assurez-vous qu’elle est sèche. Transférez ensuite le volume total de l’échantillon des deux plaques aux puits individuels de la plaque codée streptavidine et incubez-le pendant une heure à température ambiante. Après l’incubation, laver la plaque trois fois avec 200 microlitres de tampon de lavage.

Ajouter 100 microlitres de souris anti-rat Cd4d3+4 IgG Et incuber la plaque pendant une autre heure. Répétez les lavages. Ajouter 100 microlitres d’une phosphatase alcaline anti-souris conjuguée et laisser la plaque à température ambiante pendant une heure.

Lavez ensuite les puits trois fois avec un tampon de lavage et une fois avec un tampon de dilution. Préparer le phosphate de p-nitrophenyl à un milligramme par millilitre dans le tampon d’éthanolamine de colorant et ajouter 100 microlitres à chaque puits. Après une incubation de 15 minutes, mesurer l’absorption ont chacun bien à 405 nanomètres.

Utilisez la dilution minimale à laquelle il n’y a pas de signal sur la plaque comme facteur de dilution approprié pour créer des tétramers. Incuber la streptavidine-PE et la dilution appropriée des protéines biotinylées pendant 30 minutes à température ambiante. Conservez ensuite les protéines conjuguées dans un tube protégé léger à quatre degrés Celsius jusqu’à nouvel usage.

Faites tourner les tubes coniques avec les échantillons traités et de contrôle à 200 fois G pendant cinq minutes. Retirer le surnatant et congeler l’un des tubes à moins 20 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Suspendre à nouveau la pastille dans l’autre tube dans 10 millilitres de PBS avec 1%BSA et mettre de côté 100 microlitres de cellules comme un contrôle négatif sur une plaque de 96 puits.

Ajouter ensuite la protéine recombinante préconjuguée à la suspension cellulaire dans le tube conique et dans la plaque de 96 puits. Effectuez la coloration cellulaire pendant au moins une heure à quatre degrés Celsius sur un rotor de banc avec rotation douce. Puis pelleter les cellules à 200 fois G pendant cinq minutes et enlever le surnatant.

Après avoir lavé les cellules deux fois, suspendez-les en cinq millilitres de PBS. Filtrer les cellules à travers une passoire de 30 micromètres pour enlever les grappes cellulaires. Ensuite, analysez-les avec un flux Sodor.

Utilisez l’échantillon de contrôle négatif pour la porte pour les cellules négatives BFP positives et PE. Puis trier l’échantillon et recueillir 500.000 à 1 million de cellules négatives BFP positives et PE dans un tube de centrifugation de 1,5 millilitre. La cage endolorie dépendra de la liaison des cellules à la protéine, mais normalement un à 5% des échantillons négatifs pe sont collectés.

Maintenant, laissez les cellules triées en centrifugant pendant 500 fois G pendant cinq minutes, puis retirez soigneusement le supernatant. La pastille peut être stockée à moins 20 degrés Celsius jusqu’à six mois. Utilisez la fonction de compt compte de magie pour cartographier les séquences de la population non triée et triée à la bibliothèque de référence, ce qui donnera un fichier de compt compte brut.

Exécutez la fonction d’essai de la magie en utilisant les dénombrements bruts de l’échantillon de contrôle non trié comme contrôle et les comptes de l’échantillon trié comme traitement. Ouvrez le fichier récapitulatif génétique généré et classez la colonne de classement de pause dans l’ordre ascendant. Identifiez ensuite les coups avec un faux taux de découverte inférieur à 0,05 point.

Le récepteur est généralement classé très souvent dans la première position. Enfin utiliser R ou un logiciel équivalent pour tracer le score algorithme de classement robuste pour la sélection positive. Des écrans de knockdown d’échelle de génome pour l’identification du partenaire liant des cellules humaines TNFSF9 et P falciparum ou H5 de TNFSF9 humain et de P falciparum Rh5 ont été exécutés dans les cellules NCI-SNU-1 et HEC-293 respectivement.

Le comportement contraignant de Rh5 a été affecté par le sulfate d’héparan et son récepteur connu BSG tandis que TN-FRSF-9 n’a pas perdu la liaison à son récepteur connu TN-FSF-9. Lors de la pré-incubation avec héparine soluble. La distribution du GNA dans la bibliothèque mutante de contrôle a révélé que la complexité de la bibliothèque a été maintenue tout au long de l’expérience.

La qualité technique des écrans a été évaluée en examinant la distribution des changements de pli observés du ciblage par G-ARN d’un ensemble de référence de gènes non essentiels, par rapport à la distribution d’un ensemble de référence de gènes essentiels. De plus, l’enrichissement du niveau des sentiers a révélé que les voies essentielles prévues ont été identifiées et considérablement enrichies dans la population d’abandon scolaire. Lors de la comparaison de l’échantillon de contrôle à la bibliothèque plasmide d’origine.

L’algorithme de classement robuste ou score RRA fournit une mesure dont les ARN G sont constamment classés plus haut que prévu. Dans l’écran pour TNFRSF9, le premier succès a été TNFSF9, qui est un partenaire de liaison connu. En outre, un certain nombre de gènes liés à la voie TP53 ont également été identifiés.

Dans le cas de RH5, en plus du récepteur connu, et du gène requis pour la production de bâillons sulfated, le gène SLC16A1 a également été identifié. L’approche de dépistage est généralement très robuste et le récepteur en interaction directe devrait être classé sur la liste des gènes enrichis dans cet ordre de population. Il est crucial de valider les coups obtenus à partir de l’écran.

Si l’interaction est médiée par des protéines, des approches biochimiques conçues pour étudier les interactions binaires des protéines protéiques, par exemple, pourraient être utilisées pour d’autres études de validation. En raison de la nature impartiale de cette approche à l’échelle du génome, nous prévoyons qu’elle aidera à explorer les interactions médiatisées par des molécules cellulaires difficiles à étudier comme les lipides, les protéines membranaires multipass et les glycanes. Il peut également révéler de nouvelles voies nécessaires pour le trafic de récepteurs et la biologie.