Une méthode rapide pour l’imagerie multispectrale de fluorescence des sections de tissu congelé

Cette méthode est utile pour détecter et co-localisé plusieurs biomarqueurs en une seule cryosection, y compris des marqueurs qui ne sont normalement pas détectables dans les sections de paraffine. En utilisant cette méthode expérimentale de coloration, le temps de coloration est considérablement réduit et la méthode peut être effectuée dans n’importe quel laboratoire. La démonstration de cette méthode sera Dinesh Jaishankar.

Il est un postdoc qualifié du laboratoire, ainsi que le noyau d’évaluation de l’immunothérapie, gestionnaire des installations. Lors de la sélection des anticorps pour l’analyse, considérez les ensembles de filtres d’excitation et d’émission disponibles sur le système d’imagerie semi-automatisé. Et après avoir testé diverses combinaisons d’anticorps primaires conjugués fluorophore, préparer les fluorophores à utiliser de sorte que vous avez un chevauchement spectral minimal comme suggéré dans le tableau.

Pour la coloration multiplexe, préparer un cocktail d’anticorps avec des fluorophores compatibles à des délires optimaux prédéterminés, et ajouter le cocktail aux sections tissulaires d’intérêt. Pour une coloration à marqueur unique, ajouter l’anticorps conjugué primaire uniquement à la diapositive. Pour toutes les taches, inclure une lame non tachée de contrôle qui subit la même procédure de coloration sans l’ajout d’un anticorps conjugué primaire.

Après une incubation d’une heure à température ambiante protégée de la lumière, lavez les glissières deux fois avec du PBS pendant cinq minutes par lavage. Après le deuxième lavage, contre-tacher les toboggans tachés multiplexes avec dapi pendant sept minutes à température ambiante à l’abri de la lumière, suivie de deux lavages de cinq minutes dans PBS. Pour créer une bibliothèque spectrale, réglez la puissance de la lampe du système d’imagerie multispectral à 100% et ouvrez le logiciel d’exploitation du microscope.

Sélectionnez Modifier le protocole et le nouveau protocole. Entrez un nom de protocole et sélectionnez Fluorescence en mode imagerie. Ensuite, fournissez un nom d’étude, et chargez les diapositives tachées sur la scène.

Cliquez sur Modifier l’exposition et utilisez les options de mise au point automatique et d’exposition automatique pour ajuster les temps d’exposition et acquérir des instantanés pour les diapositives tachées simples. Après avoir imagerie des diapositives tachées unique, enregistrer le protocole. Et dans le logiciel d’apprentissage automatique sous l’onglet Build Library, chargez chaque image tachée.

Sélectionnez le plancher approprié et cliquez sur Extrait. Le logiciel extrairea automatiquement le signal fluorescent sélectionné dans le sol. Pour enregistrer la couleur extraite, cliquez sur Enregistrer pour stocker.

Un nouveau groupe peut être créé ou la couleur extraite peut être stockée à un groupe existant. Pour l’imagerie multispectrale, une fois que la bibliothèque spectrale a été créée et vérifiée, ajustez les temps de mise au point et d’exposition sur la diapositive tachée multiplexe comme démontré, et ouvrent des diapositives numérisées pour créer une nouvelle tâche. Fournissez un iD de diapositives et sélectionnez un protocole.

Sous la tâche, sélectionnez l’analyse complète de diapositives pour effectuer un balayage de diapositives entier sur la diapositive tachée multiplexe. Dans toute l’image de balayage de diapositives, sélectionnez les régions d’intérêt à travers l’image. Ces régions seront numérisées à l’aide des temps d’exposition précédemment définis sur la diapositive multiplexe à utiliser pour le démixage et l’analyse spectraux.

Dans le logiciel d’exploitation microscope, sélectionnez acquérir des champs MSI sous tâche, puis cliquez sur Process Slide pour acquérir des régions d’intérêt à un grossissement 20x. Une fois que les régions d’intérêt ont été acquises, dans le logiciel d’apprentissage automatique, cliquez sur Fichier et Ouvrez sous l’onglet analyse manuelle pour charger les images tachées multiplexes. Sélectionnez la source spectrale de la bibliothèque et cliquez sur Sélectionner les étages pour choisir la bibliothèque spectrale précédemment enregistrée.

Cliquez sur Fichier et Ouvrez pour charger l’image non tachée. Cliquez ensuite sur l’icône marqueur d’encre d’autofluorescence et tracez une ligne ou une région sur la diapositive non tachée pour identifier l’autofluorescence dans le tissu. Ensuite, sous l’onglet Modifier les marqueurs et les couleurs, assigner des noms pour chaque marqueur et cliquez sur Préparer tous.

Après avoir vérifié l’image spectrale non mélangée, dans le logiciel d’apprentissage automatique, sélectionnez la membrane du cytoplasme et les options de marqueurs du panneau. Et en utilisant le bouton ellipsis, sélectionnez utiliser ce signal pour trouver, pour configurer le marqueur pour détecter soit les noyaux, cytoplasme ou membrane. lorsqu’un marqueur cytoplasmique ou membranaire est choisi, sélectionnez l’utilisation du signal pour faciliter l’option de fractionnement nucléaire.

Le logiciel détectera et créera automatiquement des masques individuels pour le noyau, le cytoplasme et la membrane. Utilisez la vue pathologie pour un marqueur spécifique et les options de configuration dans le logiciel pour ajuster les masques, et cliquez sur Segment All pour créer une carte de segmentation cellulaire. Après la segmentation cellulaire, sélectionnez les marqueurs pour phénotyper les cellules positives.

En outre, sélectionnez au moins cinq cellules qui ne sont pas tachées avec le marqueur choisi pour phénotyper les cellules négatives. Cliquez ensuite sur Train Classifier pour former le logiciel pour détecter automatiquement toutes les cellules tachées avec les marqueurs sélectionnés dans l’image. Une carte phénotype sera créée.

Comme ces images le démontrent, des anticorps validés pour la cytométrie d’écoulement pourraient être utilisés pour visualiser la coloration des tissus à l’aide du filtre tunable en cristal liquide dans le système d’imagerie semi-automatisé. Ici, on peut observer une image spectrale non mélangée de l’amygdale humaine congelée qui inclut l’étiquetage des cellules B et des cellules proliférantes dans le centre germinal folliculaire, et la région inter folliculaire de T-cellule. L’option vues de pathologie permet la visualisation du modèle individuel de coloration pour chaque marqueur dans le tissu d’intérêt, suggérant que la méthode de coloration multiplexe et le travail d’imagerie spectrale sur le tissu congelé.

Comme démontré sur une section congelée de tumeur de souris, la formation image multispectrale peut également être employée pour visualiser la tumeur infiltrant des lymphocytes T, et d’autres lignées myéloïdes de cellules comprenant des macrophages associés de tumeur. Des cartes de segmentation cellulaire et de phénotype, ainsi que le nombre de cellules tachées pour chaque marqueur analysé par le logiciel peuvent être générées, ce qui démontre que le logiciel peut être utilisé pour quantifier la coloration multispectrale sur les tissus gelés. Pour quelqu’un de nouveau 6 à la technique, il est important d’obtenir de connaître les caractéristiques spécifiques de vos fluorochromes, et de préparer des diapositives de bibliothèque de qualité pour le démixage spectral avec chevauchement spectral minimal.

Il est également important d’effectuer la titration d’anticorps. À notre avis, cette méthode peut fournir des informations de chevet sur l’efficacité de l’immunothérapie pour le cancer et d’autres applications thérapeutiques, en particulier lorsque le moment est de l’essence.