Effet des formulations de larmes artificielles sur l’activité métabolique des cellules épithéliales cornéennes humaines après exposition à la dessiccation

L’objectif de ce protocole est d’évaluer dans un modèle in vitro si les formulations de larmes artificielles peuvent protéger les cellules épithéliales cornéennes humaines contre la dessiccation. Cette méthode peut être utilisée pour aider à identifier les formulations pour la sécheresse oculaire qui peuvent aider à protéger les personnes présentant des symptômes de sécheresse oculaire. Ce test utilise une mesure très sensible de détection de l’activité métabolique des cellules épithéliales cornéennes.

En conséquence, de petits changements dans la santé des cellules cornéennes dus à la dessiccation peuvent être détectés. Parisa Mirzapour, Nijani Nagaarudkumaran et Adeline Suko feront la démonstration de la procédure aujourd’hui. Commencez par cultiver des cellules épithéliales cornéennes humaines immortalisées dans des flacons enrobés de collagène avec 20 millilitres de DMEM/F12 contenant 10 % de sérum de bovin fœtal et 1 % de pénicilline/streptomycine à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, en changeant de milieu tous les deux à trois jours.

Une fois que les cellules sont presque confluentes, retirez le milieu de culture cellulaire et ajoutez quatre à six millilitres de milieu de dissociation cellulaire dans chaque flacon. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles se détachent, en les vérifiant périodiquement au microscope. Ajoutez deux à six millilitres de DMEM/F12 avec 10 % FBS dans chaque flacon et transférez le contenu dans un tube à centrifuger de 50 millilitres.

Centrifugez les cellules à 450 à 500 fois g pendant cinq minutes. Ensuite, aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un milieu préchauffé. Déterminez la concentration cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre et calculez le volume qui contient 100 000 cellules.

Ajoutez du milieu dans chaque puits d’une plaque de culture de collagène I de 48 puits, ainsi que le volume calculé de cellules, en vous assurant que le volume final dans chaque puits est de 0,5 millilitre. Ensuite, incubez les cellules pendant 24 heures. Pour la procédure de contrôle, retirez le milieu de culture des puits et traitez immédiatement les cellules avec 150 microlitres d’une formulation d’essai ou d’une solution de contrôle du milieu.

Ensuite, incubez les cellules pendant 30 minutes. Retirez la solution d’essai des cellules et ajoutez 0,5 millilitre de solution de colorant métabolique à 10 %. Incuber les cellules pendant encore quatre heures.

Après l’incubation, retirez 100 microlitres de solution de colorant de chaque puits et transférez-la dans une plaque à 96 puits. À l’aide d’un lecteur de plaques, mesurez la fluorescence de chaque puits, en réglant l’excitation à 540 nanomètres et l’émission à 590 nanomètres. Pour effectuer la procédure de récupération, incubez les cellules avec les solutions d’essai ou les témoins décrits précédemment.

Ajoutez ensuite 0,5 millilitre de média DMEM/F12 dans chaque puits. Incuber les cellules pendant 18 heures. Retirez ensuite le support et testez l’activité métabolique.

Pour effectuer la procédure de contrôle, retirez le milieu de culture des cellules de la plaque à 48 puits et traitez-les immédiatement avec la formulation d’essai ou la solution de contrôle du milieu. Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Après l’incubation, retirez les solutions d’essai des cellules et placez-les dans une chambre à 37 degrés Celsius et 45 % d’humidité pendant cinq minutes pour les dessécher.

Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de solution de colorant métabolique à 10 % et incubez les cellules pendant quatre heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après l’incubation, transférez 100 microlitres de la solution de colorant métabolique de chaque puits dans une plaque à 96 puits et mesurez la fluorescence. Pour effectuer la procédure de récupération, répétez le protocole décrit précédemment et incluez une incubation de 18 heures avec un milieu DMEM/F12 après l’étape de dessiccation.

Ensuite, effectuez une analyse statistique des données comme décrit dans le manuscrit du texte. Trois formulations de sécheresse oculaire ont été comparées pour leur effet sur la viabilité des cellules épithéliales cornéennes humaines. Les solutions un et deux ont eu un effet significatif sur l’activité métabolique des cellules avant la dessiccation.

Les cellules exposées à la première solution ont montré une baisse supplémentaire de l’activité métabolique cellulaire après une récupération de 18 heures, ce qui signifie qu’elles ont d’abord été blessées et que la blessure n’a pas été réparée. En comparaison, la solution 3 n’a eu qu’un effet léger sur l’activité métabolique des cellules épithéliales. En comparant la capacité de ces formulations de sécheresse oculaire contenant des lipides à protéger les cellules, il a été constaté que les solutions un et deux ne protégeaient pas les cellules contre le stress de dessiccation.

La troisième solution, cependant, offrait une certaine protection. Lorsque vous ensemencez les cellules dans des plaques enrobées de collagène, assurez-vous que la suspension cellulaire contient des cellules qui sont uniformément mélangées afin que chaque puits soit ensemencé avec le même nombre de cellules. La troisième solution a démontré une amélioration statistiquement significative de la viabilité cellulaire et de la protection contre le stress de dessiccation par rapport aux deux autres produits contenant des lipides.

Il est possible que l’huile minérale avec des phospholipides, ainsi que le HP-guar et le propylène glycol, permettent à la solution trois de fournir une protection contre l’hydratation aux cellules cornéennes et une réduction de l’évaporation lors de la dessiccation.