Name: Visualisation des récepteurs d’oestrogène dans les colons des souris atteints de la maladie de Crohn induite par le TNBS à l’aide de l’immunofluorescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Découvrez la visualisation des récepteurs d'œstrogène dans le colon de souris atteintes de la maladie de Crohn induite par le TNBS. Cette méthode d'immunofluorescence permet d'étudier le rôle des œstrogènes dans la santé colique.

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Les travaux ont été publiés grâce au soutien financier des autorités de l’Université de Lodz : vice-recteur à la recherche scientifique, vice-recteur à la coopération nationale et internationale et doyen de la Faculté de biologie et de protection de l’environnement. Damian Jacenik a été soutenu par des subventions (2017/24/T/NZ5/00045 et 2015/17/N/NZ5/00336) du Centre national des sciences, en Pologne.

Des études sur les animaux ont été menées avec le consentement du Comité local d’éthique (28/29/2016) conformément à la directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil du 22 septembre 2010, ainsi que des recommandations institutionnelles.
1. Modèle murin induit par TNBS de la maladie de Crohn
REMARQUE : Ce protocole utilise des souris BALB/C mâles pesant 25-28 g. Les animaux sont logés à une température constante (22-24 oC) et, humidité relative 55 à 5%, et maintenus dans un cycle léger/obscurité de 12 h avec un accès gratuit aux granulés standard et à l’eau du robinet ad libitum.
<ol><li>Placer la souris dans la chambre d’induction et fermer le couvercle fermement. Anesthésiez brièvement la souris avec l’isoflurane (25% O2 avec un débit O2 à 1,5-2 L/min). REMARQUE : Le taux respiratoire doit rester rythmé et plus lent que la normale et ne doit pas changer en réponse à un stimulus nocif.</li>
	<li>Inculquez 4 mg de TNBS dans 0,1 ml d’éthanol de 30 % dans 0,9 % de NaCl ou 0,1 mL de 30 % d’éthanol dans 0,9 % de NaCl en tant que véhicule contrôlant le côlon dans le côlon par un cathéter. REMARQUE : Le cathéter doit être soigneusement introduit environ 3 cm dans l’anus.</li>
	<li>Surveillez la souris quotidiennement du deuxième au huitième jour pour obtenir des paramètres cliniques, y compris le poids corporel, les saignements rectales, la consistance des selles et la mortalité.</li>
	<li>Le huitième jour, euthanasiez la souris par dislocation cervicale.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60813/60813fig1.jpg"> Figure 1 : Chronologie du modèle murin induit par TNBS de la maladie de Crohn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60813/60813fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
2. Séparation et évaluation macroscopique du côlon
REMARQUE : Un jour avant la séparation du côlon, diluer 100 l d’antibiotique dans 1 ml de tampon de phosphate saline (PBS) et laisser à 4 oC pendant la nuit.
<ol><li>Nettoyer la peau sur l’abdomen à l’aide de 75% d’éthanol et de gaze stérile.</li>
	<li>Couper la paroi abdominale du sternum à l’anus à l’aide de ciseaux stériles et de pinces à épile.</li>
	<li>Couper le côlon aussi près que possible de l’anus et du cecum.</li>
	<li>Déposer le côlon sur le plat Petri. Couper le côlon le long de l’anus dans l’extrémité de ccum. Nettoyer et laver le côlon 2-4 fois dans la solution antibiotique-PBS froide.</li>
	<li>Effectuez une évaluation macroscopique à l’aide d’un étrier selon le tableau 1. REMARQUE : L’adhérencetissulaire et l’érythème/hémorragie,le sang fécal etla diarrhée font l’objet d’une évaluation visuelle.# * L’adhérence tissulaire évalue à l’aide d’une échelle de trois points (0 : colon sans adhérence tissulaire, 1 : côlon avec l’adhérence modérée de tissu, 2 : côlon avec adhérence étendue de tissu); -basé sur l’absence (0) ou la présence (1) de l’érythème/hémorragie, du sang fécal et de la diarrhée.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Adhésion*</td>
			<td>Érythème/ hémorragie#</td>
			<td>Sang fécal#</td>
			<td>Diarrhée#</td>
			<td>Longueur de l’ulcère</td>
			<td>Épaisseur du côlon</td>
			<td>Longueur de colon</td>
		</tr>
<tr>
<td>points (0 à 2)</td>
			<td>points (0 à 1)</td>
			<td>points (0 à 1)</td>
			<td>points (0 à 1)</td>
			<td>cm/points</td>
			<td>mm/points</td>
			<td>cm/points</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - absent</td>
			<td>0 - absent</td>
			<td>0 - absent</td>
			<td>0 - absent</td>
			<td rowspan="3">0,5 cm à 0,5 point</td>
			<td rowspan="3">
n mm et n points</td>
			<td>0 - lt;10% plus court que le contrôle</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 - modéré</td>
			<td>1 - présent</td>
			<td>1 - présent</td>
			<td>0.5 - selles légères/lâches</td>
			<td>1 - de 10 à 20% plus court que le contrôle</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 - présent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 - présent</td>
			<td>2 - plus de 20% plus court que le contrôle</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Notation macroscopique de l’intestin des souris avec le modèle TNBS-induit de la maladie de Crohn.
<ol start="6"><li>Convertir la longueur de l’ulcère en centimètres en échelle de point, c’est-à-dire que tous les 0,5 cm d’ulcère sont comptés comme 0,5 point. Convertir l’épaisseur du côlon en millimètres à une échelle de point, c’est-à-dire, chaque n mm correspond à n points.</li>
	<li>Convertir la longueur du côlon en centimètres sur une échelle de trois points. La longueur du côlon obtenue de chaque souris atteinte de la maladie de Crohn induite par le TNBS est évaluée par rapport à la longueur moyenne du côlon pour le groupe témoin (0 : 'lt;10% plus courte que le contrôle, 1: de 10 à 20% plus courte que le contrôle, 2: plus de 20% plus courte que le contrôle).</li>
	<li>Calculez le score macroscopique total en fonction de l’équation : score macroscopique total , adhérence (points) , érythème/hémorragie (points) - sang fécal (points) , diarrhée (points) - longueur d’ulcère (points) - épaisseur du côlon (points) et longueur du côlon (points).</li>
</ol>3. Préparation de l’échantillon de colon
<ol><li>Couper le côlon en fragments de 1-2 cm et les placer sur une éponge dans une cassette histologique correctement étiquetée. REMARQUE : Les éponges pour les cassettes histologiques empêchent le pliage du côlon pendant la déshydratation et l’incubation dans la paraffine liquide.</li>
	<li>Placer le fragment de côlon dans 4% de formaldéhyde et incuber pendant au moins 24 h à 4 oC.</li>
	<li>Préparer et programmer le processeur tissulaire pour 1 h d’incubation dans 50%, 70%, 90%, 95%, 100% d’éthanol, xylène/100% d’éthanol (1:1; v/v), et xylène seulement, ainsi que pour au moins 3 h d’incubation dans la paraffine liquide. REMARQUE : La déshydratation doit être effectuée dans des concentrations croissantes d’éthanol et de xylène, mais la concentration d’éthanol peut être modifiée. Le mélange de xylène/éthanol est recommandé mais pas nécessaire.</li>
	<li>Transférer le fragment de côlon dans une boîte histologique et placer dans le processeur de tissu préprogrammé.</li>
	<li>Exécutez le processeur de tissu.</li>
	<li>Après les étapes d’incubation, placez le fragment de côlon dans un moule en métal de sorte que les deux extrémités du côlon soient en position verticale et remplissent un tiers du moule avec la paraffine liquide.</li>
	<li>Placer le moule dans la zone de refroidissement (-5 oC) pendant quelques secondes, puis déplacer le moule vers la zone de réchauffement (70 oC). Placer dans la partie inférieure de la boîte histologique et couvrir le fragment de côlon entier avec de la paraffine liquide.</li>
	<li>Laisser le moule métallique avec le fragment de côlon dans la paraffine pendant quelques minutes dans la zone de refroidissement. Retirer le moule métallique du bloc de paraffine et incuber pendant au moins 24 h à 4 oC.</li>
	<li>Retirez l’excès de paraffine du bloc et insérez-le dans une microtome rotative entièrement automatisée. REMARQUE : Le bloc de paraffine peut être stocké à -20 oC pendant quelques minutes avant cette étape.</li>
	<li>Couper le fragment de côlon en sections de 5 m.</li>
	<li>Transférer la section du côlon dans un bain d’eau préchauffé à 40 oC.</li>
	<li>Utilisez la glissière en verre étiquetée pour retirer la section du côlon du bain d’eau. REMARQUE : Les sections du côlon flottent sur l’eau. Placez la glissière en verre étiquetée dans l’eau sous la section du côlon et retirez soigneusement la glissière en verre.</li>
	<li>Laisser la lame de verre 24 h à température ambiante. Pour un stockage à long terme, maintenez la glissière en verre à 4 oC après 24 h d’incubation à température ambiante.</li>
</ol>4. Immunohistochemistry avec coloration d’immunofluorescence
REMARQUE : Ne laissez pas sécher la section du côlon à n’importe quelle étape pendant la procédure.
<ol><li>Retirer la paraffine en incuber la lame de verre dans le xylène pendant 5 min. Répétez cette étape trois fois.</li>
	<li>Placer la lame de verre dans du xylène/100% d’éthanol (1:1; v/v) pendant 5 min. Répétez cette étape trois fois.</li>
	<li>Réhydratrant la section du côlon dans une série de concentrations décroissantes d’éthanol, c’est-à-dire 70 %, 50 %, 30 % et 10 % d’éthanol pendant 5 min. Répétez chaque étape trois fois.</li>
	<li>Rincer la glissière de verre sous l’eau courante pendant 5 min.</li>
	<li>Préchauffer le tampon antigène (10 mM de sodium citrate; 0,05% Tween 20, pH 6.0) à 95-98 oC et chauffer la glissière en verre en solution bouillante de récupération d’antigène pendant 10 min. REMARQUE : L’étape de récupération d’antigène est facultative mais recommandée. La solution de démasquage doit être optimisée en fonction de l’anticorps utilisé dans l’expérience.</li>
	<li>Dessinez un cercle autour de la section du côlon à l’aide d’un stylo hydrophobe. REMARQUE : Cette étape est facultative mais recommandée. Le stylo hydrophobe empêche les déchets de réactifs en gardant le liquide mis en commun dans un petit volume à l’intérieur marqué le cercle.</li>
	<li>Incuber la section dans 3% solution d’eau de peroxidase d’hydrogène pendant 10 min.</li>
	<li>Laver en solution de lavage (50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; 0,05% Tween 20) pour 5 min.</li>
	<li>Incubate dans la solution de blocage (sérum de chèvre normal de 5 % ; 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 ; 150 mM NaCl; 0,05 % Triton X-100) pour 1 h à température ambiante. REMARQUE : Dans la solution de blocage, le sérum normal doit provenre de la même espèce que l’anticorps secondaire. Dans les étapes où l’incubation est nécessaire, placez la glissière de verre dans une chambre d’humidité pour empêcher l’évaporation excessive.</li>
	<li>Retirez la solution de blocage et ajoutez 20-50 l d’anticorps primaires contre ER, ER OU GPER dilué dans l’albumine de sérum bovin de 1% avec 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Triton X-100. REMARQUE : Les dilutions recommandées des anticorps primaires sont indiquées dans le tableau 2.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Type d’anticorps</td>
			<td>Anticorps contre</td>
			<td>Clonalité</td>
			<td>Espèces hôtes</td>
			<td>Réactivité des espèces</td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="13">Primaire</td>
			<td rowspan="4">ER</td>
			<td rowspan="4">Polyclonaux</td>
			<td rowspan="4">Lapin</td>
			<td>Humain</td>
			<td rowspan="13">1:100</td>
		</tr>
<tr>
<td>Souris</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tortue</td>
		</tr>
<tr>
<td>Capybara</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">ER</td>
			<td rowspan="6">Polyclonaux</td>
			<td rowspan="6">Lapin</td>
			<td>Humain</td>
		</tr>
<tr>
<td>Singe</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rat</td>
		</tr>
<tr>
<td>Souris</td>
		</tr>
<tr>
<td>mouton</td>
		</tr>
<tr>
<td>Porc</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">GPER GPER</td>
			<td rowspan="3">Polyclonaux</td>
			<td rowspan="3">Lapin</td>
			<td>Humain</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rat</td>
		</tr>
<tr>
<td>Souris</td>
		</tr>
<tr>
<td>Secondaire</td>
			<td>DyLight 650 Annonces</td>
			<td>Polyclonaux</td>
			<td>Chèvre</td>
			<td>Lapin</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Caractéristiques des anticorps.
<ol start="11"><li>Incubate avec anticorps primaires pendant la nuit à 4 oC dans l’obscurité.</li>
	<li>Retirez la solution d’anticorps et lavez-vous dans la solution de lavage (50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; 0,05% Tween 20) pendant 5 min. Répétez cette étape trois fois.</li>
	<li>Ajouter 20-50 l d’anticorps secondaires DyLight 650 dilué dans 1% albumin de sérum bovin (contenant 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Triton X-100). Incubate avec anticorps secondaires conjugués avec colorant pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité. REMARQUE : La dilution recommandée de l’anticorps secondaire est indiquée dans le tableau 2.</li>
	<li>Retirez la solution d’anticorps et lavez-vous dans la solution de lavage (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) pendant 5 min. Répétez cette étape trois fois.</li>
	<li>Ajouter 2% DiOC6(3) dilué en 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl et incubate pendant 10 min à température ambiante dans l’obscurité.</li>
	<li>Retirez la solution et lavez-vous dans la solution de lavage (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) pendant 5 min. Répétez cette étape trois fois.</li>
	<li>Ajouter quelques gouttes de liquide à base de glycérol avec DAPI directement sur la section du côlon et couvrir soigneusement avec une glissière de couverture. Incuber la section du côlon pour au moins 24 h à 4 oC. REMARQUE : Évitez les bulles d’air lorsque vous recouvrez le tissu avec la glissière de couverture.</li>
	<li>Analyser la section du côlon sous microscope confocal avec des objectifs 20x ou 63x et l’immersion d’huile à l’aide de logiciels dédiés. REMARQUE : Le tableau 3 énumère les caractéristiques des fluorochromes utilisés dans cette étude.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">Type fluorochome</td>
			<td colspan="2">Longueur d’onde (nm)</td>
			<td rowspan="2">Colorant</td>
		</tr>
<tr>
<td>L’excitation</td>
			<td>Émission</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dapi</td>
			<td>405</td>
			<td>460 – 480</td>
			<td>Bleu</td>
		</tr>
<tr>
<td>DiOC6 (3)</td>
			<td>485</td>
			<td>538 – 595</td>
			<td>Vert</td>
		</tr>
<tr>
<td>DyLight 650 Annonces</td>
			<td>654</td>
			<td>660 – 680</td>
			<td>Rouge</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 3 : Caractéristiques des fluorochromes.

<ol><li>Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+bowel+disease%3A+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory bowel disease: pathogenesis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).</li>
<li>Morris, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hapten-induced+model+of+chronic+inflammation+and+ulceration+in+the+rat+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.</a> Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).</li>
<li>Okayasu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+in+the+induction+of+reliable+experimental+acute+and+chronic+ulcerative+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice.</a> Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).</li>
<li>Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxazolone+colitis%3A+a+murine+model+of+T+helper+cell+type+2+colitis+treatable+with+antibodies+to+interleukin+4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4.</a> Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).</li>
<li>Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+cells+that+express+high+levels+of+CD45RB+induce+wasting+disease+when+transferred+into+congenic+severe+combined+immunodeficient+mice.+Disease+development+is+prevented+by+cotransfer+of+purified+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).</li>
<li>Kühn, R., Löhler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., Müller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-10-deficient+mice+develop+chronic+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis.</a> Cell. 75 (2), 263-274 (1993).</li>
<li>Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous%2C+heritable+colitis+in+a+new+substrain+of+C3H%2FHeJ+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice.</a> Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).</li>
<li>Harnish, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+effects+of+estrogen+treatment+in+the+HLA-B27+transgenic+rat+model+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).</li>
<li>Pierdominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+estrogen+receptor+%CE%B2+expression+with+inflammatory+bowel+disease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Linking estrogen receptor β expression with inflammatory bowel disease activity.</a> Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).</li>
<li>Włodarczyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptor+30+%28GPR30%29+expression+pattern+in+inflammatory+bowel+disease+patients+suggests+its+key+role+in+the+inflammatory+process.+A+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastrointestinal+and+Liver+Diseases%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study.</a> Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).</li>
<li>Mohammad, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+%CE%B1+contributes+to+T+cell-mediated+autoimmune+inflammation+by+promoting+T+cell+activation+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor α contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation.</a> Science Signaling. 11 (526), eaap9415(2018).</li>
<li>Jacenik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+estrogen+receptor+mediates+anti-inflammatory+action+in+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn's disease.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6749(2019).</li>
<li>Prossnitz, E. R., Barton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+G+protein-coupled+estrogen+receptor+GPER+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease.</a> Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).</li>
<li>Yaşar, P., Ayaz, G., User, S. D., Güpür, G., Muyan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+estrogen-estrogen+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling.</a> Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).</li>
<li>Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+the+study+of+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mouse models for the study of Crohn's disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).</li>
<li>Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., Stüber, E., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+interleukin+12+abrogate+established+experimental+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).</li>
<li>Ikeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simvastatin+attenuates+trinitrobenzene+sulfonic+acid-induced+colitis%2C+but+not+oxazalone-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis.</a> Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).</li>
<li>Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+physical+basics+of+routine+formaldehyde+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Il existe de nombreux modèles animaux pour l’examen de pathophysiologie des MII, y compris les modèles génétiques, immunologiques ou spontanés, ainsi que les modèles chimiquement induits15. Parmi les plusieurs types de modèles animaux de colite, les modèles induits chimiquement tels que le modèle induit par TNBS décrit dans ce protocole, sont relativement peu coûteux et faciles à obtenir. Le modèle murine TNBS-induit de la colite a plusieurs symptômes cliniques liés à la base pathologique de CD. L...

Crohn' la maladie de s (CD) est une maladie inflammatoire d’entrailles (IBD) manifestée comme inflammation chronique d’intestin. L’étiologie du CD est mal comprise, mais il ya quelques facteurs majeurs qui semblent être responsables du développement de CD, y compris le microbiote intestinal, et des facteurs génétiques et environnementaux, tels que l’alimentation ou le stress1. Pour une meilleure compréhension de la pathogénie de la maladie de Crohn, plusieurs modèles d’inflammation intestinale ont été utilisés2,3,4,5,6,7. Dans cet article, nous présentons des résultats obtenus à partir d’un modèle de sulfonique de 2,4,6 trinitrobenzene (TNBS) induit de CD.
Il a été documenté que les oestrogènes sont capables de moduler l’inflammation intestinale chronique8,9,10,11,12. L’activité biologique des oestrogènes est médiatisée par les récepteurs cognate, parmi lesquels les récepteurs d’oestrogène nucléaire (ER), c’est-à-dire ERMD (gène ESR1) et ERMD (gène ESR2), ainsi que le récepteur d’oestrogène couplé à la protéine G, c’est-à-dire GPER (gène GPER1), appelé ERER 13,14. Il existe plusieurs méthodes pour déterminer le niveau des récepteurs d’oestrogène, mais seulement quelques-uns peuvent être utilisés pour les visualiser dans l’intestin.
L’immunohistochimie (IHC) est une méthode largement utilisée dans les études cliniques et fondamentales pour la détection de certains antigènes dans les cellules ou les tissus avec des anticorps fluorochrome-conjugués. IHC semble être une méthode importante dans la visualisation de la structure tissulaire, ainsi que dans l’identification et la localisation de protéines spécifiques, qui peuvent être cruciales pour comprendre le développement de la colite. Ici, nous présentons un protocole complet et validé pour la visualisation immunohistochimique des récepteurs d’oestrogène dans l’intestin utilisant l’immunofluorescence.

<table><tbody><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/C</td><td>souris Université de Lodz</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caliper</td><td>VWR</td><td>62379-531</td><td></td></tr><tr><td>Bloc de carton</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal - TCS SP8</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microtome rotatif entièrement automatisé - RM2255</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Lame de verre</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800BMNT</td><td></td></tr><tr><td>Module d’enrobage de paraffine chauffée - EG1150 H</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Boîte histologique</td><td>Marfour</td><td>LN.138747</td><td></td></tr><tr><td>Stylo hydrophobe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td></td></tr><tr><td>Balance de laboratoire</td><td>Radwag</td><td>WL-104-0048</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel LAS X</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Moule métallique</td><td>Marfour</td><td>CP.5105</td><td></td></tr><tr><td>Gaze stérile</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux stériles</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler stérile</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Processeur de tissus - TP1020</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2, 4, 6-trinitrobenzène sulfonic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92822</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>DiOC6 (3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>318426</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 650 anticorps secondaire</td><td>Abcam</td><td>ab96886</td><td></td></tr><tr><td>ER&alpha ; anticorps primaire</td><td>Abcam</td><td>ab75635</td><td></td></tr><tr><td>ER&beta ; anticorps primaire</td><td>Abcam</td><td>ab3576</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Avantor Performance Materials Pologne</td><td>396480111</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>Avantor Performance Materials Poland</td><td>432173111</td><td></td></tr><tr><td>GPER anticorps primaire</td><td>Abcam</td><td>ab39742</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Avantor Performance Materials Pologne</td><td>575283421</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxidase</td><td>Avantor Performance Materials Poland</td><td>885193111</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane (forane)</td><td>Baxter</td><td>1001936040</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>Paraffine</td><td>Leica Biosystems</td><td>39602012</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétrie</td><td>Nest</td><td>Scientific 705001</td><td></td></tr><tr><td>Tampon phosphate salin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Saline physiologique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7982</td><td></td></tr><tr><td>Primocin (antibiotique)</td><td>Invitrogen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifage Mountant avec DAPI (liquide à base de glycérol avec DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>P36971</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Chempur</td><td>WE/231-598-3</td><td></td></tr><tr><td>Citrate de sodium</td><td>Avantor Performance Materials Pologne</td><td>795780429</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Avantor Performance Materials Poland</td><td>853470115</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Avantor Performance Matériaux Pologne</td><td>BA0860119</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation des récepteurs d’oestrogène dans les colons des souris atteints de la maladie de crohn induite par le tnbs à l’aide de l’immunofluorescence

Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

La maladie de Crohn est le type le plus diagnostiqué de maladie inflammatoire de l’intestin. L’inflammation chronique se développant dans l’intestin mène au désordre de périsphyse et aux dommages de la muqueuse intestinale et semble être associée à un risque accru de transformation néoplastique du côlon. L’accumulation de preuves indique que les œstrogènes et les récepteurs d’oestrogène affectent non seulement les tissus hormono-sensibles, mais aussi d’autres tissus non directement liés aux oestrogènes, tels que les poumons ou les colons. Ici, nous décrivons le protocole pour la coloration réussie d’immunofluorescence des récepteurs d’oestrogène dans le côlon obtenu d’un modèle murin de Crohn-induit de TNBS' la maladie de s. Un protocole détaillé pour l’induction de crohn' la maladie de s chez la souris et la préparation d’intestin est fourni aussi bien qu’une procédure immunohistochimique étape par étape utilisant des sections formelles-définies d’intestin paraffin-embedded. Les méthodes décrites sont non seulement utiles pour la détection des récepteurs d’oestrogène et l’étude de signalisation d’oestrogène in vivo mais peuvent également être appliquées pour d’autres protéines qui peuvent être impliquées dans le développement de la colite.

Caractéristiques macroscopiques des colons chez les souris atteintes de la maladie de Crohn induite par TNBS Des images représentatives des colons prélevés sur le contrôle et des souris traitées par TNBS sont montrées dans la figure 2. Chez les souris avec un modèle TNBS-induit de la maladie de Crohn, la longueur du côlon est réduite tandis que la largeur du côlon est augmentée.
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Le protocole présente un modèle murine TNBS-induit complet de Crohn' la maladie de s et des méthodes pour visualiser des récepteurs d’oestrogène par immunohistochemistry utilisant l’immunofluorescence des sections formelles-fixes de colon incorporées dans la paraffine.

Visualisation des récepteurs d’oestrogène dans les colons des souris atteints de la maladie de Crohn induite par le TNBS à l’aide de l’immunofluorescence

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

L’évidence croissante suggère l’impact de la signalisation d’oestrogène sur la partie colonique de la physiologie, l’immunohistochimie est une technique prometteuse pour identifier des récepteurs d’oestrogène dans le côlon et ils évoluent dans la colite. Nous présentons un protocole complet et validé pour la visualisation immunohistochimique des récepteurs d’oestrogène dans le côlon, utilisant l’immunofluorescence. En collaboration avec le Dr Sylwia Michlewska du Laboratoire d’imagerie microscopique de l’Université de Lodz, nous démontrerons la procédure.Placer le côlon dans une boîte de Pétri. Couper le côlon en fragments d’un à deux centimètres. Placez chaque fragment sur une éponge dans une cassette histologique dûment étiquetée.Placer une cassette contenant un fragment de côlon dans 4% de paraformaldéhyde. Incuber pendant au moins 24 heures à quatre degrés Celsius. Préparer et programmer le traitement tissulaire pour une heure d’incubation dans 50%70%90%95%et 100% éthanol, xylène 100% éthanol, et xylène seulement, ainsi que pour au moins trois heures d’incubation dans la paraffine liquide.Transférer le fragment du côlon dans une boîte histologique. Placez la boîte dans le processeur de tissu préprogrammé et exécutez le processeur. Après incubation dans le processeur de tissu enlever le côlon de la boîte histologique et placer le fragment du côlon dans un moule métallique, de sorte que les deux extrémités du côlon sont en position verticale.Remplir un tiers du moule de paraffine liquide. Placez le moule dans la zone de refroidissement à moins cinq degrés Celsius pendant quelques secondes, puis déplacez le moule vers la zone de réchauffement à 70 degrés Celsius. Ensuite, placez le moule dans la partie inférieure de la boîte histologique et couvrez le fragment entier du côlon avec de la paraffine liquide.Placez le moule métallique contenant le fragment du côlon et la paraffine dans la zone de refroidissement pendant quelques minutes. Retirez ensuite le moule métallique du côlon et du bloc de paraffine. Incuber le bloc du côlon et de la paraffine pendant au moins 24 heures à quatre degrés Celsius.Après l’incubation, retirer l’excès de paraffine du bloc. Insérez le bloc du côlon et de la paraffine dans une microtome rotative entièrement automatisée. Couper le fragment du côlon en cinq sections de micromètres.Transférer une section du côlon dans un bain d’eau, préchauffé à 40 degrés Celsius. Utilisez la lame de verre étiquetée pour retirer la section du côlon du bain d’eau et incuber la glissade de verre à température ambiante pendant 24 heures. Tout d’abord, retirer la paraffine en incubant la lame de verre en xylène pendant cinq minutes.Répétez cette étape trois fois. Ensuite, placez la glissade en verre dans un mélange de xylène et 100% d’éthanol pendant cinq minutes. Répétez cette étape trois fois.Utilisez une série de concentrations décroissantes d’éthanol pour réhydrater la section du côlon. Plonger la glissade dans l’éthanol pendant cinq minutes. Répéter trois fois à chaque concentration avant de passer à la concentration suivante.Rincer la glissade de verre sous l’eau courante pendant cinq minutes. Réchauffer le tampon de récupération de l’antigène à 95 à 98 degrés Celsius. Chauffer ensuite la glissade de verre dans la solution de récupération d’antigène bouillante pendant 10 minutes.Pour éviter le gaspillage de rééconts, utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner un cercle autour de la section du côlon. Ensuite, incubez la lame pendant 10 minutes dans une solution de 3% de peroxyde d’hydrogène et d’eau. Lavez la lame dans la solution de lavage pendant cinq minutes.Puis incuber la glissière dans la solution de blocage pendant une heure à température ambiante. Retirez la solution de blocage et ajoutez 20 à 50 microlitres d’anticorps primaires contre l’alpha E-R, la bêta E-R ou le G-P-E-R dilué. Incuber l’anticorps primaire pendant la nuit à quatre degrés Celsius dans l’obscurité.Retirez la solution anticorps. Lavez la lame trois fois dans la solution de lavage pendant cinq minutes à chaque fois. Ensuite, ajoutez des anticorps secondaires dilués.Incuber la lame avec un anticorps secondaire conjugué à du colorant pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité. Retirez la solution d’anticorps secondaire de la lame. Lavez la lame trois fois dans la solution de lavage pendant cinq minutes à chaque fois.Ajouter le fluorochrome dilué pour la visualisation membranaire et incuber pendant 10 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Retirez la solution et lavez la lame trois fois dans la solution de lavage pendant cinq minutes à chaque fois. Ajoutez quelques gouttes de DAPI liquide à base de glycérol, un fluorochrome pour la visualisation des noyaux cellulaires, directement sur la section du côlon.Couvrez-le soigneusement avec une diapositive de couverture. Incuber la section du côlon pendant au moins 24 heures à quatre degrés Celsius. Analyser la section du côlon au microscope confocal avec des objectifs 20x ou 63x et immersion d’huile.La spécificité des anticorps utilisés dans l’étude a été validée à l’aide de cellules MCF-7. Les anticorps de récepteur d’oestrogène ont permis la détection des récepteurs nucléaires d’oestrogène E-R alpha et bêta d’E-R aussi bien que le récepteur membrane-lié d’oestrogène G-P-E-R. Un contrôle négatif a également été exécuté dans lequel les cellules de MCF-7 ont été souillées seulement avec l’anticorps secondaire conjugué avec le fluorochrome et un liquide glycérol-basé avec DAPI.Un signal cytoplasmique fort de l’alpha d’E-R a été trouvé dans les sections de deux points obtenues des souris témoins et des souris avec TNBS-induits Crohn' la maladie de s. Cependant, seuls les colons obtenus à partir de souris témoins avaient E-R alpha localisé dans le cytoplasme des cellules gobelet. La microscopie confoccale a également indiqué la localisation cytoplasmique de la bêta d’E-R dans les sections de deux points des souris témoins et des souris TNBS-traitées.De même, la localisation cytoplasmique de G-P-E-R a été documentée dans les sections du côlon obtenues à partir de souris témoins et de souris traitées au TNBS. Le positionnement correct du côlon dans le moule est essentiel pour générer la section transversale correcte. Fluorochrome doit être sélectionné par son propre spectre d’excitation et d’émission.Cette méthode peut également être appliquée à d’autres protéines qui peuvent être impliquées dans le développement de la colite. La détection de l’immunohistochimie par immunofluorescence peut être étendue pour tacher d’autres protéines dans l’état de direction protéine-protéine.

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Cette vidéo démontre l’évaluation de la colite induite par des produits chimiques par coloration immunohistochimique du tissu du côlon de souris. Dans une coupe de tissu coloré, la présence d’un grand nombre de cellules immunitaires dans le tissu endommagé représente l’infiltration de cellules immunitaires pendant la colite.

Évaluation de la colite induite par des produits chimiques par l’analyse immunohistochimique de coupes de tissu du côlon

Cette vidéo présente une technique d’évaluation de l’infiltration de macrophages intestinaux dans un modèle murin de colite à l’aide de la tomographie médiée par fluorescence (FMT). Après avoir induit une colite chez une souris via du sulfate de sodium de dextran (DSS), l’animal reçoit une injection d’anticorps qui reconnaissent le marqueur de glycoprotéine F4/80 sur les macrophages infiltrés dans le côlon. La souris est ensuite imagée dans un dispositif FMT où les signaux de fluorescence et de...

Utilisation de la tomographie médiée par fluorescence pour évaluer l’inflammation intestinale murine

Techniques d'imagerie de petits animaux permettent examens diagnostiques de série et les interventions thérapeutiques in vivo. Récemment, le champ des applications a considérablement élargi et comprend actuellement évaluation du développement de la tumeur du côlon, la cicatrisation des plaies et la surveillance de l'inflammation. Ce protocole illustre ces diverses applications potentielles de l'endoscopie murin.

Murin endoscopie pour In Vivo Guérison multimodale d'imagerie de la cancérogenèse et de l'évaluation de la plaie intestinale et l'inflammation

l'identification et la localisation des cellules épithéliales le long de la paroi de la muqueuse intestinale précis sont essentiels pour définir différentes lignées cellulaires. l'imagerie correcte des tissus intestinaux est cruciale pour l'identification des motifs d'expression de protéine avec une résolution maximale. Cette étude vise à définir les méthodes et les conditions optimales pour les tissus intestinaux de traitement de la souris.

Amélioration Technique Swiss-laminage pour la préparation Intestinal des tissus pour immunohistochimique et immunofluorescence Analyses

Dans ce modèle de colite induite par antigène, les lymphocytes T CD4+ OT-II exprimant une protéine fluorescente rouge ont été transférés adoptivement dans des souris RAG-/- qui expriment une protéine fluorescente verte dans des phagocytes mononucléaires (MP). Les hôtes ont été mis au défi par Escherichia coli (E. coli) exprimant la protéine ovalbumine (OVA) fusionnée à une protéine fluorescente cyan (CFP).

Développement d&#39;un modèle Colite antigène conduit à étudier la présentation des antigènes par les cellules présentatrices d&#39;antigènes aux cellules T

Nous décrivons ici un modèle de souris rapporteure transgénique pour visualiser les cellules productrices d’IL-22 à l’intérieur de différents tissus de souris. Cette méthode peut être utilisée pour suivre l’emplacement d’autres cytokines ou protéines de secrétaire chez la souris.

Visualisation de l&#39;IL-22 exprimant Lymphocytes en utilisant des souris Reporter

Spécifique à la cible sondes représentent un outil innovant pour l’analyse des mécanismes moléculaires, comme expression de la protéine dans divers types de maladie (p. ex., inflammation, infection et tumorigenèse). Dans cette étude, les auteurs décrivent une évaluation quantitative de tomographie tridimensionnelle d’infiltration de macrophages intestinaux dans un modèle murin de colite en utilisant la tomographie de F4/80-spécifique induite par fluorescence.

Tomographie médiée par fluorescence pour la détection et la Quantification de l’Inflammation intestinale Murine axés sur les macrophages

Dans cette étude, nous décrivons une procédure détaillée de la fibrose intestinale TNBS-négociée, qui montre la pathophysiologie comparable à Crohn' fibrose de s. Nous discutons également cette approche à la lumière de la rapamycine a facilité des effets inhibiteurs sur la fibrose intestinale.

Aperçu mécaniste du développement de la fibrose intestinale médiée par tNBS et évaluation des effets inhibiteurs de la rapamycine

Le présent protocole décrit le développement d’un modèle de colite semblable à celui de Crohn chez les rongeurs. L’inflammation transmurale entraîne une sténose au site d’instillation du TNBS et un élargissement mécanique est observé dans le segment proximal de la sténose. Ces changements permettent d’étudier le stress mécanique dans la colite.

Un modèle de rongeur induit par le TNBS pour étudier le rôle pathogène du stress mécanique dans la maladie de Crohn

Nous décrivons un protocole détaillant l’isolement des cryptes coliques murines pour le développement de colonoïdes en 3 dimensions. Les colonoïdes établis peuvent ensuite être différenciés en phase terminale pour refléter la composition cellulaire de l’épithélium hôte avant de recevoir un défi inflammatoire ou d’être dirigés vers l’établissement d’une monocouche épithéliale.

Étude des effets épithéliaux de l’inflammation intestinale in vitro sur les colonoïdes murins établis

Découvrez la visualisation des récepteurs d'œstrogène dans le colon de souris atteintes de la maladie de Crohn induite par le TNBS. Cette méthode d'immunofluorescence permet d'étudier le rôle des œstrogènes dans la santé colique.

Visualisation des récepteurs d’oestrogène dans les colons des souris atteints de la maladie de Crohn induite par le TNBS à l’aide de l’immunofluorescence (Vidéo) | JoVE Journal

Visualisation des récepteurs d’oestrogène dans les colons des souris atteints de la maladie de Crohn induite par le TNBS à l’aide de l’immunofluorescence

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