Utilisation d'un analyseur de flux extracellulaire pour mesurer les changements dans la glycolyse et la phosphorylation oxydative pendant la capacitation de sperme de souris

Ce protocole peut être utilisé pour appliquer un analyseur de flux extracellulaire pour surveiller les changements dans le métabolisme énergétique pendant la capacitation du sperme. Nous avons développé ce protocole pour comparer les changements dans la glycolyse et la phosphorylation oxydative en temps réel entre le sperme de souris non capacitated et capacitated. La veille de l’essai, retirez la cartouche du capteur d’un kit d’analyse de flux extracellulaire et placez la cartouche à l’envers à côté de la plaque utilitaire.

Remplissez un réservoir de solution avec 25 millilitres d’eau distillée double et ajoutez 200 microlitres d’eau à chaque puits de la plaque d’utilité, puis placez la cartouche de capteur de nouveau dans la plaque d’utilité. Placez la plaque dans un incubateur de 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone. Ensuite, aliquot 25 millilitres d’analyseur de flux extracellulaire calibrant dans un tube conique de 50 millilitres et placer le tube dans l’incubateur de 37 degrés Celsius non-dioxyde de carbone.

Pour préparer les micro plaques enduites ConA, dissoudre 2,5 milligrammes de ConA en cinq millilitres d’eau distillée double et utiliser une pipette multicanal pour remplir chaque puits d’un analyseur de flux extracellulaire de 96 puits avec 50 microlitres de la solution ConA, puis laisser le couvercle ouvert pour laisser sécher la plaque pendant la nuit. Pour préparer le tampon de sperme, chauffer 250 millilitres d’analyseur de flux extracellulaire TYH tampon à 37 degrés Celsius et ajuster le pH à 7,4. Le jour de l’analyse, remplacer l’eau dans chaque puits de la plaque d’utilité par 200 microlitres de calibre XF par puits et remettre la plaque dans l’incubateur de dioxyde de carbone pendant au moins une heure.

Pour générer un modèle d’onde, activez l’analyseur de flux extracellulaire. Alors que la température se stabilise à 37 degrés Celsius, ouvrez le logiciel d’ondes et ouvrez un modèle vierge. Sous l’onglet définitions de groupe, définissez le milieu d’analyse comme TYH et le type de cellule comme sperme de souris, laissant les stratégies d’injection et les prétraitements vierges.

Créez différents groupes pour chaque condition d’analyse et ouvrez la carte des plaques pour affecter chaque groupe à des puits spécifiques. Sous l’onglet protocole, délibérer, ajouter chacun des quatre cycles de mesure différents, sélectionner le port respectif et modifier les détails de mesure afin que la mesure après l’injection soit mise en surbrillance, puis enregistrer le modèle d’analyse, remplir le résumé du projet et enregistrer les résultats. Avant de récolter le sperme, préchaive 50 millilitres de tampon TYH à 37 degrés Celsius.

Après avoir récolté des caudas chez des souris mâles adultes, placez chaque cauda dans 500 microlitres du tampon TYH préchauffé dans les puits individuels d’une plaque de 24 puits. Utilisez des forceps pour immobiliser chaque cauda individuellement au fond de chaque puits et faites rapidement cinq à sept petites incisions dans chaque tissu à l’aide de ciseaux à plumes. Lorsque tous les caudas ont été incisés, placez immédiatement la plaque dans l’incubateur de dioxyde de carbone non pour permettre au sperme de se disperser pendant 15 minutes.

Pour charger la cartouche du capteur, retirez le couvercle de la cartouche du capteur et alignez la lettre du guide de chargement du port respectif avec le coin supérieur gauche de la cartouche. En tenant le guide de chargement bâbord en place, insérez les pointes de pipette verticalement dans les trous de guide de chargement portuaire du port A et injectez 20 microlitres de tampon TYH dans chaque colonne. Pour le port B, injecter 22 microlitres de tampon TYH dans les colonnes un à quatre, 22 microlitres de 500 millimolaires 2-deoxyglucose dans les colonnes cinq à huit, et 25 microlitres de cinq micromolaires antimycine A rotenone dans les colonnes neuf à 12.

Pour le port C, injectez 25 microlitres de tampon TYH dans chaque colonne avec des nombres impairs et 25 microlitres de 10 millimlaires de dibutyryl-cyclique AMP 500 micromolaire IBMX dans chaque colonne avec des nombres différents, puis placez la cartouche de capteur avec une plaque d’étalonnage dans l’analyseur de flux extracellulaire et commencer l’analyseur de flux. L’étalonnage prendra de 10 à 15 minutes. Pour préparer les plaques de sperme, ajouter trois millilitres de trois milligrammes par millilitre d’albumine de sérum bovin dans le tampon TYH à chacun des trois tubes de centrifugeuse de cinq millilitres.

Ensuite, mettre en commun deux puits de sperme dans chacun des trois tubes de centrifugeuse de 1,5 millilitre. Après comptage, diluer le sperme à deux fois 10 à la concentration de sept spermatozoïdes par millilitre par échantillon dans tyh frais complété avec de l’albumine de sérum bovin. Sédimenter le sperme par centrifugation et resuspendre les granulés de sperme dans un millilitre de tampon TYH.

Centrifugez à nouveau le sperme et enlevez les supernatants en prenant soin de ne pas déranger les granulés. Transférer chaque suspension de sperme dans l’un des tubes de centrifugeuse de cinq millilitres préparés et ajouter 180 microlitres de tampon TYH dans chaque coin bien d’une plaque enduite ConA. Ajouter 180 microlitres de sperme dans chaque puits vide de la plaque enduite cona et centrifugeuse la plaque deux fois en tournant la plaque à 180 degrés entre les centrifugations, puis placer la plaque d’étalonnage avec la plaque de sperme et continuer l’essai.

Dans cette expérience représentative, le sperme a été capacitated en présence du glucose comme seul substrat d’énergie et 2-deoxyglucose et antimycine et rotenone comme modulateurs pharmacologiques. La flèche indique l’induction de la capacitation. En présence de glucose, la capacitation a été accompagnée d’une augmentation sept fois du taux d’acidification extracellulaire qui est inhibé en bloquant la glycolyse avec 2-deoxyglucose.

Le sperme capacitated a démontré une augmentation de 20 fois du taux de consommation d’oxygène comparé au sperme non-capacitated démontrant que le sperme de souris augmentent la glycolyse et la phosphorylation oxydante pour soutenir la demande croissante d’énergie pendant la capacitation. L’augmentation du taux d’acidification extracellulaire pendant la capacitation du sperme n’est pas affectée par les inhibiteurs oxydatifs de phosphorylation antimycine A et roténone indiquant que le changement de ce taux est principalement entraîné par la libération d’hydrogène de la glycolyse. L’augmentation du taux de consommation d’oxygène, cependant, est bloquée par l’antimycine A et la roténone ainsi que par 2-deoxyglucose révélant que l’augmentation d’OXPHOS pendant la capacitation de sperme dépend de l’activité glycolytique.

La source d’énergie et les activateurs et inhibiteurs pharmacologiques peuvent être variés en fonction de l’objectif de l’expérience et jusqu’à 12 conditions différentes peuvent être mesurées en parallèle. Le protocole peut être facilement adapté à d’autres espèces comme l’homme ou le bovin où les changements dans le métabolisme énergétique pendant la capacitation sont tout aussi énigmatiques.