Isolement et expansion des neurosphères des niches neurogéniques de souris postnatales (P1-3)

L’essai de neurosphère est technique in vitro utile pour étudier les propriétés inhérentes des cellules souches/progénitrices neurales, y compris la prolifération, l’auto-renouvellement et la multipotence dans le contexte physiologique et pathologique. En raison de sa structure tridimensionnelle, cette technique est un outil puissant pour étudier la neurogenèse adulte. Il est également utile pour la culture et l’obtention de rendements plus élevés de cellules souches/progénitrices neurales.

Cet essai de neurosphère peut être appliqué à l’étude de troubles cérébraux tels que la maladie d’Alzheimer et de Parkinson ou la sclérose en plaques. Les neurosphères peuvent également être obtenues à partir d’autres régions ou systèmes cérébraux, tels que les tissus adipeux ou l’intestin. Rita Soares, doctorante dans mon groupe, fera la démonstration de la procédure avec Filipa Ribeiro.

Pour récolter le jour postnatal un à trois cerveaux de souris, maintenez la partie ventrale du corps à la base de la tête et utilisez de petits ciseaux pointus pour faire une incision médiane dans la peau sur toute la longueur de la tête pour exposer le crâne. Faire une incision longitudinale à la base du crâne et continuer à couper le long de la suture sagittale à un angle peu profond que possible pour éviter d’endommager les structures du cerveau. Utilisez des forceps incurvés pour peler le crâne sur les côtés pour exposer le cerveau et glisser une petite spatule sous le cerveau pour couper les nerfs crâniens et les vaisseaux sanguins qui sont connectés à la base du cerveau.

Placez le cerveau dans une boîte de Pétri de HBSS froid complétée par des antibiotiques et placez le plat sous un microscope disséquant à faible grossissement. Placez le cerveau sur sa surface dorsale. Tout en tenant le cerveau par le cervelet, utilisez des forceps fins pour enlever les méninges du côté ventral du cerveau et des ampoules olfactives.

Faites pivoter le cerveau sur l’aspect ventral et épluchez le reste des méninges. Ensuite, utilisez les forceps pour enlever le cervelet et utiliser des forceps pointus incurvés pour transférer le cerveau sur un morceau de papier filtre avec un pore de 11 micromètres sur le dessus d’un hachoir de tissu. Pour la microdissection SVZ et DG, commencez par couper le cerveau en 450 sections coronal micromètres.

Utilisez un lamina humide pour recueillir le cerveau sectionné dans une nouvelle boîte de Petri remplie d’antibiotiques froids complété HBSS sous un microscope dissectionnel et utiliser des forceps pour séparer les tranches coronales d’une manière antérieure à postérieure jusqu’à ce que des tranches avec les ventricules latéraux sont atteints. Utilisez des forceps fins pour couper la fine couche des tissus entourant la paroi latérale des ventricules, à l’exclusion du parenchyme striatal et du corpus callosum et placer une pointe des forceps immédiatement sous le corpus callosum et l’autre dans le tissu immédiatement adjacent à la zone ventrale du ventricule latéral pour isoler le SVZ. Couper une petite ligne de tissus entourant le ventricule latéral et recueillir le tissu disséqué dans un tube d’échantillon contenant la solution HBSS complétée.

Lorsque toutes les tranches ont été microdissectées avec des forceps et que la formation hippocampale a été atteinte, jetez la première tranche avec l’hippocampe dans laquelle le DG est encore méconnaissable. Pour enlever le DG, isoler d’abord l’hippocampe des tranches et recentrer le microscope pour visualiser les bordures autour de la DG. Pour récolter la DG, utilisez des forceps pour faire une coupe entre la région DG et CA1 suivie d’une coupe verticale entre la région DG et CA3. Retirez ensuite la fimbrie et tout tissu adjacent et placez le tissu récolté dans un tube séparé de solution HBSS complétée par antibiotique.

Pour dissocier les échantillons de SVZ et de DG, ajoutez Trypsin-EDTA 0,05 % à une concentration finale de 5 à 10 % de Trypsin-EDTA de 0,05 % en HBSS à chaque tube pendant une incubation d’environ 50 minutes à 37 degrés Celsius. Toute l’utilisation de trypsine ou de temps d’incubation trop long peut entraîner une augmentation de la mort cellulaire, ce qui a un impact négatif sur la croissance cellulaire. Lorsque le tissu s’est agglutiné, remplacer la solution enzymatique pour quatre lavages consécutifs par un millilitre de HBSS frais complété par lavage.

Après le dernier lavage, resuspendez les tissus digérés dans un millilitre de milieu sans sérum complété avec 10 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance épidermique et cinq nanogrammes par millilitre de facteur de croissance fibroblaste de base par tube. Puis dissocier mécaniquement les tissus avec pipetting doux sept à 10 fois avec un pipet P1000 jusqu’à ce qu’une solution cellulaire homogène a été obtenue. Pour déterminer la densité de la cellule dissociée de DG ou de SVG, comptez les cellules dans chaque suspension sur un hématocytomètre.

Pour étendre les cellules dans les neurosphères, diluer les populations cellulaires individuelles à deux fois dix à la quatrième cellule par densité millilitre dans le milieu sans sérum complété par des facteurs de croissance et de semences cinq millilitres de la suspension cellulaire en boîtes de Pétri de 60 millimètres de diamètre non encoché. Puis incuber les cellules SVZ pendant six à huit jours et les cellules DG pendant 10 à 12 jours à 37 degrés Celsius pour la formation primaire de la neurosphère. Lorsque la majorité des neurosphères ont un diamètre de 150 à 200 micromètres, récoltez la suspension cellulaire des cultures et recueillez les neurosphères par centrifugation.

Resuspendez la palette de neurosphère avec un kit de dissociation chimique de souris selon les instructions du fabricant avant de recueillir les cellules avec une autre centrifugation. Remplacez le supernatant par un millilitre de milieu sans sérum complété par des facteurs de croissance et essayez doucement d’évaluer la pastille environ 10 fois. Comptez les cellules neuro dissociées telles que démontrées et réinsérées les cellules à deux fois 10 à la quatrième cellule par densité millilitre dans le milieu sans sérum complété par des facteurs de croissance dans de nouvelles boîtes de Pétri de 60 millilitres.

Retournez ensuite la cellule à l’incubateur de culture cellulaire pendant six à huit ou 10 à 12 jours supplémentaires, le cas échéant, pour obtenir des neurosphères secondaires. Les neurosphères SVG et DG obtenues à l’aide de l’analyse de la neurosphère sont composées de cellules positives sox2 positives et imbriquées indifférenciées. Notamment, les neurosphères dérivées du SVG ont des dimensions plus grandes que leurs homologues DG.

Fait important, dans des conditions de différenciation, les cellules souches/progénitrices neurales dérivées du SVG et de la DG migrent hors des neurosphères, formant un pseudomonolayer de cellules. Dans les deux régions neurogéniques, il est possible d’observer la présence de Sox2 double positif, nestin double positif, doublecortine double paires de cellules négatives correspondant à des divisions symétriques indicatives de l’auto-renouvellement. Paires cellulaires dans lesquelles une cellule de Sox2 positif, nestin positif, et négatif de doublecortine, et l’autre cellule Sox2 négatif, négatif de nidin, et positif de doublecortine démontrant des divisions asymétriques.

Et Sox2 double négatif, nestin double négatif, et doublecortine double paires de cellules positives correspondant à des divisions symétriques indicatives de la différenciation. Dans l’ensemble, la réussite modifie le taux de mortalité cellulaire au deuxième jour in vitro. La néuritogenèse peut être évaluée dans les neurones obtenus à partir de la différenciation des cellules souches/progénitrices neurales SVG et DG au début de la différenciation.

Comme nous l’avons observé, la longueur et la ramification des neurites augmentent avec la différenciation. Un pourcentage élevé de cellules prolifératives est observé dans SVG par rapport à DG. Bien que le pourcentage de progéniteurs proliférants qui se différencient en neurones matures est similaire dans les deux niches névrogènes. Les deux types de cellules sont également capables de se différencier en neurones immatures, neutrons matures, cellules précurseurs oligodendrocytes, oligodendrocytes matures, et les astrocytes.

Après avoir obtenu les neurosphères, plusieurs méthodes, y compris l’immunocytochimie, l’imagerie calcique, les taches occidentales et rt-PCR peuvent être effectuées pour étudier la tige et la multipotence des cellules souches/progénitrices neurales. L’analyse de la neurosphère peut être appliquée à des modèles génétiques et de maladies pour évaluer davantage les processus moléculaires et cellulaires impliqués à la fois dans la prolifération et la différenciation des cellules souches/progénitrices neurales.