Interrogation parallèle du recrutement d'2-Arrestin2 pour le dépistage de Ligand sur une échelle GPCR-Wide utilisant PRESTO-Tango Assay

La plate-forme Presto-Tango a été conçue pour exécuter l’interrogatoire parallèle et simultané de tous les RPG non olfactifs dans le génome humain, y compris les cibles orphelines pour profiler le recrutement bêta-arrestin 2 induit par ligand. La plate-forme Presto-Tango est la seule ressource open source pour le profilage de l’ensemble du génome du GPCR dans une approche parallèle, en utilisant une protéine G indépendante bêta-arrestin analyse de recrutement. Geneviève Laroche, associée de recherche dans mon laboratoire, et Manel Zighal, doctorante dans mon laboratoire, feraient la démonstration du processeur.

Avant de commencer la procédure ajouter 20 microlitres d’une solution poly-L-lysine de 25 microgrammes par millilitre à chaque puits du nombre expérimental approprié de 384 plaques de fond optiques et incuber les plaques à température ambiante pendant 30 minutes à deux heures. À la fin de l’incubation, feuilleter les plaques sur l’évier pour enlever l’excès de poly-L-lysine et ajouter 40 microlitres de solution antimycotique antibiotique à chaque puits. Ensuite, incuber les plaques nécessaires à l’ensemencement cellulaire à 37 degrés Celsius et placer le reste des plaques à quatre degrés Celsius pour le stockage à long terme.

Pour semer les cellules HTLA pour le dépistage primaire, rincer délicatement les cultures cellulaires confluentes de 150 millimètres avec 10 millilitres de PBS avant de traiter les cultures avec six millilitres de 0,05% trypsine EDTA par plat. Lorsque les cellules se sont détachées de la piscine, les suspensions cellulaires dans un tube conique de 50 millilitres contenant un volume égal de DMEM. Et recueillir les cellules par centrifugation.

Suspendre à nouveau la pastille à 2,2 fois 10 à la cinquième cellule par millilitre de concentration de DMEM et feuilleter les plaques sur l’évier pour enlever la solution antibiotique antimycotique. Appuyez sur les plaques pour sécher et ensemencer 45 microlitres de cellules dans chaque puits. Placez ensuite les plaques à 37 degrés Celsius et 45 % de dioxyde de carbone pendant la nuit.

Pour préparer la plaque source d’ADN de puits 384 pour la transfection distribuer 50 nanogrammes par millilitre de chaque adn plasmide gratuit codant la construction GPRC Tango d’intérêt dans 0,1X Tris-EDTA par puits dans chaque puits d’une plaque de puits 96. Utilisez une pipette multicanal pour transférer manuellement 10 microlitres de solution d’ADN de chaque puits de la plaque de puits 96 à des puits individuels d’une plaque source d’ADN de 384 puits en quadruplicate pour chaque condition, comme illustré. Ensuite, transférez 40 microlitres d’une solution molaire de chlorure de calcium de 0,313 molaire à chaque puits de la plaque source d’ADN et mélangez doucement le contenu de chaque puits.

Ajouter 50 microlitres de tampon HEPES 2x à chaque puits de la plaque source d’ADN du puits 384 avec mélange doux. Après un transfert d’une minute, 10 microlitres du mélange de transfection de l’ADN de la plaque source d’ADN de 384 puits à chaque puits de cellules HTLA ensemencées et d’incubation des cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant la nuit. Le lendemain décanter le milieu cellulaire transfecté et ajouter lentement 40 microlitres de milieu affamé à chaque puits en prenant soin de ne pas toucher les cellules directement.

Ajouter ensuite 20 microlitres du tampon du véhicule pour les rangées alternées sans composé dans 20 microlitres du composé d’intérêt à une concentration de trois fois dans les rangées alternées, avant de retourner la plaque à l’incubateur de culture cellulaire. 16 à 24 heures après le décantation de la stimulation du milieu cellulaire transfecté et ajouter 20 microlitres de réapprovisionnement lumineux fraîchement préparé à chaque puits pendant une incubation de cinq à 20 minutes à température ambiante protégée de la lumière. Lisez ensuite les plaques sur un compteur de luminescence à micro-plaques avec un temps d’intégration d’une seconde par puits.

Pour un dépistage secondaire, sous-culture des cellules HTLA dans des plats de 100 millimètres à cinq fois 10 à la densité cellulaire totale des six cellules en 11 millimètres de milieu complet par plat pendant 24 heures à 37 degrés Celsius. Le lendemain, mélangé 10 microgrammes d’ADN gratuit GPCR avec 500 microlitres de tris-EDTA solution de chlorure de calcium avec vortex suivi de l’ajout de 500 microlitres de tampon HEPES. Après avoir secoué vigoureusement, incuber la solution pendant une minute à température ambiante et ajouter immédiatement un millilitre de la solution goutte sage sur les cellules.

Bercer doucement pour répartir uniformément le précipité et placer la plaque à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Le lendemain, vérifiez l’efficacité de la transfection sous un imageur de cellule fluorescente. Les transactions supérieures à 50 % sont idéales.

Rincer doucement les cellules transfectées avec la solution versène avant de détacher les cellules avec trois millilitres de 0,05% trypsine EDTA. Recueillir les cellules dissociées par centrifugation et suspendre à nouveau la pastille à quatre fois 10 à la cinquième cellule par millilitre de concentration moyenne affamée. Puis ensemencer 45 microlitres de cellules dans chaque puits d’une plaque de puits codée poly-L-lysine 384 et placer la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant au moins quatre heures.

Pour préparer une demi-plaque de réponse dose-courbe de notation ajouter 270 microlitres de HBSS complétés avec HEPES et antibiotique antimycotique à tous sauf la dernière rangée d’une plaque de puits 96 et ajouter 30 microlitres de chaque solution médicamenteuse haute et basse aux puits de la rangée H.Transférer la solution de chaque puits de la rangée H dans le puits correspondant de la rangée G avec mélange et continuer à diluer périodiquement les composés médicamenteuses jusqu’à la dernière rangée de la plaque est atteint. En utilisant le schéma comme référence, mélanger 20 microlitres des dilutions à basse colonne des rangées A à G de la plaque de puits 96 et 20 microlitres des dilutions de la colonne haute aux puits B à H de la plaque de puits 96 à la plaque de puits précédemment assise 384. Puis incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant au moins 16 heures.

16 à 24 heures après le décantation de la stimulation du milieu cellulaire transfecté et ajouter 20 microlitres de réaccent de lueur à chaque puits pendant une incubation de cinq à 20 minutes avant de lire les plaques sur un compteur de luminescence de micro plaque avec un temps d’intégration d’une seconde par puits. Dans cette expérience représentative, sur les 168 RPG qui ont été interrogés lors du dépistage primaire, seuls les récepteurs dopaminergiques D3 et opsin 5 étaient des prétendants comme cibles actives potentielles. Le récepteur de dopamine D3 a produit un changement significatif de pli de log2 de 4.7 tandis que l’opsin 5 a produit une réponse légèrement inférieure de 2.39.

En comparaison, le récepteur de dopamine D2, le contrôle positif pour l’écran primaire a produit un changement de pli de log2 de 4.58. Ces courbes de réponse du criblage secondaire ont démontré que l’extrait de granule de chromatine produisent les fenêtres semblables de signal dans la moitié des valeurs efficaces maximales de concentration au quinpirole confirmant sa validité en tant que coup actif au récepteur de dopamine D3. Une dose-courbe plate semblable au contrôle négatif a été produite pour opsin 5 cependant excluant ce récepteur comme cible possible pour l’extrait de granule de chromatine. Presto-Tango nécessite des soins spéciaux car les variabilités de la distribution cellulaire, de l’efficacité de la transfection et des dilutions de médicaments en série peuvent entraîner des erreurs aggravées, ce qui peut affecter l’exactitude des données.

Des méthodes orthogonales telles que les approches radioligand-contraignantes, le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence et le calcium cyclique d’AMP et les analyses fonctionnelles d’internalisation peuvent être employées pour confirmer et caractériser davantage des interactions de récepteur de ligand.