Name: L’extraction du génome guidée par spectrométrie de masse comme outil pour découvrir de nouveaux produits naturels (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Découvrez le minage du génome guidé par spectrométrie de masse pour identifier des molécules bioactives dans des extraits microbiens et végétaux complexes. Cette méthode intègre le séquençage génomique et l'analyse LC-MS/MS.

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Le soutien financier apporté à cette étude a été fourni par la Fondation de recherche de Sao Paulo - FAPESP (2019/10564-5, 2014/12727-5 et 2014/50249-8 à L.G.O; 2013/12598-8 et 2015/01013-4 à R.S.; et 2019/08853-9 à C.F.F.A). B.S.P, C.F.F.A., et L.G.O. ont reçu des bourses du Conseil national pour le développement scientifique et technologique - CNPq (205729/2018-5, 162191/2015-4, et 313492/2017-4). L.G.O. est également reconnaissant pour le soutien de subvention fourni par le programme Pour les femmes en sciences (2008, Édition brésilienne). Tous les auteurs reconnaissent capeS (Coordination pour l’amélioration du personnel de l’enseignement supérieur) pour soutenir les programmes post-diplôme au Brésil.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’avantage le plus fort de ce protocole est sa capacité à déposifier rapidement les profils métaboliques et à combler l’information génomique avec les données de la SP afin d’élucider les structures de nouvelles molécules, en particulier les analogues structurels2. Sur la base d’informations génomiques, différents produits naturels chemotypes peuvent être étudiés, tels que les polyketides (PK), peptides nonribosomal (NRP), et les produits naturels glycosylés (PNB), ainsi que les BGCs cryptiques. L...

Les études sur le métabolisme secondaire consistent souvent à filtrer des extraits bruts pour des activités biologiques spécifiques suivies de la purification, de l’identification et de la caractérisation des constituants appartenant à des fractions actives. Ce processus s’est avéré efficace, favorisant l’isolement de plusieurs entités chimiques. Cependant, aujourd’hui, cela est considéré comme irréalisable, principalement en raison des taux élevés de redécouverte. Comme l’industrie pharmaceutique a révolutionné sans connaître les rôles et les fonctions des métabolites spécialisés, leur identification a été effectuée dans des conditions de laboratoire qui ne représentaient pas exactement la nature1. Aujourd’hui, il y a une meilleure compréhension des influences naturelles de signalisation, de la sécrétion, et de la présence de la plupart des cibles à des concentrations anormalement basses. De plus, la réglementation du processus aidera la communauté universitaire et l’industrie pharmaceutique à tirer parti de ces connaissances. Il bénéficiera également à la recherche impliquant l’isolement direct des métabolites liés aux grappes de gènes biosynthétiques silencieuses (BGC)2.
Dans ce contexte, les progrès du séquençage génomique ont renouvelé leur intérêt pour le dépistage des métabolites micro-organismes. C’est parce que l’analyse de l’information génomique des amas biosynthétiques non découverts peut révéler des gènes codant de nouveaux composés non observés ou produits dans des conditions de laboratoire. De nombreux projets ou projets de génome entier microbien sont disponibles aujourd’hui, et le nombre augmente chaque année, offrant des perspectives massives pour découvrir de nouvelles molécules bioactives grâce à l’exploitation minière du génome3,4.
L’Atlas of Biosynthetic Gene Clusters est la plus grande collection actuelle de grappes de gènes automatiquement extraites en tant que composant de la plate-forme intégrée des génomes microbiens de l’Institut mixte du génome (JGI IMG-ABC)2. Plus récemment, l’Initiative de normalisation des grappes de gènes biosynthétiques (MIBiG) a favorisé la reannotation manuelle des BGC, fournissant un ensemble de données de référence très organisé5. Aujourd’hui, de nombreux outils sont disponibles pour permettre l’extraction informatique des données génétiques et leur connexion aux métabolites secondaires connus. Différentes stratégies ont également été élaborées pour accéder à de nouveaux produits naturels bioactifs (c.-à-d. l’expression hétérogène, la suppression des gènes cibles, la reconstitution in vitro, la séquence génomique, le dépistage guidé par isotopes [approche génoto-américaine], la manipulation des régulateurs locaux et mondiaux, l’exploitation minière axée sur les cibles de résistance, l’exploitation minière indépendante de la culture et, plus récemment, les approches de ms-guided/code2,6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15).
L’extraction du génome comme stratégie singulière nécessite des efforts pour annoter un seul ou un petit groupe de molécules; ainsi, des lacunes subsistent dans le processus dans lequel de nouveaux composés sont priorisés pour l’isolement et l’élucidation de la structure. En principe, ces approches ne ciblent qu’une seule voie biosynthétique par expérience, ce qui entraîne un faible taux de découverte. En ce sens, l’utilisation de GM avec une approche de réseautage moléculaire représente une avancée importante pour la recherche sur les produits naturels14,15.
La polyvalence, la précision et la sensibilité élevée de la spectrométrie de masse chromatographie liquide (LC-MS) en font une bonne méthode d’identification composée. Actuellement, plusieurs plates-formes ont investi des algorithmes et des suites logicielles pour métabolomiques non ciblés16,17,18,19,20. Le cœur de ces programmes comprend la détection des fonctionnalités (pic de sélection)21 et l’alignement de pointe, ce qui permet de faire correspondre des caractéristiques identiques à travers un lot d’échantillons et de rechercher des modèles. Les algorithmes basés sur les modèles de SP22,23 comparent les modèles caractéristiques de fragmentation et correspondent aux similitudes de MS2 générant des familles moléculaires partageant des caractéristiques structurelles. Ces caractéristiques peuvent ensuite être mises en évidence et regroupées, conférant la possibilité de découvrir rapidement des molécules connues et inconnues à partir d’un extrait biologique complexe par tandem MS2,24,25. Par conséquent, la SP tandem est une méthode polyvalente pour obtenir des informations structurelles de plusieurs chemotypes contenus dans une grande quantité de données simultanément.
L’algorithme Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS)26 utilise l’intensité normalisée des ions fragmentés pour construire des vecteurs multidimensionnels, dans lesquels les similitudes sont comparées à l’aide d’une fonction cosine. La relation entre les différents ions parentaux est tracée dans une représentation de diagramme, dans laquelle chaque fragmentation est visualisée comme un nœud (cercles), et la relation de chaque nœud est définie par un bord (lignes). La visualisation globale des molécules à partir d’une seule source est définie comme un réseau moléculaire. Des molécules structurellement divergentes qui se fragmentent de façon unique formeront leur propre amas ou constellation spécifique, tandis que les molécules apparentées s’assemblent. Les chemotypes de regroupement permettent la connexion hypothétique de caractéristiques structurelles similaires à leurs origines biosynthétiques.
La combinaison des approches chemotype-génotype et génotype-chemotype est puissante lors de la création de liens bioinformatiques entre les BGC et leurs produits à petites molécules27. Par conséquent, l’extraction du génome guidée par ms est une méthode rapide et une stratégie peu consommatrice de matériaux, et elle aide à combler les ions parentaux et les voies biosynthétiques révélées par WGS d’une ou plusieurs souches dans diverses conditions métaboliques et environnementales.
Le flux de travail de ce protocole (figure 1) consiste à alimenter les données WGS dans une plate-forme d’annotation de grappes génétiques biosynthétiques telles que l’antiSMASH28,29,30. Il permet d’estimer la variété des composés et la classe des composés codés par le génome. Une stratégie visant à cibler un groupe génétique biosynthétique codant une entité chimique d’intérêt doit être adoptée, et des extraits de culture d’une souche de type sauvage et/ou d’une souche hétérologue contenant le BGC peuvent être analysés pour générer des ions groupés basés sur des similitudes à l’aide duPNBS 26,31. Par conséquent, il est possible d’identifier de nouvelles molécules qui s’associent au BGC ciblé et ne sont pas disponibles dans la base de données (principalement des analogues inconnus, parfois produits en bas de la vie). Il est pertinent de considérer que les utilisateurs peuvent contribuer à ces plates-formes et que la disponibilité des données bioinformatiques et MS/MS augmente rapidement, conduisant à un développement constant et la mise à niveau d’outils et d’algorithmes informatiques efficaces pour guider les connexions efficaces d’extraits complexes avec des molécules.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60825/60825fig1b.jpg"> Figure 1 : Aperçu de l’ensemble du flux de travail. On y voit une illustration des étapes bioinformatiques, clonage et de réseautage moléculaire impliquées dans l’approche décrite d’extraction du génome guidée par ms pour identifier de nouveaux métabolites. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60825/60825fig1blarge.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Ce protocole décrit un flux de travail rapide et efficace pour combiner l’extraction du génome et le réseautage moléculaire comme point de départ pour le pipeline naturel de découverte de produits. Bien que de nombreuses applications soient capables de visualiser la composition et la dataabilité des molécules détectables par la SP dans un réseau, plusieurs sont adoptées ici pour visualiser des molécules groupées structurellement similaires. En utilisant cette stratégie, de nouveaux produits de cyclodepsipeptide observés dans les extraits métaboliques de Streptomyces sp. CBMAI 2042 sont identifiés avec succès. Guidé par l’extraction du génome, l’ensemble du codage de faisceau de gènes biosynthétique pour les valinomycines est reconnu et cloné dans la souche productrice Streptomyces coelicolor M1146. Enfin, à la suite d’un réseau moléculaire basé sur le modèle de SP, les molécules détectées par LAS sont corrélées avec les BGC responsables de leur biogenèse32.

<table><tbody><tr><td>Acétonitrile</td><td>Tedia</td><td>AA1120-048</td><td>Gélose de qualité HPLC</td></tr><tr><td></td><td>Oxoid</td><td>LP0011</td><td>NA</td></tr><tr><td>Apramycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2024</td><td>NA</td></tr><tr><td>Carbenicilline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9231</td><td>NA</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td>5804</td></tr><tr><td>Chloramphénicol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3175</td><td>NA</td></tr><tr><td>Colonne C18</td><td>Agilent Technologies</td><td>NA</td><td>ZORBAX RRHD Extend-C18, 80&Aring ;, 2,1 x 50 mm, 1,8 & micro ; m, 1200 bar limite de pression P/N 757700-902</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>K1377</td><td>NA</td></tr><tr><td>Manitol P.A.- A.C.S.</td><td>Synth</td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td>5418</td></tr><tr><td>Acide nalidixique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4382</td><td>NA</td></tr><tr><td>Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F548S</td><td></td></tr><tr><td>NA Q-TOF Spectromètre de masse</td><td>Agilent technologies</td><td>NA</td><td>6550 iFunnel Q-TOF LC/MS</td></tr><tr><td>Sacarose P.A.- A.C.S.</td><td>Synth</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>NA Shaker/Incubator</td><td>Marconi</td><td>MA420</td><td>NA</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Synth</td><td>NA</td><td>P. A. - ACS</td></tr><tr><td>Extrait de soja</td><td>NA</td><td>NA NA</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td></td><td>Synth NA</td><td>P. A. - ACS</td></tr><tr><td>Thermal Cycles</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td>Mastercycler Nexus Gradient</td></tr><tr><td>Thiostrepton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8902</td><td>NA</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Oxoid</td><td>LP0042</td><td>NA</td></tr><tr><td>Tryptone Bouillon de soja</td><td></td><td>Oxoid CM0129</td><td></td></tr><tr><td>NA UPLC</td><td>Agilent Technologies</td><td>NA</td><td>1290 Infinity LC System</td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td>NA</td></tr></tbody></table>

l’extraction du génome guidée par spectrométrie de masse comme outil pour découvrir de nouveaux produits naturels

Mass Spectrometry-Guided Genome Mining as a Tool to Uncover Novel Natural Products

L’espace chimique couvert par les produits naturels est immense et largement méconnu. Par conséquent, des méthodologies pratiques pour effectuer une évaluation de grande envergure de leurs fonctions dans la nature et les avantages humains potentiels (p. ex., pour les applications de découverte de médicaments) sont souhaitées. Ce protocole décrit la combinaison de l’extraction du génome (GM) et du réseautage moléculaire (MN), deux approches contemporaines qui correspondent aux annotations codées par les grappes génétiques dans le séquençage du génome entier avec des signatures de structure chimique provenant d’extraits métaboliques bruts. C’est la première étape vers la découverte de nouvelles entités naturelles. Ces concepts, lorsqu’ils sont appliqués ensemble, sont définis ici comme l’exploitation du génome guidée par la SP. Dans cette méthode, les composants principaux sont auparavant désignés (à l’aide de MN), et les nouveaux candidats structurellement liés sont associés à des annotations de séquences génomiques (à l’aide de GM). La combinaison de GM et de MN est une stratégie rentable visant à cibler de nouvelles colonnes dorsales de molécules ou à récolter des profils métaboliques afin d’identifier les analogues des composés déjà connus.

Le protocole a été illustré avec succès à l’aide d’une combinaison d’extraction du génome, d’expression hétérogène et d’approches guidées par le MS/code pour accéder à de nouvelles molécules spécialisées d’analogues de la valinomycine. Le flux de travail génome-molécule pour la cible, la valinomycine (VLM), est représenté dans la figure 8. Streptomyces sp. CBMAI 2042 projet génome a été analysé dans silico, et le faisceau de gène VLM a ensuite été identifié et transféré à un hôte hé...

Un protocole d’extraction du génome guidé par spectrométrie de masse est établi et décrit ici. Il est basé sur l’information sur la séquence génomique et l’analyse LC-MS/MS et vise à faciliter l’identification des molécules à partir d’extraits microbiens et végétaux complexes.

L’extraction du génome guidée par spectrométrie de masse comme outil pour découvrir de nouveaux produits naturels

The chemical space covered by natural products is immense and widely unrecognized. Therefore, convenient methodologies to perform wide-ranging evaluation ...

Le séquençage du génome entier, l’extraction du génome et le réseautage moléculaire constituent la base du guide de spectrométrie de masse que nous décrivons ici. Et sont l’approche la plus contemporaine dans la découverte de produits naturels. L’extraction du génome et la mise en réseau moléculaire correspondent en grappe, dans des annotations codées dans le séquençage du génome entier avec des signatures de restructuration chimique à partir d’extraits bruts offrant des perspectives massives pour découvrir le nombril par des molécules actives.En principe, l’extraction du génome cible un seul ou un petit groupe de molécules par expérience. Ce qui entraîne un taux de découverte lent. En ce sens, l’utilisation de l’extraction du génome ainsi que le réseautage moléculaire représentent une avancée importante pour la recherche sur les produits naturels.L’exploration du génome du guide de spectrométrie de masse est une méthode polyvalente qui peut structurer simultanément l’information de plusieurs chimiotypes contenus dans la grande quantité de données provenant d’un extrait brut. Aujourd’hui, il est haute gamme méthodologie capable d’explorer les bactéries, fongiques ou plantes séquence fournissant. Le chimiotype au génotype et au génotype à la bioinformatique de chimiotype relie les grappes biosynthétiques et sont de petits produits de molécules.L’audition du protocole est démontrée pour caractériser les profondeurs du cycle du nombril Peptide produits observés dans les extraits métaboliques des espèces de streptocyces. Mais il s’applique à la séquence fongique et végétale et des extraits ainsi. Il est très important d’avoir un ensemble de données sur le génome bien organisé et, de nos jours, des séquences de brouillons fragmentées sont de plus en plus supplantées par des données de séquence presque terminées.En outre, différentes stratégies ont été élaborées pour accéder à de nouveaux produits naturels bioactifs et certainement les combiner avec l’approche MS-Guide. Nous allons conduire à l’amélioration de l’isolement des produits naturels et l’élucidation de la structure. Comme ici nous connectons le génotype à l’approche de chimiotype, les liens bioinformatiques entre les grappes biosynthétiques et il y a de petits produits de molécule sont cruciaux.d’estimer la variété et la classe des composés et d’encoder par génome. Ce qui veut dire la réplication. Plus tard, le clustering basé sur des similitudes d’ion peut être préformé en utilisant GNPS.Le Dr Renata Sigrist et le professeur Angolini, mes collaborateurs dans cette étude, démontreront la procédure. Pour obtenir en silico des informations sur le métabolisme secondaire des annotations de faisceaux génétiques à partir d’un génome de séquence complète. Soumettez le fichier séquence, banque de gènes E-M-B-L ou format plus rapide, à une plate-forme anti-smash.Donc, comme les grappes génétiques d’intérêt à partir des données de sortie basées sur le cluster le plus similaire connu. Sur la base des informations de séquence d’ADN du BGC, concevoir des primaires entre 20 et 25 nucléotides flanquant le groupe génétique pour les streptomyces ecoli. Criblage artificiel de bibliothèque de chromosome.Après avoir obtenu l’organisme héterologique recombinant selon le manuscrit, inoculer un 100e des souches préculture dans les supports de fermentation appropriés. Tels que les supports isp2 liquides. Placez la culture sur un incubateur à 30 degrés Celsius et 220 RPM, pendant sept jours.Après l’inoculation, centrifuger les cultures à 2200 fois G pendant 10 minutes. Jeter les cellules et transférer le supernatant dans un entonnoir séparateur. Ajouter un à un volume d’acétate d’éthyle et agiter.Attendez une à trois minutes pour que les couches organiques et acquiescées se séparent. Et recueillir la couche organique dans un flacon Erlenmeyer. Pour acquérir des données ms/MS.Programme approprié HPLC et les méthodes de spectrométrie de masse en utilisant le logiciel de contrôle. Il est à noter que le réseau MS/MS est le réseau moléculaire détectable dans les conditions spectrométriques de masse données. Convertissez les spectres de masse en format mzXML à l’aide de MS Convert de l’assistant protéa.Ajustez les paramètres d’entrée pour la conversion. Téléchargez les fichiers LC-MS/MS convertis dans la base de données GNPS. Deux options sont disponibles.Utilisation d’un protocole de transfert de fichiers ou directement dans un navigateur via la plate-forme en ligne. Après avoir créé un compte dans GNPS, connectez-vous au compte créé et sélectionnez créer un réseau moléculaire. Ajouter un titre d’emploi.Pour effectuer des options de base. Sélectionnez les fichiers mzXML pour effectuer le réseau moléculaire. Organisez-les en six groupes.Donc, comme les bibliothèques pour la routine de déreplication. Sélectionnez la tolérance à la masse des ion précurseurs et fragmenter Da sur la tolérance de masse de 0,02 Dalton et 0,05 Dalton respectivement. Pour effectuer des options réseau avancées, sélectionnez les paramètres qui ont directement influencé la taille et la forme du cluster réseau.Les paramètres avancés sont dans la documentation GNPS. Choisissez une adresse e-mail pour recevoir une alerte lorsque le travail est terminé et soumettre le travail. Analyser les résultats du GNPS.Connectez-vous au GNPS. Sélectionnez des emplois, travail publié, fait pour ouvrir un travail. Une page Web s’ouvre avec tous les résultats obtenus à partir de la mise en réseau moléculaire affichée.Sélectionnez afficher les familles spectrales dans le visualiseur réseau du navigateur pour voir tous les clusters réseau. Une liste est affichée avec tous les clusters de réseautage moléculaire générés. L’identification moléculaire provisoire est affichée dans toutes les pièces d’identité.Sélectionnez le spectacle pour les visualiser. Pour analyser le cluster réseau moléculaire, sélectionnez visualiser le réseau. Dans la boîte d’étiquettes des nœuds, sélectionnez la masse des parents.Dans la boîte d’étiquettes de bord, sélectionnez co-sign ou Delta Emz. Observer la similitude des nœuds ou la différence de masse entre les nœuds respectivement. Dans le cas de l’analyse multi-groupes, cliquez sur dessiner des tartes dans la boîte à colorier nœud.Observer la fréquence à laquelle chaque nœud apparaît dans chaque groupe. Pour voir toutes les bibliothèques, sélectionnez la vue, toutes les bibliothèques, les visites. Ouvrez les spectres de fragmentation directement dans la plate-forme GNPS.Ou dans les fichiers bruts originaux pour confirmer manuellement les composés de dréplication et l’élucidation de la structure des composés connexes. Le protocole a été illustré avec succès à l’aide d’une combinaison d’exploration du génome, d’expression héterologeuse et d’approches de code guidées par la SP. Pour accéder à de nouvelles molécules spécialisées de valinomycine et analogiques.Le flux de travail génome à molécule de la valinomycine cible est présenté ici. Le chromatogramme a prouvé que la valinomycine, la montanastatine et cinq analogues ont été produits par valinomycine, expression biosynthétique de faisceaux de gène dans un hôte heterologous. Ions de réseautage moléculaire correspondant à la valinomycine, un composé déjà connu avec les grappes génétiques biosynthétiques correspondantes annotées chez les espèces de streptomyces, CBM AI deux zéro quatre deux génomes.Sont regroupés avec des ions liés aux analogues, d’abord décrit pour le cluster génétique biosynthétique de valinomycine. Les spectres de SP et les structures chimiques pour la valinomycine et les analogues connexes, sont montrés ici. Effectuer le séquençage du génome entier et un véritable ensemble de données de séchage est la première étape pour l’élection d’un cluster biosynthétique pour MS-guider l’exploration du génome.L’ensemble de la procédure peut être effectuée avec les types sauvages string extrait brut, mais vous pouvez choisir de sélectionner le groupe génétique de votre intérêt et de promouvoir l’expression héterologique. Différentes méthodes sont décrites pour capturer l’ensemble du groupe génétique biosynthétique à partir d’un échantillon d’ADN. L’avantage le plus important de ce protocole est sa capacité de reproduire rapidement les profils métaboliques et de reproduire des informations génomiques avec des données sur la SP.Afin d’élucider ces molécules telles que de nouvelles molécules. Et l’extraction du génome du guide de masse a d’abord été décrite dans le domaine de la génomique peptidique et de la glycogéomique par Doris Chime et ses collègues. Et après l’introduction de la métabolomique intégrée NPS et l’approche d’extraction du génome sont devenus la voie la plus polyvalente pour connecter les réseaux moléculaires avec les capacités biosynthétiques.

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