Name: Livraison de l’ARNm modifié dans un modèle de souris infarctus du myocarde (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Découvrez la livraison d'ARNm modifié dans le cœur après infarctus du myocarde chez la souris. Cette méthode standardisée permet une surexpression transitoire de gènes d'intérêt pour la recherche cardiaque et les essais cliniques.

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Les auteurs reconnaissent Ann Anu Kurian pour son aide avec ce manuscrit. Ces travaux ont été financés par une subvention de démarrage en cardiologie accordée au laboratoire Zangi ainsi que par la subvention des NIH R01 HL142768-01

Toutes les procédures animales décrites ici ont été approuvées par l’École de médecine Icahn du Comité des soins et de l’utilisation des établissements du Mont Sinaï.
1. Synthèse de modRNA
NOTE : Les détails de la synthèse de modRNA peuvent être trouvés dans Kondrat et al.13.
<ol><li>Commandez les modèles plasmides (Table des matériaux)et générer un produit PCR propre à utiliser comme modèle d’ARNm.</li>
	<li>Préparer les modARN par transcription in vitro avec un mélange ribonucléoside personnalisé de ce qui suit (Tableau des matériaux):Kit de transcription T7, 6 mM anti-reverse cap analogique (ARCA) 30-O-Me-m7G(50) ppp(50)G, 75 mM guanosine triphosphate, 75 mM adénosine triphosphate, 75 mM cytidine triphosphate, 100 mM pseudouridine-5-triphosphate, et T7 DNase enzyme.</li>
	<li>Purifier le modRNA fait à l’étape 1.2 avec un kit de nettoyage de transcription (Table des matériaux) et traiter avec la phosphatase antarctique. Ensuite, réutiliser le modRNA avec le kit de nettoyage de transcription et le quantifier à l’aide d’un spectrophotomètre.</li>
	<li>Précipitez le modRNA avec de l’éthanol et de l’acétate d’ammonium et resuspendez en 10 mM Tris-HCl et 1 mM EDTA.</li>
	<li>Concentrer le modRNA pour la livraison in vivo par des filtres centrifuges et mesurer la qualité à l’aide d’une plate-forme automatisée d’électrophorèse (Table des matériaux).</li>
</ol>2. Préparation de l’injection de modRNA pour la livraison in vivo
<ol><li>Calculer le volume nécessaire pour 100 μg d’injection de luciferase (Luc)/Cre modRNA en fonction de la concentration de modRNA.</li>
	<li>Mélanger le volume calculé de modRNA avec des parties égales de la solution de saccharose préparée dans de l’eau libre de nucléase (0,3 g/mL) et la solution de citrate de 0,1 M (pH = 7) (20 μL chacun recommandé).</li>
	<li>Porter le volume final de l’injection à 60 μL en ajoutant une solution saline.</li>
</ol>3. Chirurgie d’infarctus du myocarde
<ol><li>Anesthésie et préparation de l’animal REMARQUE : Cette étude utilise des souris CFW mâles et femelles âgées de 8 à 12 semaines.<ol>
<li>Anesthésier la souris avec 2% d’isoflurane à l’aide d’une chambre à induction et placer l’animal sur son dos dans une position dorsale avec un masque facial sur son nez et la bouche pour maintenir l’anesthésie. Maintenir l’anesthésie par ventilation mécanique à l’aide d’un respirateur équipé d’un tube des voies respiratoires de 7 à 8 mm et d’un filtre.</li>
		<li>Pour immobiliser la souris sur la plate-forme chirurgicale, fixer ses membres avec du ruban adhésif chirurgical. raser la région du cou et le côté gauche de la cage thoracique et désinfecter à l’aide de 70% d’éthanol et d’iode povidone. Répétez l’étape de désinfection deux fois. Vérifiez ses réflexes, en pinçant la queue et les pieds arrière pour évaluer la profondeur de l’anesthésie.</li>
		<li>Surveiller et maintenir en permanence la température corporelle centrale à la normothermie (37,5−38 °C).</li>
		<li>Maintenir une voie aérienne ouverte en effectuant l’intubation intratrachéale. Pour ce faire, placez la souris dans une position ventrale avec sa bouche orientée vers l’expérimentateur et retirez doucement la langue. Ajuster l’angle du cou et redresser le chemin d’intubation et pousser dans la canule d’intubation.</li>
		<li>Dans le cas où l’animal est incapable de respirer à travers elle, la trachéotomie peut être effectuée. Effectuer une incision cervicale le long de la ligne médiane isolant la peau, le muscle et le tissu décrivant la trachée à l’aide d’un microscope. Lorsque la trachée est clairement visible, insérez le tube endotrachéal dans le tissu entre deux anneaux de cartouche sous la glotte en faisant un petit trou et en maintenant la partie crânienne de la trachée à l’aide de forceps microchirurgicales.</li>
		<li>Observez le mouvement thoracique de la souris pour vérifier que les deux poumons reçoivent de l’oxygène. La fréquence respiratoire (RR) devrait être d’environ 120 respirations par minute, avec une pression inspiratrice de 17−18 cm H2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ligature de l’artère descendante antérieure gauche (LAD)<ol>
<li>Pour effectuer la ligature LAD, tournez la souris soigneusement de sorte qu’elle est couchée sur son côté droit. Soulevez la peau et effectuez une thoracotomie latérale gauche entre la 3ème et la 4ème côte et disséquez soigneusement le tissu et le muscle. Utilisez une cautérise pour prévenir les saignements.</li>
		<li>Ouvrez soigneusement le thorax et une fois qu’il est ouvert, trouver le cœur, sans toucher le poumon avec un objet pointu. Placez les rétractateurs dans l’incision pour garder la cavité thoracique ouverte et avoir une vue claire du cœur. Maintenant, déplacez les poumons au bord de l’incision et enlever la partie du sac péricardique qui recouvre le cœur pour accéder à la surface antérieure du cœur.</li>
		<li>Identifiez soigneusement le LAD, qui peut être considéré comme un vaisseau rouge clair profond situé entre l’artère pulmonaire et l’auricule gauche. Lier la proximité LAD avec une seule suture d’une suture de soie 7-0. Placer un tube thoracique (28 G, cathéter vénal), entre la 4e et la 5e côte.</li>
		<li>Fermez l’incision thoracique en couches. Utilisez les sutures de soie 6-0 pour adapter les côtes et utilisez des sutures en soie 5-0 pour fermer la peau. Assurez-vous de laisser une fenêtre appropriée pour la mesure échocardiographique future.</li>
		<li>Égoutter soigneusement le thorax avec une solution isotonique chaude (9 g de chlorure de sodium dans 1 L d’eau) à l’aide d’une seringue de 2 mL. Placez la souris sur son dos. Si vous effectuez une trachéotomie, sortez le tube endotrachéal et à l’aide de sutures de soie 7-0, adaptez les anneaux de cartouche trachéale d’un seul point. Placez le masque sur la souris et fermez la peau à l’aide de sutures en soie 5-0.</li>
		<li>Pour la phase de récupération, déconnectez la canule d’intubation du ventilateur et permettez une respiration spontanée. Placez l’animal sous une lampe thermique jusqu’à ce qu’il atteigne la conscience. Ne laissez pas l’animal sans surveillance après la chirurgie jusqu’à ce qu’il soit complètement éveillé.</li>
		<li>Gérez la thérapie de la douleur avec de la buprénophine à 0,1 mg/kg de poids corporel, injecté sous-cutanée pendant les 3 prochains jours à intervalles de 12 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Livraison cardiaque de modRNA
<ol><li>Délivrer un total de 60 μL du modRNA préparé à l’étape 2.3 intramusculaire (IM) à l’aide d’une seringue à insuline (31 G) à la suite d’une MI.<ol>
<li>Injectez 20 μL du modRNA à trois endroits différents du muscle cardiaque entourant la zone infarctus (deux de chaque côté de la ligature et un dans l’apex). Effectuez les injections immédiatement après le LAD, avant de fermer la poitrine. REMARQUE : Des images représentatives des sites d’injection modRNA peuvent être vues dans la figure 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Validation d’expression de protéine dans le poteau de coeur MI
<ol><li>Expression de Luciferase modRNA à l’aide d’un système d’imagerie en bioluminescence REMARQUE : Un total de 100 μg d’ARNm de Luc préparé dans 60 μL du tampon de citrate de saccharose est directement injecté dans le cœur des souris cfw après l’IM.<ol>
<li>À 24 h après l’injection de MI et de modRNA, anesthésiez les souris avec 2% d’isoflurane à l’aide d’une chambre d’induction et intraperitonone injectez de la luciferine (150 mg/g de poids corporel) pour valider le signal Luc in vivo.</li>
		<li>Imagez les souris à l’aide d’un système d’imagerie par bioluminescence toutes les 2 minutes jusqu’à ce que le signal Luc atteigne la saturation.</li>
		<li>Quantifier les données d’imagerie recueillies à l’une des données d’imagerie. Utilisez les souris injectées avec de la solution saline uniquement comme lecture de base pour l’expression de Luc et soustrayez le signal d’arrière-plan recueilli sur les souris salines injectées. REMARQUE : Le signal luc est exprimé en p/s/cm2/sr x 106.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immunostaining pour la validation de transfection Cre<ol>
<li>Pour valider la transfection avec Cre, sacrifiez les animaux 24 h post-injection à l’aide d’une injection intrapéritonéale de 100 mg/kg de kétamine et de 10 mg/kg de xylazine suivie d’une luxation cervicale. Avant de faire une incision, désinfecter la poitrine et l’abdomen à l’aide d’un écouvillon 70% d’alcool.</li>
		<li>Ouvrez la cavité thoracique en faisant une incision transversale ~1 cm plus bas que le sternum et déplacez les ciseaux vers la tête, en coupant à travers la cage thoracique.</li>
		<li>Ouvrez la poitrine et injectez 1 mL de PBS stérile dans la chambre ventriculaire droite pour enlever l’excès de sang. Exciser le cœur immédiatement et le placer dans le PBS stérile pour laver le sang restant.</li>
		<li>Fixer le cœur en 4% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 24 h, suivi de l’incubation de nuit dans une solution de saccharose à 30% à 4 °C. Le lendemain, incorporer les cœurs dans un milieu de température de coupe optimal et les sectionr à une épaisseur de 10 μm à l’aide d’un cryostat.</li>
		<li>Tacher les sections avec un anticorps primaire contre la troponine cardiaque I (cTNI) et les étiqueter avec un anticorps secondaire fluorescent. Pour identifier le noyau, tacher avec 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 5 min. Image les diapositives à l’aide d’un microscope fluorescent.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Analyse statistique
<ol><li>Tracez un graphique à barres basé sur l’expression luc chez les souris salines et luc-injectées et signalez les valeurs comme moyennes ± SEM. Comparez les deux groupes à l’aide d’un t-test non apparié (****p < 0,0001).</li>
</ol>

<ol><li>Muruve, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+innate+immune+response+to+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">The innate immune response to adenovirus vectors.</a> Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).</li>
<li>Donsante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observed+incidence+of+tumorigenesis+in+long-term+rodent+studies+of+rAAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors.</a> Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 (2001).</li>
<li>Calcedo, R., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humoral+Immune+Response+to+AAV%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humoral Immune Response to AAV.</a> Frontiers in Immunology. 4, 341(2013).</li>
<li>Diebold, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+agonists+for+Toll-like+receptor+7+are+defined+by+the+presence+of+uridine+ribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides.</a> European Journal of Immunology. 36 (12), 3256-3267 (2006).</li>
<li>Magadum, A., Kaur, K., Zangi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Based+Protein+Replacement+Therapy+for+the+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">mRNA-Based Protein Replacement Therapy for the Heart.</a> Molecular Therapy. 27 (4), 785-793 (2019).</li>
<li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).</li>
<li>Hadas, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Modified+mRNA+In+Vitro+Synthesis+Protocol+for+Heart+Gene+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Optimizing Modified mRNA In Vitro Synthesis Protocol for Heart Gene Therapy.</a> Molecular Therapy- Methods and Clinical Development. 14, 300-305 (2019).</li>
<li>Sultana, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Cardiac+Delivery+of+Modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimizing Cardiac Delivery of Modified mRNA.</a> Molecular Therapy. 25 (6), 1306-1315 (2017).</li>
<li>Zangi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+mRNA+directs+the+fate+of+heart+progenitor+cells+and+induces+vascular+regeneration+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction.</a> Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).</li>
<li>Carlsson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+VEGF-A+mRNA+Improves+Cardiac+Function+after+Intracardiac+Injection+1+Week+Post-myocardial+Infarction+in+Swine%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Methods+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Purified VEGF-A mRNA Improves Cardiac Function after Intracardiac Injection 1 Week Post-myocardial Infarction in Swine.</a> Molecular Therapy Methods Clinical Development. 9, 330-346 (2018).</li>
<li>Huang, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+chemically+modified+mRNA-based+delivery+of+cytoprotective+factor+promotes+early+cardiomyocyte+survival+post-acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Synthetic chemically modified mRNA-based delivery of cytoprotective factor promotes early cardiomyocyte survival post-acute myocardial infarction.</a> Molecular Pharmaceutics. 12 (3), 991-996 (2015).</li>
<li>Magadum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+a+Single+N-Glycosylation+Site+in+Human+FSTL+1+Induces+Cardiomyocyte+Proliferation+and+Cardiac+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Ablation of a Single N-Glycosylation Site in Human FSTL 1 Induces Cardiomyocyte Proliferation and Cardiac Regeneration.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 13, 133-143 (2018).</li>
<li>Kondrat, J., Sultana, N., Zangi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Modified+mRNA+for+Myocardial+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Modified mRNA for Myocardial Delivery.</a> Methods in Molecular Biology. 1521, 127-138 (2017).</li>
<li>Gan, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intradermal+delivery+of+modified+mRNA+encoding+VEGF-A+in+patients+with+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Intradermal delivery of modified mRNA encoding VEGF-A in patients with type 2 diabetes.</a> Nature Communication. 10 (1), 871(2019).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La thérapie génique a montré un potentiel énorme pour faire progresser de manière significative le traitement des maladies cardiaques. Cependant, les outils traditionnels utilisés dans les essais cliniques initiaux pour le traitement de la HF ont montré un succès limité et sont associés à des effets secondaires graves. L’ARN modifié présente une livraison de gène nonviral qui gagne continuellement en popularité en tant qu’outil de transfert de gènes dans le cœur. ModRNA ne nécessite aucune localisation nucléaire des gène...

La thérapie génique est un outil puissant impliquant la livraison d’acides nucléiques pour le traitement, la guérison ou la prévention des maladies humaines. Malgré les progrès dans les approches diagnostiques et thérapeutiques pour les maladies cardiaques, il y a eu un succès limité dans la livraison des gènes dans l’infarctus du myocarde (MI) et l’insuffisance cardiaque (HF). Aussi simple que le processus de thérapie génique semble, il s’agit d’une approche nettement complexe compte tenu des nombreux facteurs qui doivent être optimisés avant d’utiliser un véhicule de livraison particulier. Le vecteur de livraison correct doit être non immunogène, efficace et stable à l’intérieur du corps humain. Les efforts déployés dans ce domaine ont généré deux types de systèmes de prestation : le virus ou le non-viral. Les systèmes viraux largement utilisés, y compris le transfert de gènes par adénovirus, rétrovirus, lentivirus ou le virus adéno-associé, ont montré une capacité de transduction exceptionnelle. Cependant, leur utilisation dans les cliniques est limitée en raison de la réponse immunitaire forte induite1, le risque de tumorigenesis2, ou la présence d’anticorps neutralisants3, qui restent tous un obstacle majeur à l’application large et efficace des vecteurs viraux dans la thérapie génique humaine. D’autre part, en dépit de leur modèle d’expression impressionnant, la livraison de l’ADN plasmide nu affiche une faible efficacité de transfection, tandis que le transfert d’ARNm présente une immungénicité élevée et la susceptibilité à la dégradation par RNase4.
Avec la recherche approfondie dans le domaine de l’ARNm, modRNA est devenu un outil attrayant pour la livraison de gènes au cœur et divers autres organes en raison de ses nombreux avantages par rapport aux vecteurs traditionnels5. Le remplacement complet de l’uridine par la pseudouridine naturelle entraîne une expression protéique plus robuste et transitoire, avec une induction minimale de la réponse immunitaire innée et un risque d’intégration génomique6. Les protocoles récemment établis utilisent une quantité optimisée d’analogique anti-plafond inversé (ARCA) qui améliore encore la traduction des protéines en augmentant la stabilité et la transabilité del’ARNm synthétique 7.
Des rapports précédents ont montré l’expression de divers gènes reporter ou fonctionnels livrés par modRNA dans le myocarde de rongeur après MI. Avec les applications modRNA, des secteurs significatifs du myocarde, y compris les cardiomyocytes et les noncardiomyocytes, ont été transfectés avec succès des dommages post-cardiaques8 pour induire l’angiogenèse9,10, survie de cellules cardiaques11, et la prolifération cardiomyocyte12. Une seule administration de modRNA codée pour la follistatine humaine mutée-like 1 induit la prolifération des CM adultes de souris et augmente de manière significative la fonction cardiaque, diminue la taille de cicatrice, et augmente la densité capillaire 4 semaines après-MI12. Une étude plus récente a rapporté la fonction cardiaque améliorée après MI avec l’application de VEGFA modRNA dans un modèle de porc10.
Ainsi, avec la popularité accrue de modRNA dans le domaine cardiaque, il est essentiel de développer et d’optimiser un protocole pour la livraison de modRNA au cœur post-MI. Voici un protocole décrivant la préparation et la livraison de modRNA purifié et optimisé dans une formulation citrate-solution biocompatible qui fournit robuste, expression stable de protéine sans stimuler aucune réponse immunitaire. La méthode montrée dans ce protocole et vidéo démontre la procédure chirurgicale standard d’une souris MI par ligature permanente de l’artère descendante antérieure gauche (LAD), suivie de trois injections intracardiaques de site de modRNA. L’objectif de cet article est de définir clairement une méthode très précise et reproductible de livraison modRNA au myocarde murine pour rendre l’application modRNA largement accessible pour la thérapie génique cardiaque.

<table><tbody><tr><td>Adénosine triphosphate</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>Inclus dans le kit Megascript</td></tr><tr><td>Phosphatase antarctique</td><td>New England Biolabs</td><td>M0289L</td><td></td></tr><tr><td>Analogue anti-capuchon inversé, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>N-7003</td><td></td></tr><tr><td>Système d’imagerie bioluminescense</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>IVIS100 système d’imagerie de dispositif à couplage de charge</td></tr><tr><td>Écarteurs émoussés</td><td>FST</td><td>18200-09</td><td></td></tr><tr><td>Tropnin cardiaque I</td><td>Abcam</td><td>47003</td><td></td></tr><tr><td>Cytidine triphosphate</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>Inclus dans le kit Megascript</td></tr><tr><td>Système d’anesthésie double</td><td>Appareil Harvard</td><td>75-2001</td><td></td></tr><tr><td>Pince - Adson</td><td>FST</td><td>91106-12</td><td></td></tr><tr><td>Pince - Dumont #7</td><td>FST</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Guanosine triphosphate</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>Inclus dans le kit Megascript</td></tr><tr><td>Kit de transcription in vitro</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>5X MEGAscript T7 Kit</td></tr><tr><td>Canule d’intubation</td><td>Harvard Appareil</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Megaclear Kit</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ventilateur pour souris</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-4279</td><td></td></tr><tr><td>N1-méthylpseudouridine-5-triphosphate</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>N-1081</td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olsen Hegar porte-aiguille avec ciseaux de suture</td><td>FST</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>Modèles de plasmides</td><td>GeneArt, Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection à pointes acérées</td><td>FST</td><td>14200-12</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutures</td><td>Ethicon</td><td>Y433H</td><td>5.00</td></tr><tr><td>Sutures</td><td>Ethicon</td><td>Y432H</td><td>6.00</td></tr><tr><td>Sutures</td><td>Ethicon</td><td>7733G</td><td>7.00</td></tr><tr><td>T7 DNase enzyme</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>Inclus dans le kit Megascript</td></tr><tr><td>Station de bande</td><td>Aligent</td><td>4200</td><td></td></tr><tr><td>Kit de nettoyage de transcription</td><td>Invitrogen</td><td>AM1908</td><td>Megaclear</td></tr><tr><td>Ultra-4 filtres centrifuges 10k</td><td>Amicon</td><td>UFC801096</td><td></td></tr></tbody></table>

livraison de l’arnm modifié dans un modèle de souris infarctus du myocarde

Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

L’infarctus du myocarde (MI) est l’une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde occidental. Au cours de la dernière décennie, la thérapie génique est devenue une option de traitement prometteuse pour les maladies cardiaques, en raison de son efficacité et des effets thérapeutiques exceptionnels. Dans un effort pour réparer les tissus endommagés post-MI, diverses études ont employé la thérapie génique basée sur l’ADN ou virale, mais ont fait face à des obstacles considérables en raison de l’expression pauvre et incontrôlée des gènes livrés, œdème, arythmie, et l’hypertrophie cardiaque. L’ARNm synthétique modifié (modRNA) présente une nouvelle approche de thérapie génique qui offre une livraison élevée, transitoire, sûre, non immunisée et contrôlée d’ARNm au tissu cardiaque sans aucun risque d’intégration génomique. En raison de ces caractéristiques remarquables combinées avec sa pharmacocinétique en forme de cloche dans le cœur, modRNA est devenu une approche attrayante pour le traitement des maladies cardiaques. Toutefois, pour accroître son efficacité in vivo, une méthode de livraison cohérente et fiable doit être suivie. Par conséquent, pour maximiser l’efficacité de livraison modRNA et la cohérence de rendement dans l’utilisation modRNA pour les applications in vivo, une méthode optimisée de préparation et de livraison de l’injection intracardiaque modRNA dans un modèle mi souris est présenté. Ce protocole rendra la livraison de modRNA plus accessible pour la recherche fondamentale et translationnelle.

Huit à dix semaines-vieux souris ont été anesthésiés avec l’isoflurane et intubé. Après que l’animal ait été sous anesthésie, la région thoracique gauche a été rasée et stérilisée avec l’éthanol, et le coeur a été exposé pour la ligature de LAD. L’artère coronaire gauche a été occluse en nouant fermement la suture sous l’artère (représentation du diagramme figure 1A). Après un infarctus réussi (indiqué par la paling de la paroi libre ventriculaire gauche), une injection directe de 100 μg de ...

Ce protocole présente une façon simple et cohérente de mettre en place transitoirement un gène d’intérêt à l’aide de modRNA après l’infarctus du myocarde chez la souris.

Livraison de l’ARNm modifié dans un modèle de souris infarctus du myocarde

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...

L’ARN modifié est une nouvelle méthode de transfert de gènes vers le cœur et d’autres organes. Ce protocole fournira une approche précise de la livraison des gènes désirés transitoirement au cœur, après l’infarctus du myocarde. Cette méthode ne se limite pas à l’infarctus du myocarde, mais peut également être appliquée à la reperfusion ischémique et aux modèles transversaux de constriction aortique.L’ARN modifié est utilisé dans plusieurs essais cliniques sur l’homme. Cependant, il n’existe pas de protocole normalisé pour le gène transféré dans le cœur en utilisant cette méthode. La démonstration visuelle permettra aux chercheurs d’injecter correctement de l’ARN modifié à des endroits appropriés dans le cœur.Ajit Magadum, boursier postdoctoral, et Elena Chepurko, superviseure des animaux de notre laboratoire, démontreront la procedule. Basé sur la concentration de l’précédemment préparé à modRNA, calculer le volume de modRNA nécessaire pour une injection de 100 microgrammes. Fait des volumes égaux de solutions de saccharose et de citrate.Ajoutez ensuite le volume calculé de modRNA, et suffisamment de solution saline pour porter le volume d’injection à 60 microlitres. Après anesthés

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Génétique

De nombreuses manipulations génétiques et / ou injections intra-myocardique de gènes, de protéines, de cellules et / ou biomatériaux sont superposées la dimension du temps dans des études de l'ischémie aiguë / reperfusion et le remodelage chronique chez la souris. Cette vidéo illustre les procédures de microchirurgie de l'ischémie / reperfusion, la ligature des artères coronaires permanente, et les études d'injection intramyocardique.

Ligature de l&#39;artère coronaire et injection intramyocardique dans un modèle murin d&#39;infarctus

La procédure chirurgicale utilisée pour induire un infarctus du myocarde expérimental chez la souris commence par thoracotomie gauche, entre le troisième et le quatrièmes nervures afin de visualiser la surface antérieure du cœur et le poumon gauche. L'artère coronaire gauche est ligaturée, la poitrine est fermée et la souris est autorisé à se rétablir spontanément.

Technique de modification de ligature de l&#39;artère coronaire chez la souris

Nous introduisons une méthode chirurgicale pour induire expérimental d'ischémie / reperfusion (I / R) des blessures pour simuler un infarctus du myocarde (IM) dans les modèles de souris qui permet une plus grande clarté dans le positionnement de la ligature sur l'artère interventriculaire antérieure gauche (LAD) d'augmenter la reproductibilité d'expériences MI chez la souris.

Un modèle murin d&#39;ischémie myocardique-reperfusion par ligature de l&#39;artère interventriculaire antérieure

Injection intra-myocardique percutanée guidée par échocardiographie représente une modalité efficace, fiable, précis et efficaces pour la livraison de gènes agents de transfert ou de cellules dans le cœur murin. En suivant les étapes décrites dans le présent protocole, l'opérateur peut rapidement devenir compétent dans cette technique polyvalent, minimalement invasive.

Guidée par échographie transthoracique intramyocardique injection chez la souris

Un modèle hautement reproductible pour l’infarctus du myocarde chez la souris avec des manipulations minimes invasives est décrit. Le modèle peut être facilement réalisé, ce qui permet d’obtenir une reproductibilité et un taux de survie élevés. Ainsi, le modèle décrit réduira le nombre d’animaux requis comme l’exige le principe des 3R (Remplacement, Raffinement et Réduction).

Minimal intervention chirurgicale invasive d&#39;induire un infarctus du myocarde chez des souris

Ici nous décrivons une procédure chirurgicale montrant comment réaliser la ligature permanente de l'artère coronaire descendante gauche-antérieure chez les souris. Ce modèle est d'une grande pertinence pour étudier la pathophysiologie de l'infarctus du myocarde et les processus biologiques concomitants.

Modèle d'infarctus myocarde de Murine utilisant la ligation permanente de l'artère coronaire descendante antérieure gauche

Cet article démontre un modèle pour étudier le remodelage cardiaque après cryoinjury myocardique chez les souris.

Un modèle cryo-blessure pour étudier l'infarctus du myocarde chez la souris

Sous anesthésie adéquate, le cœur de la souris a été extériorisé par l’espace intercostal, et l’infarctus du myocarde a été induit avec succès en ligaturant l’artère descendante antérieure gauche (LAD) à l’aide de matériaux facilement disponibles dans la plupart des laboratoires.

Méthode simple modifiée pour l’induction d’un infarctus du myocarde chez la souris

Nous décrivons ici une méthode simple et reproductible qui peut induire un infarctus du myocarde ou une lésion d’ischémie-reperfusion myocardique chez la souris par ligature de précision de l’artère coronaire descendante antérieure gauche par micromanipulation.

Induction d’un infarctus du myocarde et d’une lésion d’ischémie-reperfusion myocardique chez la souris

Présenté ici est une procédure chirurgicale pour la ligature permanente de l’artère coronaire gauche chez la souris. Ce modèle peut être utilisé pour étudier la physiopathologie et la réponse inflammatoire associée après un infarctus du myocarde.

Ligature de l’artère coronaire gauche: un modèle murin chirurgical d’infarctus du myocarde

Découvrez la livraison d'ARNm modifié dans le cœur après infarctus du myocarde chez la souris. Cette méthode standardisée permet une surexpression transitoire de gènes d'intérêt pour la recherche cardiaque et les essais cliniques.

Livraison de l’ARNm modifié dans un modèle de souris infarctus du myocarde

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