Synthèse des nanoparticules magnétiques fonctionnalisées, leur conjugaison avec la feroxamine de Siderophore et son évaluation pour la détection des bactéries

Les nanoparticules magnétiques sont des outils idéaux pour la science analytique et la nanométique en raison de leurs fortes propriétés magnétiques et de la fonctionnalisation facile de leur surface. Nous rapportons ici la première instance d’un conjugué entre les particules magnétiques fonctionnalisées d’amino de silice et la feroxamine de siderophore avec l’évaluation pour la capture du matériel photogénique. Lesrophores sont de petites molécules organiques qui jouent un rôle clé dans le mécanisme de participation du fer, et elles sont reconnues par des récepteurs membranaires externes spécifiques des bactéries.

Cette vidéo affiche, étape par étape, un protocole efficace pour préparer les nanoparticules magnétiques de fer. Ensuite, ils ont été recouverts de silice pour protéger la dispersion et protéger le noyau magnétique. La surface du réacteur résultante a été fonctionnalisée avec des groupes d’amine.

Synthèse de nanoparticules magnétiques conjuguées à la feroxamine. Ajouter 0,5 gramme de Fe(acac)3 dans un flacon de verre de 20 mL. Ensuite, mélanger avec un 10 mL d’alcool benzyle.

Sonicate ce mélange pendant 2 minutes. Ensuite, transférer dans un bloc chauffant et chauffer à 180 degrés Centigrades pendant 72 heures. Rincer les nanoparticules avec 96% d’éthanol.

Et centrifugeuse pendant 30 minutes. Séparez les nanoparticules du supernatant par attraction magnétique, à l’aide d’un aimant au néodymium. Jeter le solvant résiduel.

Jeter le surnatant, en alternant avec la sonication, jusqu’à ce que le solvant semble clair. Préparer une suspension de 2 grammes de MNP en 80 millilitres d’isopropanol, ajouter 4 millilitres de 21% d’ammoniac, 7,5 millilitres d’eau distillée, et 0,56 millilitres de TEOS. Chauffer le mélange à 40 degrés Centigrades pendant 2 heures, en remuant continuellement.

Puis, sonicate pendant 1 heure. Séparez le MNP avec un aimant, jetez le supernatant, dispersez-le en 30 millilitres d’isopropanol, ajoutez de l’ammoniac, de l’eau distillée et du TEOS, dans le même ordre que décrit précédemment. Chauffer le mélange à 40 degrés Centigrades pendant deux heures en remuant continuellement.

Puis, sonicate pendant une heure. Retirez et lavez commodément la barre magnétique de remuer, pour récupérer tout le matériel. Jeter le supernatant et rincer les nanoparticules avec 96% d’éthanol trois fois, en alternance avec la sonication.

Sécher les nanoparticules sous vide à température ambiante pendant 12 heures. Rincer 500 milligrammes de la MNP@SIO2 de l’étape précédente avec du diméthylformamide. Sonicate eux et jeter.

Suspendre à nouveau les particules dans un flacon à fond rond, remuer à l’aide d’une barre magnétique et ajouter 9 millilitres d’APTES. Remuer le mélange à 60 degrés Centigrades pendant 12 heures. Jeter le supernatant et rincer les nanoparticules avec 96% d’éthanol trois fois, en alternance avec la sonication.

Dissoudre 100 mg de déféoxamine, de sel de mesylate et 53,0 milligrammes d’acétytonate de fer dans 5 millilitres d’eau distillée. Remuer le mélange toute la nuit à température ambiante. Lavez le produit résultant trois fois avec 20 millilitres d’acétate d’éthyle dans un entonnoir de séparation.

Retirer le solvant organique sous vide. Congeler-sécher la phase aqueuse pour se permettre la feroxamine et un solide rouge. Ajouter 350 milligrammes d’anhydride succinique à une solution de 100 mg de feroxamine en 5 millilitres de pyridine dans un flacon rond de 50 millilitres.

Remuer le mélange qui en résulte, à température ambiante, pendant 16 heures. Retirer l’excès de pyridine sous pression réduite. Dissoudre la réaction brute en 3 millilitres de méthanol.

Transférer la solution méthanol dans une colonne LH-20 et elute à 0,5 mL/minute. Recueillir la fraction rouge et retirer le méthanol sous vide. Rincer 30 mg de nanoparticules fonctionnalisées à l’amine sèche deux fois avec du DMF et sonifier les nanoparticules dans un flacon Erlenmeyer de 100 millilitres pendant 30 minutes.

Préparer une solution de 200 milligrammes de N-succinylferoxamine, 173 milligrammes Benzotriazole 1-yl-oxy-tris-phosphonium hexafluorophosphate BOP, 46 mg 1-hydroxybenzotriazole HOBt et 128,8 milligrammes N, N-diisopropylethylamine DIPEA, en 10 mL de DMF, dans un flacon rond-fond de 50 millilitres. Suspendre les MNP@SiO2@NH2 préalablement rincées dans un 3 millilitres de DMF, sous sonication dans des conditions sèches et sans oxygène. Utilisez l’atmosphère argon.

Ajouter, dropwise, mélanger A pour mélanger B.Shake le mélange final, à l’aide d’un shaker orbital, à température ambiante pendant la nuit. Séparez le conjugué résultant de la suspension à l’aide d’un aimant. Analyse bactérienne avec des souches de Y.enterocolitica pour quantifier l’isolement et la capture des bactéries pathogènes avec des nanoparticules.

Préparer une suspension de toutes les nanoparticules intermédiaires et le conjugué final dans PBS à 1 mg/mL dans les tubes stériles. Préparez une culture de Y.entorocolitica dans 5 mL de Luria Bertani, LB, bouillon pendant la nuit. Préparez un bouillon de sy trypcase déficient en fer de 5 mL, BST, par l’ajout de 50 microlitres de solution trypcase 2, 2-bipyridyl.

Inoculer les 5 millilitres de bouillon TSB déficient en fer avec 50 microlitres de la culture nocturne de Y.enterocolitica. Incuber à 37 degrés Centigrades avec agitation jusqu’à ce qu’un OD600 de 0,5 à 0,8 soit atteint. Prenez un 100 microlitres de la culture de nuit et diluez-le dans un tube contenant 900 microlitres de PBS pour obtenir la première dilution 1/10.

Ensuite, préparez une dilution 1/100 de la première dilution en utilisant la même procédure pour obtenir une concentration de cellules bactériennes à 10 à la puissance de 6 unités de formation de colonie par millilitre approximativement. Ajouter 100 microlitres de suspension de nanoparticules et 1 mg/mL à 1 millilitre de la dilution de 1/100 bactéries. Séparez les agrégats de bactéries MNP, en utilisant un aimant, jetez, soigneusement, le surnatant.

Rincer les nanoparticules séparées deux fois à l’aide d’un PBS de 1 millimètre à l’aide d’un vortex. Préparez quatre dilutions successives de 1/10 de l’ancienne suspension, jusqu’à un 10 à la puissance de moins 4 dilution. Plaque 10 microlitres de chaque dilution sur les plaques d’agar TS.

Photographiez la plaque avec un mériseur de gel en mode epi blanc. Traiter l’image, à l’aide du logiciel pratique, pour amplifier un endroit pour compter le nombre de colonies individuelles. Pour confirmer la formation du lien covalent entre les nanoparticules et le siderophore, nous employons la spectroscopie FT-IR Raman pour surveiller la synthèse, en observant comment de nouvelles bandes apparaissent en accord avec un nouveau groupe fonctionnel à chaque étape.

La microscopie TEM et SEM a été utilisée pour observer la morphologie et la taille des particules. Analyse thermogravimétrique pour mesurer la perte de poids due à l’ajout de matières organiques. Et XPS nous permet d’analyser les différents états d’oxydation des atomes à la surface et de confirmer la formation de liaisons covalentes.

Enfin, nous avons utilisé tous les intermédiaires sur le conjugué final pour tester sa capacité à capturer les bactéries, afin d’établir leurs propriétés en tant que biocapteur. Ce protocole a été conçu pour tirer parti de la biocompatibilité élevée des nanoparticules de magnétite. Le revêtement avec de la silice améliore la dispersion et protège le noyau magnétique contre la dégradation dans les médias aqueux.

Et aussi donner une surface réactive à fonctionnaliser avec des groupes d’amine qui sont nécessaires pour lier covalently un siderophore modifié acide par la chimie du carbodiimide. Dans ce cas, N-succynilferoxamine. La capacité conjuguée de capture des bactéries a été testée et, par conséquent, un faible nombre de colonies a été trouvée, sans différence significative avec les intermédiaires en raison d’une interaction spécifique sur les effets encombrants présentés dans la suspension bactérienne PBS.