Name: Création in situ de la perfusion en circuit fermé des organes abdominaux inférieurs et des membres postérieurs chez les souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Apprenez la perfusion in situ des organes abdominaux inférieurs chez la souris pour étudier la distribution de médicaments et les interactions immunitaires. Cette technique évite les organes d'élimination principaux et permet une analyse précise des tissus ciblés.

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L’étude a été appuyée par la subvention ca194058 des NIH à DS, Skaggs School of Pharmacy ADR ased grant program (DS); National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31771093), le Project of International Collaboration of Jilin Province (No.201180414085GH), the Funds Funds for the Central Universities, the Program for JLU Science and Technology Innovative Research Team (2017TD-27, 2019TD-36).

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université du Colorado.
1. Préchauffer le système de perfusion
<ol><li>Préparer le système de perfusion avant la chirurgie en commençant un bain d’eau circulant à 37 °C pour tous les composants à veste d’eau (réservoir perfusé, chambre humide et couvercle) comme le montre une configuration personnalisée de la figure 1A. Assurez-vous que le tube est propre et remplacez-le si nécessaire. Pour limiter le volume perfusé, utilisez un piège à bulles dans une chambre humide comme réservoir perfusé (figure 1B-6).</li>
</ol>2. Cathétérisme vasculaire
<ol><li>Induire l’anesthésie dans une souris BALB/c de 8-10 semaines utilisant une machine d’anesthésie vétérinaire isoflurane avec 3-5% d’isoflurane et de débit d’oxygène à 0.3 L/min. Comme alternative, utilisez la kétamine/xylazine ou tout autre type d’anesthésie intrapéritonéale. Évaluer la profondeur de l’anesthésie par 2 méthodes : pincement d’orteil et réflexe cornéen.</li>
	<li>Préwet une suture de soie 4-0 avec aiguille dans de l’eau distillée double.</li>
	<li>Placez la souris anesthésiée en position supinée sur une planche en polystyrène avec la tête face au chirurgien et immobilisez les membres antérieurs et les membres postérieurs avec du ruban adhésif. Essuyez l’abdomen avec de l’alcool isopropyle et coupez l’abdomen le long de la ligne médiane en forme de « T » avec des ciseaux. Arrêter de saigner autour du bord de l’incision par électrocoagulation (cautérisation).</li>
	<li>Poussez l’estomac, le jejunum et le côlon sur le côté droit de l’abdomen pour révéler l’aorte abdominale, le vena cava, et les artères et veines iliaques et ilioumbar communes.</li>
	<li>Sous un microscope de dissection, trouver et lier l’artère/veine ilioumbar dans le mâle, et l’artère/veine ovarienne et l’artère/veine ilioumbar dans la femelle utilisant des sutures de soie 4-0(figure 2 lignes jaunes).</li>
	<li>Sous un microscope à dissection, bouclez deux sutures de soie 4-0 sous l’aorte abdominale et vena cava inférieure (environ 1 cm au-dessus de l’artère et de la veine iliaques, 1 mm de distance, figure 2),et faites un nœud lâche dans la suture la plus proche des vaisseaux iliaques(figure 2, ligne pointillée blanche). Alternativement, une suture de soie 6-0 peut être utilisée pour ce noeud.</li>
	<li>Sous un microscope de dissection, aligner horizontalement et étirer à la fois la vena cava inférieure et l’aorte abdominale avec porte-aiguille. Utilisez un cathéter I.V. ailé ailé de 24 G pour perforer l’aorte abdominale, appuyez sur le bouton pour rétracter le noyau de l’aiguille et insérez le cathéter d’environ 5 mm dans le vaisseau.<ol>
<li>Répétez la même procédure avec la vena cava inférieure et attachez des noeuds des deux sutures autour des vaisseaux cathétérisés. REMARQUE : L’aiguille peut facilement percer le vaisseau sanguin; par conséquent, garder les navires tendus et l’aiguille parallèle avec le navire. Rétractez le noyau de l’aiguille dès que l’aiguille pénètre environ 1 mm dans le navire. L’aorte abdominale est sous le vena cava inférieur et beaucoup plus mince et plus élastique en raison d’être enfermé dans le tissu conjonctif. Par conséquent, l’aorte peut « tenez » au cathéter, et devraient donc être cathéterisés avant le cava vena pour réduire la probabilité que le cathéter glisse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Appliquer de la colle instantanée pour immobiliser les cathéters sur les spinaes de l’érecteur, remplacer les organes abdominaux et mettre fin à la chirurgie tout en maintenant l’anesthésie. REMARQUE : Les organes qui ne peuvent pas être complètement remplacés dans la cavité abdominale devront être périodiquement humidifiés avec le milieu de perfusion pendant le processus de perfusion.</li>
</ol>3. Mettre en place le système de perfusion
<ol><li>Transférer la souris dans la chambre humide à veste d’eau préassée à 37 °C sur un tampon de silicium et immobiliser les ailes du cathéter sur le tampon avec des aiguilles de 19 G.</li>
	<li>Remplissez l’extrémité du cathéter artériel (entrée) d’un tampon de perfusion préaurée (solution de lactate de Ringer complétée à 5 % de BSA), puis connectez l’extrémité du cathéter avec le tube de perfusion d’entrée à l’aide d’un connecteur à vis(figure 1B, flèche rouge). REMARQUE : Maintenez le connecteur avec des forceps hémostatiques et immobilisez le tube avec du ruban adhésif pour éviter de déplacer les cathéters.</li>
	<li>Ajuster le débit péristaltique à 0,6 mL/min et maintenir la sortie de perfusion(figure 1B, flèche bleue) ouverte pendant 5 à 10 min pour laver le sang par le cathéter veineux. Il y aura quelques caillots dans le cathéter de sortie; éliminer les caillots à l’une de la mémoire tampon avant de fermer le circuit de perfusion.</li>
	<li>Connectez l’extrémité du cathéter veineux avec le tube de sortie à l’aide d’un connecteur à vis pour fermer le circuit (figure 1B). À ce stade, effectuer l’euthanasie au gaz CO2 et vérifier par perforation thoracique ou toute autre méthode.</li>
	<li>Couvrir la chambre humide avec le couvercle réchauffé. Vérifiez le niveau de perfusate périodiquement et ajoutez-en davantage si nécessaire. La perfusion peut être effectuée jusqu’à 2 heures. REMARQUE : 5 mL de perfusate seront nécessaires pour mettre en place le système de perfusion fermée. S’il n’y a pas de fuite ou d’œdème, le volume de perfusate diminuera de moins de 1 mL et une mémoire tampon supplémentaire ne sera pas nécessaire. Pour éviter l’œdème induit par le thrombus circulant périphérique, le tampon de perfusion contenant 0,002% d’héparine peut être utilisé dans les 10 premières minutes de perfusion, mais doit être changé en tampon sans héparine pour éviter la fuite au bord des incisions.</li>
	<li>Si nécessaire, ajoutez un réactif de choix dans le réservoir de perfusion ou au port d’injection à tout moment (figure 1B-5). Par exemple, 10 μL de 10 mg/mL Hoechst33342 peuvent être ajoutés dans le perfusate pour tacher les noyaux cellulaires 2 h avant la fin de la perfusion, ou 50 μL de 1 mg/mL DyLight 649-lectine pour tacher les cellules endothéliales vasculaires 30 min avant la fin de la perfusion. REMARQUE : Si vous essayez de tacher la moelle osseuse avec la solution Hoechst, les souris devront être pré-injectées 30 minutes avant la chirurgie.</li>
	<li>Après perfusion avec des réactifs fluorescents, laver avec tampon de perfusion pendant encore 10 minutes pour minimiser la fluorescence de fond.</li>
</ol>4. Analyse des organes perfusés
<ol><li>Prélever des organes, y compris les testicules, la prostate, la vessie, le fémur, les muscles et la peau (p. ex., les pieds). Exciser un morceau d’organe d’environ 1 mm3 et aplatir entre deux lames de verre.<ol>
<li>Étude réalisée au microscope confocal fluorescent inversé à l’aide de filtres d’excitation et d’émission DAPI/Cy5 (lasers d’excitation : DAPI, 405 nm; Cy5,640 nm). Utilisez au moins 200x objectif de grossissement avec une ouverture numérique de 0,45.</li>
		<li>Alternativement, fixer les organes avec 4% solution de formaldéhyde pour 24 h et effectuer l’hématoxyline-éosine coloration19.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour créer une fenêtre osseuse pour l’observation intacte de la moelle osseuse, immobiliser les deux extrémités du fémur ou du tibia et gratter l’os cortical avec le bord latéral d’une aiguille de 19 G pour exposer le périoste; prendre soin de garder une fine couche d’os résiduel. Placez l’os sur un glissement de couverture avec la fenêtre faisant face au verre et à l’image avec le microscope confocal fluorescent inversé utilisant les canaux DAPI et Cy5 comme décrit ci-dessus. Les cellules et le réseau vasculaire dans la cavité de moelle osseuse peuvent être facilement observés.</li>
</ol>

<ol><li>Ghaidan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+year+follow-up+of+lung+transplantations+using+initially+rejected+donor+lungs+after+reconditioning+using+ex+vivo+lung+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiothoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Ten year follow-up of lung transplantations using initially rejected donor lungs after reconditioning using ex vivo lung perfusion.</a> Journal of Cardiothoracic Surgery. 14 (1), 125(2019).</li>
<li>Kabagambe, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Ex+vivo+Hypothermic+and+Normothermic+Perfusion+for+Assessment+of+High-risk+Deceased+Donor+Human+Kidneys+for+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Combined Ex vivo Hypothermic and Normothermic Perfusion for Assessment of High-risk Deceased Donor Human Kidneys for Transplantation.</a> Transplantation. 103 (2), 392-400 (2019).</li>
<li>Knaak, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+of+subnormothermic+ex+vivo+liver+perfusion+for+the+storage%2C+assessment%2C+and+repair+of+marginal+liver+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Technique of subnormothermic ex vivo liver perfusion for the storage, assessment, and repair of marginal liver grafts.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51419(2014).</li>
<li>Hems, R., Ross, B. D., Berry, M. N., Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gluconeogenesis+in+the+perfused+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Gluconeogenesis in the perfused rat liver.</a> Biochemical Journal. 101 (2), 284-292 (1966).</li>
<li>Nielsen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasopressin+increases+water+permeability+of+kidney+collecting+duct+by+inducing+translocation+of+aquaporin-CD+water+channels+to+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vasopressin increases water permeability of kidney collecting duct by inducing translocation of aquaporin-CD water channels to plasma membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (4), 1013-1017 (1995).</li>
<li>Sutherland, F. J., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+blood+and+perfusion+fluid+perfused+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">The isolated blood and perfusion fluid perfused heart.</a> Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).</li>
<li>Schreiter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+perfusion+system+emulating+in+vivo+conditions+in+noncirrhotic+and+cirrhotic+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">An ex vivo perfusion system emulating in vivo conditions in noncirrhotic and cirrhotic human liver.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 342 (3), 730-741 (2012).</li>
<li>Sevick, E. M., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscous+resistance+to+blood+flow+in+solid+tumors%3A+effect+of+hematocrit+on+intratumor+blood+viscosity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Viscous resistance to blood flow in solid tumors: effect of hematocrit on intratumor blood viscosity.</a> Cancer Research. 49 (13), 3513-3519 (1989).</li>
<li>Duyverman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isolated+tumor+perfusion+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">An isolated tumor perfusion model in mice.</a> Nature Protocols. 7 (4), 749-755 (2012).</li>
<li>Sears, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+perfusion+of+a+tumor-containing+colon+with+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Ex vivo perfusion of a tumor-containing colon with monoclonal antibody.</a> J Surg Res. 31 (2), 145-150 (1981).</li>
<li>Duda, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+cells+facilitate+lung+metastasis+by+bringing+their+own+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21677-21682 (2010).</li>
<li>Kristjansen, P. E., Boucher, Y., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dexamethasone+reduces+the+interstitial+fluid+pressure+in+a+human+colon+adenocarcinoma+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Dexamethasone reduces the interstitial fluid pressure in a human colon adenocarcinoma xenograft.</a> Cancer Research. 53 (20), 4764-4766 (1993).</li>
<li>Sevick, E. M., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+resistance+to+blood+flow+in+solid+tumors+perfused+ex+vivo%3A+effects+of+tumor+size+and+perfusion+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Geometric resistance to blood flow in solid tumors perfused ex vivo: effects of tumor size and perfusion pressure.</a> Cancer Research. 49 (13), 3506-3512 (1989).</li>
<li>Zhang, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+Maintenance+of+Primary+Human+Multiple+Myeloma+Cells+through+the+Optimization+of+the+Osteoblastic+Niche%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ex vivo Maintenance of Primary Human Multiple Myeloma Cells through the Optimization of the Osteoblastic Niche.</a> PLoS One. 10 (5), (2015).</li>
<li>Di Buduo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+flow+chamber+for+engineering+bone+marrow+architecture+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modular flow chamber for engineering bone marrow architecture and function.</a> Biomaterials. 146, 60-71 (2017).</li>
<li>Lokerse, W. J. M., Eggermont, A. M. M., Grull, H., Koning, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+an+isolated+limb+infusion+model+for+investigation+of+drug+delivery+kinetics+to+solid+tumors+by+thermosensitive+liposomes+and+hyperthermia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of an isolated limb infusion model for investigation of drug delivery kinetics to solid tumors by thermosensitive liposomes and hyperthermia.</a> Journal of Controlled Release. 270, 282-289 (2018).</li>
<li>Tietjen, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+targeting+to+the+endothelium+during+normothermic+machine+perfusion+of+human+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle targeting to the endothelium during normothermic machine perfusion of human kidneys.</a> Science Translational Medicine. 9 (418), (2017).</li>
<li>Ternullo, S., de Weerd, L., Flaten, G. E., Holsaeter, A. M., Skalko-Basnet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+perfused+human+skin+flap+model%3A+A+missing+link+in+skin+penetration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The isolated perfused human skin flap model: A missing link in skin penetration studies.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 96, 334-341 (2017).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, 4986(2008).</li>
<li>Hekman, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Dual-Modality+Imaging+in+Renal+Cell+Carcinoma%3A+An+Ex+vivo+Kidney+Perfusion+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Targeted Dual-Modality Imaging in Renal Cell Carcinoma: An Ex vivo Kidney Perfusion Study.</a> Clinical Cancer Research. 22 (18), 4634-4642 (2016).</li>
<li>Graham, R. A., Brown, T. R., Meyer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+model+for+the+study+of+tumor+metabolism+by+nuclear+magnetic+resonance%3A+characterization+of+the+phosphorus-31+spectrum+of+the+isolated+perfused+Morris+hepatoma+7777%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">An ex vivo model for the study of tumor metabolism by nuclear magnetic resonance: characterization of the phosphorus-31 spectrum of the isolated perfused Morris hepatoma 7777.</a> Cancer Research. 51 (3), 841-849 (1991).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le circuit décrit peut être utilisé pour sonder diverses questions de recherche, par exemple le rôle de différents composants sériques et barrières tissulaires dans l’administration de médicaments, ou le trafic de cellules immunitaires et souches. Différents systèmes d’administration de médicaments (p. ex., liposomes et nanoparticules) peuvent être ajoutés au perfusate afin de comprendre le rôle des facteurs physiologiques et biochimiques dans l’administration. La durée de la perfusion peut varier, selon les tissus étudi...

La perfusion d’organe isolé a été développée à l’origine pour étudier la physiologie d’organe pour la transplantation1,2,3, et a permis la compréhension des fonctions des organes sans interférence d’autres systèmes de corps. Par exemple, la perfusion rénale et cardiaque isolée était extrêmement utile pour comprendre les principes de base de l’hémodynamique et les effets des agents vasoactifs, tandis que la perfusion hépatique était importante pour comprendre la fonction métabolique, y compris le métabolisme des médicaments dans les tissus sains et malades4,5,6,7. En outre, les études de perfusion étaient critiques dans la compréhension de la viabilité et de la fonction des organes destinés à la transplantation. Dans cancer Researchearch, perfusion tumorale isolée a été décrite par plusieurs groupes utilisant la souris, le rat, et les tissus humains fraîchement réséqués8,9. Dans une perfusion de tumeur isolée, la tumeur a été implantée dans le tampon de graisse d’ovaire pour forcer la croissance de la tumeur fournissant des vaisseaux sanguins de l’artère mésentery10. Le groupe Jain a effectué des études pionnières utilisant la perfusion isolée des adénocarcinomes du côlon pour comprendre l’hémodynamique tumorale et la métastase8,11,12,13. D’autres configurations ex vivo innovantes comprennent un dispositif de perfusion à base de plaques de 96 puits pour la culture des cellules primaires du myélome multiple humain14 et une chambre modulaire de flux pour l’architecture de la moelle osseuse d’ingénierie et la recherche de fonction15.
En plus des études de physiologie et de pathologie, la perfusion d’organes a été utilisée pour étudier les principes de base de l’administration de médicaments. Ainsi, un groupe a décrit la perfusion isolée de membre de rat et a étudié l’accumulation des liposomes dans les sarcomes implantés16, tandis qu’un autre groupe a exécuté la perfusion de rein humain disséquée pour étudier le ciblage endothélial des nanoparticules17. Ternello et coll. ont utilisé un rabat de peau humain perfusé isolé comme modèle de pénétration de drogue de peau proche-à-in vivo18.
Malgré ces progrès dans la perfusion de grands organes et tissus, il n’y a eu aucun rapport sur les modèles in situ de perfusion chez les souris qui : a) contournent les organes de dégagement tels que le foie, la rate et les reins ; b) comprennent les organes pelviens, la peau, les muscles, les organes reproducteurs (chez les hommes), la vessie, la prostate et la moelle osseuse. En raison de la petite taille de ces organes et de la vascularisation de fourniture, la cannulation ex vivo et l’établissement d’un circuit de perfusion n’a pas été possible. La souris est le modèle animal le plus important dans la recherche sur le cancer et l’immunologie, et la livraison de médicaments. La capacité de perfuse de petits organes de souris permettrait de répondre à des questions intéressantes concernant l’administration de médicaments à ces organes, y compris aux tumeurs implantées dans le bassin (vessie, prostate, ovaire, moelle osseuse), ainsi qu’à des études de physiologie et d’immunologie de base des maladies de ces organes. Pour remédier à cette carence, nous avons développé un circuit de perfusion in situ chez les souris qui peuvent potentiellement éviter les lésions tissulaires et qui est beaucoup mieux adapté à la recherche fonctionnelle que la perfusion d’organes isolé.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5x-90x microscope à zoom stéréo sur support avec lumière LED</td><td>Amscope</td><td>SKU : SM-3BZ-80S</td><td></td></tr><tr><td>Dioxyde de carbone, USP</td><td>Airgas healthcare</td><td>19087-5283</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>NIKON</td><td>ECLIPSE Ti2</td><td></td></tr><tr><td>Stylo de caultérisation stérile jetable avec haute température</td><td>FIAB</td><td>F7244</td><td></td></tr><tr><td>Piège à bulles à chambre humide (partie 6 de la figure 1)</td><td>Appareil de Harvard</td><td>733692</td><td>Personnalisé en tant que récipient de perfisat ; également perfusion à pression constante</td></tr>, <tr><td>couvercle de la chambre humide avec fenêtre en quartz (partie 3 de la figure 1)</td><td>Appareil de Harvard</td><td>733524</td><td>maintenir la température de la chambre</td></tr><tr><td>Chambre humide avec échangeur de chaleur à tube métallique</td><td>Appareil de Harvard</td><td>732901</td><td>Chambre humide à chemise d’eau avec couvercle pour maintenir le perfusat et la température de la souris</td></tr><tr><td>Porte-aiguilles Olsen-Hegar avec coupe-suture</td><td>Outils de science fine (FST)</td><td>125014</td><td></td></tr><tr><td>Oxygène comprimé, USP</td><td>Airgas healthcare</td><td>C2649150AE06</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à rouleaux (partie 4 de la figure 1)</td><td>Appareil Harvard</td><td>730113</td><td>administrer le perfusat à la canule dans la chambre humide</td></tr><tr><td>Servocommande SCP plugsys F/Perfusion (partie 1 de la figure 1)</td><td>Appareil de Harvard</td><td>732806</td><td>contrôler la vitesse de purfusion</td></tr><tr><td>Tampon en silicone</td><td>Appareil</td><td></td><td></td>de Harvard</tr><tr><td>Ensemble de tubes en silicone (flèches sur la figure 1)</td><td>Appareil de Harvard (TYGON)</td><td>733456</td><td></td></tr><tr><td>Pince à motif standard pour les étudiants</td><td>Outils de sciences fines (FST)</td><td>91100-12</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td> <td>chirurgicauxOutils scientifiques fins (FST)</td><td>14001-14</td><td></td></tr><tr><td>Table pour chambre humide</td><td>Appareil Harvard</td><td>734198</td><td></td></tr><tr><td>Thermocirculateur (partie 2 de la figure 1)</td><td>Appareil de Harvard</td><td>724927</td><td>bain d’eau de circulation pour tous les composants à chemise d’eau Robinet d’arrêt</td></tr><tr><td>à trois voies (partie 5 de la figure 1)</td><td>Cole-Palmer</td><td>30600-02</td><td></td></tr><tr><td>Appareil d’anesthésie vétérinaire</td><td>Highland</td><td>HME109</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>19-G Aiguille BD PrecisionGlide</td><td>BD</td><td>305186</td><td>Pour immobiliser l’aiguille Insyte Autoguard Winged et gratter l’os cortical</td></tr><tr><td>4-0 sutures en soie</td><td>Keebomed-Hopemedical</td><td>427411</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Sutures en soie</td><td>Keebomed-Hopemedical</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Filter ( 0,2 et micro ; m)</td><td>ThermoFisher</td><td>42225-CA</td><td>Filtre pour 5 % BSA-RINGER' S</td></tr><tr><td>Marqueur permanent</td><td>Staedtler</td><td>342-9</td><td></td></tr><tr><td>Seringue (10 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-2E</td><td></td></tr><tr><td>Seringue (60 mL)</td><td>BD</td><td></td><td>309653 Filtre pour 5 % BSA-RINGER' S</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 % Evans blue ( w/v ) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,5)</td><td>Sigma</td><td>314-13-6</td><td></td></tr><tr><td>10 % de formol tamponné</td><td>velleyvet</td><td>36692</td><td></td></tr><tr><td>souris BALB/c ( 8-10 semaines)</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baxter Viaflex lactate Ringer’s solution</td><td>EMRN Medical Supplies Inc.</td><td>JB2324</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Thermo Fisher</td><td>11021-037</td><td></td></tr><tr><td>Colle cyanoacrylate</td><td>Krazy Glue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DyLight-649-lectin</td><td>Vector Laboratories,Inc.</td><td>ZB1214</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol (70 % (vol/vol))</td><td>Pharmco</td><td>111000190</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Enterprises Limited</td><td>66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr></tbody></table>

création in situ de la perfusion en circuit fermé des organes abdominaux inférieurs et des membres postérieurs chez les souris

Establishing In Situ Closed Circuit Perfusion of Lower Abdominal Organs and Hind Limbs in Mice

La perfusion ex vivo est un outil physiologique important pour étudier la fonction des organes isolés (p. ex. foie, reins). Dans le même temps, en raison de la petite taille des organes de souris, la perfusion ex vivo des organes d’os, de vessie, de peau, de prostate, et de reproduction est difficile ou non faisable. Ici, nous rapportons pour la première fois un circuit in situ de perfusion inférieure du corps chez les souris qui inclut les tissus ci-dessus, mais contourne les organes principaux de dégagement (rein, foie, et rate). Le circuit est établi en canniler l’aorte abdominale et le vena cava inférieur au-dessus de l’artère et de la veine iliaques et en cautérisant les vaisseaux sanguins périphériques. La perfusion est effectuée par l’intermédiaire d’une pompe péristaltique avec débit perfusate maintenu jusqu’à 2 h. La coloration in situ avec la lectine fluorescente et la solution de Hoechst a confirmé que la microvasculature a été perfusée avec succès. Ce modèle de souris peut être un outil très utile pour étudier les processus pathologiques ainsi que les mécanismes de l’administration de médicaments, la migration / métastases des cellules tumorales circulantes dans / de la tumeur, et les interactions du système immunitaire avec des organes et des tissus perfusés.

Nous avons mis en place un système de perfusion en circuit fermé par cannulation de l’aorte abdominale et le vena cava inférieur de 8-10 semaines souris tout en gardant le volume de tampon de perfusion inférieure à 10 mL. La figure 3A montre des images confocales après avoir perfusé les tissus avec la solution de Ringer contenant Hoechst 33342 et DyLight 649-lectine. Les muscles, la moelle osseuse, les testicules, la vessie, la prostate et la peau du pied montrent une coloration nucléaire et...

Un protocole est décrit pour la perfusion in situ du bas du corps de la souris, y compris la vessie, la prostate, les organes sexuels, les os, les muscles et la peau du pied.

Création in situ de la perfusion en circuit fermé des organes abdominaux inférieurs et des membres postérieurs chez les souris

Ex vivo perfusion is an important physiological tool to study the function of isolated organs (e.g. liver, kidneys). At the same time, due to the small ...

Ce protocole peut être utilisé pour répondre à des questions sur l’administration de médicaments et les interactions immunitaires au sein des organes inclus dans notre circuit. Cette technique permet la perfusion d’organes qui ne sont pas possibles de perfuser par les méthodes traditionnelles ex vivo, tout en évitant les organes de dégagement principaux. Avant de commencer l’opération, placez un bain d’eau en circulation et tous les composants en veste d’eau, à 37 degrés Celsius.Confirmez que le tube est nettoyé et utilisez un piège à bulles dans une chambre humide comme réservoir de perfusate pour limiter le volume de perfusate. Pour effectuer la procédure de cathétérisme, confirmer un manque de réponse au réflexe de la pédale, dans une ampoule anesthésiée mâle de huit à dix semaines voir la souris. Et placez la souris en position supine sur une planche en polystyrène, avec la tête à six heures.Immobiliser les membres des animaux avec du ruban adhésif et essuyer l’abdomen avec de l’alcool isopropylique. Faire une incision en forme de T dans l’abdomen, en utilisant la coagulation électro pour arrêter tout saignement autour du bord de l’incision. Poussez l’estomac, le jejunum et le côlon sur le côté droit de l’abdomen, pour révéler l’aorte abdominale, le cava de vena et les artères et veines iliaques et iliolumbar communes.Sous un microscope à dissection, localiser et ligate les artères ovariennes et iliolumbar et les veines avec des sutures de soie 4-O. Boucle deux sutures de soie 4-O sous l’aorte abdominale et vena cava inférieur d’environ un centimètre au-dessus de l’artère iliaque et de la veine, un millimètre de distance. Puis faire un œd lâche dans la suture la plus proche des vaisseaux iliaques.Utilisez un porte-aiguille pour aligner horizontalement et étirer à la fois le cava vena inférieur et l’aorte abdominale. Et, en gardant les vaisseaux tendus, utilisez un cathéter de bouclier ailé IV de calibre 24 pour percer l’aorte abdominale. Dès que l’aiguille pénètre environ un millimètre dans le récipient, a appuyer sur le bouton pour retirer le noyau de l’aiguille et insérer le cathéter environ cinq millimètres dans le récipient.Insérez un cathéter de cinq millimètres dans le cava vena inférieur, de la même manière. Et attacher les deux sutures autour des vaisseaux cathétérisés. Ensuite, appliquez de la colle instantanée pour immobiliser les cathéters sur l’erector spin a, et remplacer les organes abdominaux.Pour installer le système de perfusion, placez la souris sur un tampon de silicium dans la chambre humide en veste d’eau et immobilisez les ailes du cathéter jusqu’au coussin avec des aiguilles de calibre 19. Remplissez l’entrée du cathéter arté conditionné avec un tampon de perfusion préchauffé. Utilisez des forceps hémostatiques et un connecteur vissé pour fixer l’entrée du cathéter au tube et immobiliser le tube de perfusion d’entrée avec du ruban adhésif.Réglez le débit périssaltique à 0,6 millilitres par minute, et gardez l’écoulement de perfusion ouvert pendant cinq à dix minutes, pour laver le sang à travers le cathéter veineux. Certains caillots seront présents dans le cathéter de sortie, chasseront les caillots avec tampon de perfusate et utiliseront une vis sur le connecteur pour fixer à l’extrémité du cathéter veineux au tube de sortie pour fermer le circuit. Couvrez ensuite la chambre humide d’un couvercle préchauffé jusqu’à deux heures de perfusion, en vérifiant périodiquement le niveau de perfusate.Ici, des images confoccales après perfusion avec solution de sonnerie contenant Hoechst 33342 et DyLight-649 lectin, sont montrées. Le muscle, la moelle osseuse, les testicules, la vessie, la prostate et la peau des pieds démontrent généralement une coloration nucléaire et vasculaire efficace. L’hématoxyline et la coloration d’éosine de ces tissus après trois heures de perfusion thermic normale, indique une chasse d’eau réussie des organes, sans dommages apparents de tissu.Ce modèle peut être utilisé pour comprendre les voies d’absorption des médicaments, dans l’environnement physiologique non pertinent. Par exemple, comprendre le rôle des composants sériques dans l’accumulation de médicaments. Nous utilisons le système, pour comprendre le mécanisme de l’accumulation de liposome dans la peau.

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