Comité de LC-MS/MS validé pour quantifier 11 médicaments antituberculeux pharmacorésistants dans de petits échantillons de cheveux

L’observance du patient est très difficile et le métabolisme des médicaments peut varier d’une personne à l’autre, de sorte que la mesure objective des niveaux de médicaments peut s’avérer importante pour prévenir l’émergence d’une résistance pendant le traitement de la tuberculose. Si l’observance pouvait être quantifiée avec plus de précision et de facilité, les fournisseurs de soins de santé pourraient élaborer un plan de traitement qui limiterait le développement d’une résistance aux médicaments. Nous avons mis au point le premier panneau de spectrométrie de masse analyte multiple pour plusieurs médicaments antituberculeux dans de petits échantillons de cheveux en un seul essai.

Notre panneau multi-médicaments ne nécessite qu’un échantillon de deux milligrammes par patient et n’utilise ni phase solide extraction ou étape de filtrage pour prévenir toute perte de volume de l’échantillon. Des mesures objectives de l’exposition aux médicaments mesurées au début du traitement pourraient potentiellement alerter les cliniciens des problèmes avec les médicaments individuels dans le régime de traitement. Les échantillons de cheveux doivent être pulvérisés le jour de l’analyse pour une mesure précise du niveau de concentration des médicaments.

Pour acquérir des échantillons de cheveux, après avoir obtenu un consentement éclairé écrit, préparez les matériaux, y compris une étiquette mince, deux étiquettes participantes, une paire de ciseaux, un morceau de papier d’aluminium déplié, un lingette d’alcool et un sac en plastique. Essuyer les lames des ciseaux à l’aide d’un lingette à l’alcool. Aller à l’arrière de la tête et soulever la partie supérieure des cheveux à l’aide d’une pince à cheveux si désiré.

Rassemblez 30 mèches de cheveux à l’arrière de la tête et isolez le thatch avec votre main. Prenez les ciseaux jusqu’au cuir chevelu et coupez le thatch des cheveux. Placer délicatement le thatch des cheveux sur le papier d’aluminium.

Placez l’étiquette mince sur l’extrémité distale du thatch de cheveux, l’en scotchant solidement au papier d’aluminium. L’extrémité distale est le côté le plus éloigné du cuir chevelu. Pliez le morceau de papier d’aluminium sur le dessus du thatch de cheveux et mettez une étiquette participante sur le dessus du papier d’aluminium.

Placez le morceau plié sur du papier d’aluminium dans le sac en plastique et mettez une autre étiquette participante sur le sac en plastique. Pour l’extraction de médicaments à partir des échantillons de cheveux, peser deux milligrammes de chaque échantillon de cheveux dans des tubes de perles étiquetés individuellement et deux milligrammes de l’échantillon de cheveux blancs dans chacun des 16 tubes de perles supplémentaires. Après pesage, placez tous les tubes de perles dans un homogénéisateur de moulin à perles et homogénéisez les échantillons à une vitesse de 6,95 mètres par seconde pendant deux cycles de 30 secondes avec une période de repos de 15 secondes entre chaque cycle.

Après la deuxième homogénéisation, ajouter 500 microlitres du mélange standard interne approprié à chaque échantillon et ajouter 500 microlitres de méthanol au tube blanc matriciel. Piquer les tubes courbes d’étalonnage avec le volume approprié de mélange standard de référence selon le tableau et placer tous les tubes dans un bain d’eau de 37 degrés avec secousses douces pendant deux heures. À la fin de l’incubation, transférer le supernatant de chaque tube de perles dans de nouveaux tubes de microcentrifugeuses étiquetés et ajouter 500 microlitres de méthanol aux tubes de perles.

Vortex les tubes de perles et transférer le lavage au méthanol dans les tubes de microcentrifugeuse correspondants. Centrifugez les échantillons et transférez soigneusement les supernatants dans de nouveaux tubes sans déranger les granulés de cheveux. Évaporer le liquide dans les tubes à la sécheresse à 32 degrés Celsius et reconstituer les échantillons avec 200 microlitres d’eau de qualité chromatographie liquide haute pression avec 1% d’acide formique.

Après vortex, transférer les échantillons liquides sur des flacons ambrés avec 250 inserts de microlitres. Pour la spectrométrie de masse tandem chromatographie liquide, installez d’abord une colonne de deux à 100 millimètres avec une taille de particules de 2,5 micromètres et une taille de pore angstrom de 100 angstrom avec des perles de phénol éthérées à extrémité polaire entièrement faites de silice poreuse dans le compartiment de la colonne. Confirmez que la colonne dispose également d’une cartouche de garde recommandée par le fabricant.

Copier et coller l’information composée incluse dans les transitions de la méthode MDR-TB LCMS. fichier csv dans la boîte dans la fenêtre spec de masse. Dans une feuille de calcul, créez une séquence par lots de la courbe d’étalonnage, des contrôles de qualité, des échantillons de patients, une courbe d’étalonnage, des contrôles de qualité, des échantillons de patients, une courbe d’étalonnage et des contrôles de qualité.

Ajoutez des injections de solvant blanc au début et à la fin de la course ainsi qu’avant et après la courbe d’étalonnage, des contrôles de qualité et des échantillons de patients. Ensuite, placez au moins huit injections de solvant blanc dans les injections dans la courbe d’étalonnage et le flacon de contrôle de haute qualité pour réduire le report analyte. Lorsque les lots sont terminés, ouvrez le logiciel de quantitation.

Faites défiler les transitions pour vous assurer que le temps de rétention automatiquement sélectionné est exact et vérifiez que le lissage gaussien est réglé à 1,5. Ensuite, cliquez sur affiche la courbe d’étalonnage et la régression et réglez le type d’attente à un sur x. Cliquez sur OK et validez la courbe d’étalonnage et les échantillons de contrôle de la qualité pour vous assurer que le lot a fonctionné avec succès.

Pour chaque analyte de référence de quantificateur, au moins les deux tiers des points d’étalonnage doivent avoir une précision dans un délai de 80-120%Vérifiez que la valeur R affichée au-dessus de la courbe d’étalonnage est supérieure à 0,975. Si toutes les conditions ci-dessus sont remplies, le lot est passé et les échantillons peuvent être quantifiés. Cliquez sur Modifier dans la barre d’outils et cliquez sur Copier la table entière.

Ensuite, coller la table dans une feuille de calcul et utiliser la moyenne de la concentration calculée des deux injections de l’échantillon pour déterminer la concentration déclarée de chaque échantillon. Voici une illustration d’un chromatogramme avec des niveaux confirmés de tous les 11 médicaments antituberculeux testés. Dans ces chiffres, les chromatogrammes irionaux extraits pour un médicament particulier dans l’un des calibrators peuvent être observés.

Les transitions de quantificateur et de qualification sont utilisées pour confirmer qualitativement la présence du médicament, car le rapport entre la zone du quantificateur et la zone de qualification demeure la constante entre les échantillons. La norme interne est également surveillée pour s’assurer que chaque injection d’échantillon est normalisée. Dans cette analyse, un échantillon pratique de 15 échantillons de cheveux parmi une population totale d’étude de 96 patients prenant des médicaments antituberculeux pharmacorésistants dans des conditions thérapeutiques directement observées du Cap occidental, en Afrique du Sud, a été évalué afin de déterminer les niveaux représentatifs de médicaments antituberculeux pharmacorésistants aux niveaux les plus bas et les plus élevés pour chaque analyte.

En l’absence d’une phase solide d’extraction ou d’étape de filtrage, prenez soin lors du transfert du supernatant dans les tubes d’évaporation. Tout ce qui est transféré dans les tubes peut finir injecté dans la colonne. Comme le rotor du rapace perlé peut s’envoler s’il n’est pas bien vissé ou verrouillé, assurez-vous de vérifier le rotor avant de le faire fonctionner.

Contrairement aux antirétroviraux dans le domaine du VIH, la relation entre la pharmacocinétique des médicaments antituberculeux, l’observance et les résultats cliniques reste largement non étudiée. Nous avons émis l’hypothèse que certains médicaments antituberculeux ne s’accumulent pas bien dans les cheveux. Cibler les métabolites de ces médicaments peut fournir une meilleure compréhension de l’observance des patients.