Évaluation morphologique et fonctionnelle des axones et de leurs Synapses pendant la mort d’Axon dans Drosophila melanogaster

L’objectif global de ce protocole de lésion de Drosophila est d’observer à la fois la préservation de la morphologie axonale et synaptique, ainsi que la fonction synaptique des axones et de leurs synapses. Ces analyses peuvent également être utilisées pour caractériser les facteurs d’entretien neuronal, étudier le transport axonal ou analyser les organites axonals dans des axones intacts. L’essai partiel de blessure d’aile permet l’observation des axones blessés subissant la dégénérescence côte à côte avec les axones de commande non blessés dans le même faisceau de nerf dans l’aile de Drosophila.

Cet essai de blessure peut facilement être pratiqué à l’avance chez les mouches de type sauvage en appliquant une coupe à peu près au milieu de l’aile avec des micro-ciseaux. La lésion interne permet l’évaluation de la morphologie axonale et par l’utilisation de l’optogénétique pour visualiser la préservation fonctionnelle de l’axon et de leurs synapses. L’ablation des antennes nécessite des mains stables.

Il est également recommandé de pratiquer l’enlèvement des antennes dans les mouches de type sauvage à l’avance. Dans la dépendance, n’importe quelle configuration optogénétique disponible est appropriée pour activer les neurones dans la mouche avec le chapeau. Sinon, une configuration simple peut facilement être construite à partir de zéro.

Pour commencer, utilisez cinq femelles vierges et cinq mâles du bon génotype pour effectuer des croisements à température ambiante. Transférez la génération P0 dans de nouveaux flacons tous les trois à quatre jours. Recueillir la progéniture adulte fraîchement fermée F1 génération quotidienne dans de nouveaux flacons et les vieillir pendant sept à 14 jours.

Après l’anesthésie, utiliser des micro-ciseaux pour couper la veine de l’aile intérieure à peu près au milieu de l’aile. Utilisez une aile pour la blessure et l’autre aile car un âge correspondait à un contrôle non blessé. Appliquez une blessure par aile et assurez-vous d’obtenir 15 ailes blessées.

Récupérer les mouches dans les aliments contenant des flacons. Ensuite, avec une pipette, étendre 10 microlitres d’huile d’halocarbone 27 le long d’une glissière en verre entier. Un ou sept jours après une blessure, utilisez des micro-ciseaux pour couper les blessés ainsi que l’aile de commande non blessée.

Utilisez des pinces à épiler pour saisir l’aile au centre, monter au maximum quatre ailes dans l’huile d’halocarbone 27 et les couvrir d’une glissière de couverture. Les images de neurones étiquetés GFP dans l’aile peuvent facilement être acquises avec un disque filature. Cependant, le temps d’acquisition doit être effectué dans les moins de huit minutes après le montage des ailes parce que le plat n’est pas fixé.

Imagez l’aile immédiatement à l’aide d’un microscope à disque filature. Acquérir une série de sections optiques le long de l’axe Z avec une taille d’étape de 0,33 micromètre et compresser les piles Z en un seul fichier pour des analyses ultérieures. Croisez cinq femelles vierges et cinq mâles du bon génotype et recueillez la génération F1 comme précédemment.

Après l’anesthésie, utilisez des pinces à épiler pour oblat le troisième segment d’antenne droit pour l’ablation unilatérale ou les deux segments d’antenne tiers gauche et droit pour l’ablation bilatérale. Ceci enlève les corps neuronaux étiquetés de GFP tandis que leurs projections axonales restent dans le CNS. Selon les neurones étiquetés GFP utilisés dans la technique, il est important de savoir si les corps cellulaires sont logés dans le troisième ou dans le deuxième segment d’antenne pour l’analyse des blessures subséquentes.

Récupérer les mouches dans les aliments contenant des flacons. Après l’anesthésie, utilisez une pince à épiler pour saisir le cou et une autre pince à épiler pour fixer le thorax. Tirez doucement le cou et la tête hors du thorax.

À l’aide de pinces à épiler qui ont été trempées dans la solution de fixation, transférer toutes les têtes dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre contenant un millilitre de solution de fixation de 4% de paraformaldéhyde et 0,1 triton X100 en PBS. Fixer les têtes pendant 20 minutes avec une légère agitation à température ambiante. Ensuite, mettez le tube de microcentrifugeuse sur la glace et les têtes gravitent au fond du tube de microcentrifugeuse.

Retirez le supernatant avec une pipette et ajoutez un millilitre de tampon de lavage contenant 0,1% triton X100 dans PBS. Placer le tube sur une roue rotante à température ambiante pour le laver pendant deux minutes. Répétez le lavage quatre fois de plus pour éliminer la solution de fixation résiduelle.

Après avoir préparé les cerveaux, obtenir une diapositive de couverture, coller du ruban adhésif de laboratoire sur elle, et couper un T comme la forme de la bande. Utilisez une pointe de pipette de 20 à 200 microlitres où trois millimètres de la pointe ont été coupés pour élargir l’ouverture de la pipette. Pipette le cerveau contenant un reagent antifade sur la diapositive et couvrir le cerveau avec une diapositive de couverture.

Utilisez de l’argile pour préparer deux petits rouleaux. Assurez-vous que les rouleaux d’argile ne sont pas plus élevés que la hauteur d’une glissière en verre. Collez les rouleaux d’argile sur la glissière de verre et placez le cerveau contenant le sandwich de glissière de couverture sur les rouleaux d’argile.

Procéder selon le manuscrit. Pour préparer les mouches à l’optogénétique, faites d’abord fondre les aliments à la mouche au micro-ondes. Une fois les aliments refroidis, avant la solidification, ajouter 20 millimaux tous trans-rétiniens dans l’éthanol à une concentration finale de 200 micromolaires.

Bien mélanger et verser les aliments immédiatement dans des flacons vides. Couvrir les flacons contenant les aliments solidifiés avec des bouchons ou des boules de coton. Envelopper les flacons de papier d’aluminium.

Ensuite, conservez les aliments contenant des flacons dans une pièce froide et sombre. Utilisez cinq femelles vierges et cinq mâles du bon génotype pour effectuer des croisements à température ambiante et recueillir la génération F1 comme précédemment dans les flacons recouverts d’aluminium contenant 200 micromolaires tous trans-rétiniens dans les aliments pour mouches. Ensuite, recueillir les mouches en les tapant de la nourriture contenant des flacons dans un flacon vide sans nourriture.

Refroidir le flacon dans de la glace contenant de l’eau pendant environ 30 secondes. Les mouches s’endorment. Maintenant, rapidement mettre les mouches individuelles dans de petites chambres couvert une diapositive de couverture pour effectuer l’optogénétique.

Dans une pièce sombre, effectuez le protocole composé de 30 secondes où le feu rouge est absent, suivi de 10 secondes d’exposition aux feux rouges à 10 Hertz. Répétez cette procédure trois fois au total suivie d’un intervalle supplémentaire de 30 secondes lorsque le feu rouge est absent. Recueillir les mouches individuelles de chaque chambre sur des tampons de dioxyde de carbone.

Pour les soumettre à des lésions d’antenne, abrégez les segments d’antenne seconde gauche et droite. Ceci enlève les corps cellulaires des neurones d’organe de Johnston tandis que les projections axonales restent dans le CNS. Récupérer les mouches dans des flacons recouverts d’aluminium contenant 200 millimaux tous trans-Rétiniens.

Aux points de temps correspondants, par exemple sept jours après ablation antennenelle, soumettre les mouches à un autre test de toilettage. Dans ce protocole, trois méthodes ont été présentées pour étudier la morphologie et la fonction des axones sectionnés et de leurs synapses. La première méthode permet l’observation à haute résolution des axones individuels dans le système nerveux périphérique.

Les croisements schématiques pour générer des clones de type sauvage et highwire dans l’aile est montré ici. Le contrôle dans les axones étiquetés GFP blessés sont également présentés avec des flèches indiquant des axones sectionnés. La deuxième approche pour étudier la mort d’axone des axones sensoriels étiquetés de GFP de neurone dans le cerveau est présentée.

Des croisements schématiques pour générer des clones de type sauvage et highwire dans le cerveau sont montrés ici. Des exemples de contrôle dans les axones étiquetés GFP blessés sont présentés avec des flèches indiquant des faisceaux d’axons sectionnés. La troisième méthode démontre l’approche pour visualiser la fonction axonale et synaptique après l’axotomie.

Les croisements schématiques pour générer des neurones sensoriels de type sauvage et dnmnat sur-exprimant l’organe de Johnston sont montrés ici. Les mouches sauvages sont des mouches contenant les neurones organiques de Johnston avec une mort atténuée à l’axone. Les deux ont hébergé un comportement puissant de toilettage avant la blessure.

Cependant, sept jours après la blessure, le toilettage n’a pas été obtenu par l’optogénétique chez les mouches de type sauvage, tandis que les animaux avec la mort atténuée d’axon ont continué à toiletter. Ici, nous utilisons la perte de mutations de la fonction ou notre expression des gènes pour observer la préservation de la morphologie axonale ou de la fonction synaptique. D’autres méthodes de modification peuvent être appliquées, telles que l’interférence de l’ARN knock down ou des knock-outs spécifiques crispr-cas9 spécifiques aux tissus.

Ces méthodes peuvent être utilisées dans un contexte indépendant des blessures. Ils permettent l’observation et la caractérisation des facteurs neuronaux d’entretien pendant le vieillissement, le transport axonal, et les organites axonals dans les axones intacts.