Deux paradigmes différents de préférence de lieu en temps réel utilisant l’optogénétique dans la zone tegmental ventrale de la souris
12 février 2020
Ici, nous présentons deux protocoles faciles à suivre étape par étape pour les paradigmes de préférence de lieu en utilisant l’optogénétique chez la souris. En utilisant ces deux configurations différentes, les comportements de préférence et d’évitement peuvent être solidement évalués au sein d’un même appareil avec une grande sélectivité spatiale et temporelle, et d’une manière simple.
Nous fournissons ici un protocole détaillé pour évaluer les propriétés enrichissantes ou aversives de la stimulation génétique d’une région spécifique du cerveau. La technique peut répondre rapidement si la stimulation de cellules spécifiques est gratifiante ou aversive. Nous décrivons la configuration pour stimuler la zone tegmentale ventrale, mais nos protocoles peuvent facilement être adaptés pour changer des paramètres spécifiques en termes de différentes régions étudiées.
Pour commencer, utilisez des microcontrôleurs à bord unique pour contrôler la source laser. Chargez le script sur la carte de microcontrôleur à l’aide du câble de connexion approprié à l’ordinateur. Le script inclut la modulation externe provenant du logiciel de suivi à travers une boîte TTL, et une sortie au laser pour contrôler les paramètres de stimulation.
Utilisez un câble réseau pour connecter la boîte TTL à la carte. Assurez-vous que le laser est réglé pour contrôler par modulation externe, et connecter le laser à la carte à l’aide d’un câble FC / PC. Connectez les broches appropriées aux parties au sol de la planche.
Pour connecter la source laser à la fibre optique, connectez d’abord la source laser à un joint rotatif. Connectez un cordon patch à l’articulation rotative. Stabiliser l’articulation rotative au-dessus de l’appareil, mais à l’extérieur de la zone d’enregistrement.
Assurez-vous que la longueur du cordon de patch à fibre optique est appropriée pour permettre à la souris de se déplacer sans difficultés dans l’arène. Pour calibrer la configuration de l’arène, utilisez une règle pour mesurer une partie spécifique de l’appareil physique. Dans le logiciel, tracer une ligne correspondant à la partie mesurée.
Sous l’onglet Draw Scale to Calibrate, entrez la valeur déjà connue. Concevez l’arène, dessinez la zone où le mouvement des souris sera enregistré. Créez les zones, dessinez les zones qui seront éventuellement assignées en tant que laser-appariés, laser-non appariés, et neutres.
Appuyez sur le bouton Valider la configuration pour valider la configuration pour confirmer qu’il n’y a pas de paramètres contradictoires, par exemple, les zones en dehors de l’arène. Assurez-vous que le contrôle matériel est activé et réglez l’heure de l’expérience à 30 minutes, à l’option til répétée dans les paramètres de la boîte de référence. Assignez un compartiment en tant qu’appariement laser, dans lequel l’entrée de la souris déclenchera un signal TTL à travers le logiciel de suivi à la carte de microcontrôleur dans les paramètres de condition.
Pour modifier la configuration de l’approche de préférence du compartiment neutre, après la configuration de l’arène et du temps, attribuez les zones A et B comme étant jumelées au laser en ajoutant lorsque le point central se trouve dans l’une des zones A et B pour la boîte d’état liée aux paramètres des compartiments A et B. Pour configurer les paramètres de détection, utilisez un mannequin pour ressembler à la souris. Placez le mannequin dans un compartiment de l’appareil, et utilisez la configuration automatisée avec soustraction dynamique.
Retirez le mannequin et placez-le dans le compartiment opposé. Assurez-vous que le mannequin est entièrement détecté. Placez le mannequin dans le compartiment couplé au laser.
Pour vérifier si la stimulation fonctionne, commencez l’acquisition en utilisant les paramètres de contrôle d’essai précédemment configurés et voyez si la stimulation est déclenchée comme il se doit. Ensuite, placez le mannequin dans le compartiment non apposé ou neutre, et voir si la stimulation est arrêtée. Utilisez le bouton sur le laser pour régler la puissance laser à 10 milliwatts.
Connectez l’implant à fibre optique au cordon de patch à fibre optique à l’aide d’un manchon en céramique et placez la souris dans le compartiment neutre de l’appareil à trois compartiments. Attendez que la souris soit détectée par le logiciel. Retirez les portes coulissantes verticales qui empêchent l’animal d’entrer dans les compartiments principaux.
Laissez l’animal explorer librement sans aucune perturbation. L’expérience de préférence en temps réel se déroule tout au long de huit sessions. Des souris de DAT-Cre injectées avec le virus d’EYFP de channelrhodopsin d’AAV dans la région tegmental ventrale ont été examinées pour cibler des neurones dopaminergiques.
Les souris ont passé en moyenne environ 70% de leur temps dans le compartiment couplé au laser, par opposition au compartiment non apparié à 20% et le compartiment neutre à 10%Un phénotype comportemental opposé a été observé avec des souris Vglut2-Cre injectées avec AAV channelrhodopsin EYFP dans la zone tegmental ventrale. Les souris ont évité le compartiment jumelé à la stimulation, et ont passé plus de temps dans le non-apparié. Pendant les jours conditionnés de réponses cinq et huit, les souris n’ont pas montré un évitement clair du compartiment précédemment jumelé.
Pour démontrer davantage le rôle gratifiant ou aversif de neurones spécifiques, la méthode décrite peut être complétée par d’autres méthodes telles que les paradigmes operon, ou la substimulation photogénétique. Faites attention lors de la manipulation des virus et lorsque vous utilisez des sources laser.
Aperçu
Cet article présente deux protocoles pour des paradigmes de préférence d'endroit utilisant l'optogénétique chez la souris, permettant d'évaluer les comportements de préférence et d'évitement avec une sélectivité spatiale et temporelle élevée.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Analyse du comportement
- Optogénétique
Contexte
- Comprendre les propriétés récompensantes et aversives de la stimulation cérébrale est essentiel en neurosciences.
- L'optogénétique permet un contrôle précis de l'activité neuronale.
- Les paradigmes de préférence de lieu sont couramment utilisés pour évaluer les réponses comportementales aux stimuli.
- Cette étude porte sur la zone tegmentale ventrale et son rôle dans le traitement de la récompense.
Objectif de l'étude
- Développer des protocoles pour évaluer les effets de la stimulation optogénétique sur le comportement de la souris.
- Évaluer comment une stimulation neuronale spécifique influence la préférence et l'évitement.
- Fournir un dispositif souple qui peut être adapté à différentes régions cérébrales.
Méthodes utilisées
- Utilisation de microcontrôleurs à carte unique pour contrôler la stimulation laser.
- Étalonnage de l'arène expérimentale pour un suivi précis des déplacements de la souris.
- Mise en œuvre de signaux TTL pour synchroniser la stimulation avec le comportement de la souris.
- Évaluation des réponses comportementales au cours de plusieurs séances avec différents génotypes de souris.
Résultats principaux
- Les souris DAT-Cre ont montré une préférence pour le compartiment associé au laser, y passant 70 % de leur temps.
- Les souris Vglut2-Cre ont présenté une évitement du compartiment associé au laser.
- Les réponses comportementales variaient selon les différents jours de test.
- La méthode peut être complétée par d'autres techniques afin d'obtenir une validation supplémentaire.
Conclusions
- Les protocoles offrent une méthode fiable pour étudier les effets d'une stimulation neuronale spécifique sur le comportement.
- Les résultats indiquent des phénotypes comportementaux distincts selon le fond génétique.
- Des recherches supplémentaires pourraient approfondir ces découvertes en utilisant des méthodologies additionnelles.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
L'évaluation des propriétés récompensantes ou aversives de la stimulation neuronale est essentielle pour la validation des cibles en découverte de médicaments fondée sur les neurosciences. Les paradigmes de préférence de lieu en temps réel permettent une interrogation causale rapide de circuits neuronaux spécifiques, soutenant une détection mécanistique des risques associés aux hypothèses thérapeutiques. Cette approche fournit des mesures comportementales quantitatives qui éclairent les décisions d'aller ou de ne pas aller dans les flux de travail précoces de découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet de tester de façon causale si la stimulation d'une population neuronale définie provoque des phénotypes de récompense ou d'aversion.
- Valeur opérationnelle : Fournit en temps réel des mesures comportementales quantitatives à haute résolution temporelle, facilitant l'interrogation des hypothèses.
- Valeur prédictive : Renforce la confiance dans la cible en reliant l'activation neuronale à des sorties comportementales mesurables pertinentes pour les indications neuropsychiatriques.
Développement de criblage et de tests
- Prêt de l'essai : Établit un essai comportemental standardisé et reproductible pour l'analyse de cibles neuromodulatrices à l'aide d'une stimulation optogénétique.
- Données quantitatives : Génère des mesures de temps passé dans un compartiment qui servent de variables dépendantes pour évaluer les effets de la stimulation selon les génotypes ou conditions.
- Extensibilité : Le protocole peut être adapté à différentes régions cérébrales et à divers paramètres de stimulation, permettant des campagnes de criblage croisé de cibles.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : La stimulation de la zone tegmentale ventrale modélise le fonctionnement de la voie mésolimbique, ce qui est pertinent pour les troubles liés à la récompense et les thérapeutiques contre l'addiction.
- Continuité translationnelle : Les mesures comportementales en temps réel établissent un lien entre les études d'interaction neuromodulatrice aiguë et les évaluations à plus long terme de la préférence conditionnée pour un lieu.
- Réduction des risques mécanistiques : Permet de distinguer les effets neuronaux directs des réponses compensatoires du réseau, réduisant ainsi l'ambiguïté concernant le mécanisme ciblé.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans la phase de biologie de la découverte, où la validation ciblée au niveau des circuits précède l'identification des composés candidats et les tests d'efficacité préclinique.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en déterminant si l'activation optogénétique de neurones spécifiques induit des comportements de récompense ou d'aversion.
- Essais : Permet la standardisation et la reproductibilité des tests pour évaluer des cibles neuromodulatrices dans différentes conditions génétiques ou pharmacologiques.
- Analyse : Fournit des variables dépendantes quantitatives (temps passé dans les compartiments appariés au laser, non appariés, neutres) permettant la comparaison statistique des effets de la stimulation.
- Recherche translationnelle : Relie les effets aigus de la stimulation neuronale à des phénotypes comportementaux, avec des implications pour les modèles précliniques du traitement de la récompense.
- Réutilisation institutionnelle : Le cadre peut être standardisé entre laboratoires et adapté à différentes régions cérébrales, favorisant une réutilisation à l'échelle de la plateforme dans la découverte en neurosciences.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Fournit un éclairage mécanistique sur la causalité neuronale, réduisant ainsi les faux positifs dans le choix des cibles.
- Valeur opérationnelle : Permet une évaluation comportementale à haut débit grâce au suivi automatisé et au contrôle en temps réel de la stimulation.
- Valeur stratégique : Renforce la confiance dans les stratégies de modulation des cibles, favorisant une meilleure allocation des ressources en phase précoce de découverte.
- Impact sur le portefeuille : Facilite la priorisation ajustée au risque des cibles, fondée sur la validation comportementale d'effets spécifiques aux circuits.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en optogénétique, en administration de vecteurs viraux et en chirurgie stéréotaxique pour cibler précisément les neurones.
- Repose sur un matériel intégré comprenant des microcontrôleurs, des lasers, des joints rotatifs, des fibres optiques et des logiciels de suivi du comportement.
- Exige une standardisation inter-équipes entre les groupes de neurosciences, d'ingénierie et d'analyse de données afin d'assurer un montage et un étalonnage cohérents.
- Doit tenir compte de la variabilité de l'expression des opsines, du positionnement des fibres et de la puissance délivrée par le laser d'un sujet à l'autre.
- Limité aux effets comportementaux aigus ; n'évalue pas les adaptations chroniques ou les mécanismes compensatoires sans études longitudinales complémentaires.
Foire aux questions sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:36
Setting up the Control of the Laser Source
1:44
Setting Up the Experiment for the RT-PP (Real-Time Place Preference) Approach and NCP (Neutral Compartment Preference) Approach
3:13
Performing an Experiment Using Laser Stimulation
4:24
Results: Real-Time Place Preference Experiment
5:18
Conclusion
