Name: Micro-ondes et Fluorophore-Tyramide pour l’immunostaining multiplex sur les surrénales de souris - utilisation d’anticorps primaires non conjugués de la même espèce hôte (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Découvrez l'immunostaining multiplex sur surrénales de souris par micro-ondes et fluorophore-tyramide. Cette méthode élimine la réactivité croisée des anticorps primaires non conjugués de même espèce hôte.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail est soutenu par NIH R00 HD032636.

1. Staining avec le premier anticorps
<ol><li>Décire et réhydrater les glissières FFPE avec 5 min allouées à chacune des étapes suivantes : xylène ou réactifs équivalents 3x, 100 % éthanol 2x, 95 % éthanol 1x, 70 % éthanol 1x, 50 % éthanol 1x et eau distillée 2x. REMARQUE : Les glissières doivent rester humides à partir de cette étape de réhydratation jusqu’à l’accumulation dans l’étape finale.</li>
	<li>Pour la récupération facultative de l’antigène, placez les lames dans 275 ml de solution de citrate de sodium bouillante (10 mm, pH et 6,0) pendant 8 min. Pour maintenir la solution bouillante, placez les lames à plat sur le fond d’une boîte de tuyauterie de 14 x 9,5 x 9 cm3 (W x L x H) avec un couvercle et micro-ondes la solution sur 70 % de puissance dans un four à micro-ondes de 700 W pendant 8 min. Retirez ensuite la boîte de tip du four à micro-ondes, ouvrez le couvercle et laissez la solution refroidir à température ambiante (RT) pendant au moins 20 min.</li>
	<li>Transférer les diapositives dans un pot de Coplin contenant de la PBST (saline tamponnée de phosphate avec 0,1 % de polysorbate 20/80). Laver avec pBST pendant 5 min 3x. Si vous ne passez pas immédiatement à l’étape suivante, entreposez les diapositives à cette étape avec pBST dans un bocal Coplin à RT pendant quelques heures ou à 4 oC pendant 1-2 jours si ce n’est pas immédiatement passer à l’étape suivante.</li>
	<li>Pour préparer la solution de blocage, utilisez le sérum normal de l’espèce hôte de l’anticorps secondaire comme réactif de blocage. D’autres réactifs de blocage commerciaux peuvent également être utilisés. Si vous utilisez le sérum normal utilisé pour l’étude présentée dans cette étude, ajoutez 100 L de sérum d’âne normal à 4,9 mL de PBST. La solution de blocage peut être stockée à 4 oC pendant une température pouvant aller jusqu’à 3 jours.</li>
	<li>Pour bloquer, secouez la PBST des diapositives et recouvrez-les rapidement d’une solution de blocage suffisante. Incuber les toboggans à RT dans une chambre humidifiée pendant 30 min.</li>
	<li>Préparer la solution d’anticorps primaire (500 l pour deux diapositives) en utilisant la solution de blocage pour diluer l’anticorps primaire à la concentration désirée. La solution doit être stockée sur la glace jusqu’à l’utilisation.<ol>
<li>Pour 3'HSD, ajouter 2 'L de 3'HSD dans 498 'L de solution de blocage.</li>
		<li>Pour TH, ajouter 0,5 L d’anticorps TH dans 499 'L de solution de blocage.</li>
		<li>Pour la caténine, ajouter 1 'L d’anticorps de caténine dans 499 'L de solution de blocage.</li>
		<li>Pour 20'HSD, ajoutez 1 'L d’anticorps de 20'HSD dans 499 'L de solution de blocage.</li>
		<li>Pour CYP2F2, ajouter 2 'L d’anticorps CYP2F2 dans 498 'L de solution de blocage.</li>
	</ol></li>
	<li>Incuber avec l’anticorps primaire en secouant la solution de blocage des diapositives, et rapidement les couvrir avec une solution d’anticorps primaire suffisante. Incuber les toboggans dans une chambre humidifiée pendant la nuit à 4 oC. Pendant l’incubation, les diapositives peuvent être recouvertes d’un petit morceau de film de paraffine pour éviter le dessèchement.</li>
	<li>Le lendemain matin laver les diapositives avec PBST pour 5 min 3x.</li>
	<li>Préparer la solution d’anticorps secondaire (500 l pour deux diapositives) en utilisant la solution de blocage pour diluer l’anticorps secondaire biotinylated à la concentration désirée (p. ex., 1 l d’anticorps antisouris à ânes ou d’anticorps anti-lapin à ânes en 499 l de blocage solution). La solution doit être stockée sur la glace jusqu’à l’utilisation.</li>
	<li>Incuber avec le deuxième anticorps en secouant la PBST des diapositives et en les recouvrant rapidement d’une solution d’anticorps secondaire suffisante. Incuber les toboggans dans une chambre humidifiée pendant 1 h à RT. REMARQUE : Si la biotine endogène est une préoccupation, utilisez un anticorps secondaire peroxidase-conjugué au lieu de l’anticorps secondaire biotinylated. Passez à l’étape 1.14 si vous utilisez un anticorps secondaire conjugué à la peroxidase à l’étape 1.10.</li>
	<li>Laver les toboggans avec pBST pendant 5 min 3x.</li>
	<li>Préparer la solution de streptavidine conjuguée au raifort peroxidase (SA-HRP) (500 l pour deux diapositives) en ajoutant 0,5 L de SA-HRP en 499 L de PBS. La concentration finale est de 1 g/mL.</li>
	<li>Incuber avec la solution SA-HRP. Secouez la PBST des diapositives et recouvrez rapidement les diapositives d’une solution SA-HRP suffisante. Incuber les toboggans dans une chambre humidifiée pendant 0,5 h à RT.</li>
	<li>Laver les toboggans avec pBST pendant 5 min 3x.</li>
	<li>Préparer la solution fluorophore-tyramide en diluant le fluorophore-tyramide avec son tampon de dilution selon les instructions du fabricant (p. ex., 5 l de fluorophore-tyramide en 496 l de tampon de dilution).</li>
	<li>Effectuer le développement du signal avec fluorophore-tyramide en secouant la PBST des diapositives et en couvrant rapidement les diapositives avec une solution suffisamment fluorophore-tyramide. Incuber dans une chambre humidifiée pendant 1 min à RT. Le temps d’incubation peut être ajusté pour obtenir l’intensité de fluorescence désirée. Arrêtez la réaction en transférant les diapositives dans un bocal Coplin contenant de la PBST. Laver les toboggans avec pBST pendant 3 min 2x.</li>
	<li>Les signaux peuvent être rapidement vérifiés sous un microscope à fluorescence pour confirmer le résultat à ce stade. Si les résilles ne sont pas utilisées, appliquez une goutte de glycérol :PBS (1:1) sur chaque section pour garder les échantillons humides. Laver les toboggans avec pBST pendant 3 min 2x. Les glissières peuvent être stockées en PBST à 4 oC pendant quelques jours avant de passer à l’étape suivante.</li>
</ol>2. Dépouiller le premier anticorps
<ol><li>Placez les lames dans 275 ml de solution de citrate de sodium bouillante (10 mm, pH et 6,0) pendant au moins 8 min. Maintenez la solution à ébullition en plaçant les lames à plat sur le fond d’une boîte à tuyaux de 14 x 9,5 x 9 cm3 (W x X H) avec couvercle et micro-ondes de la solution sur une puissance de 700 W pendant 8 min. Si un temps de décapage plus long est préférable, il peut être nécessaire de compléter le tampon à l’aide d’une solution de citrate de sodium bouillante pour garder les diapositives immergées dans la solution tampon en tout temps. Retirez la boîte de tip du four à micro-ondes, ouvrez le couvercle et laissez la solution refroidir à RT pendant au moins 20 min.</li>
	<li>Transférer les diapositives dans un bocal Coplin contenant de la PBST. Laver avec pBST pendant 5 min 3x. Si l’étape suivante, si elle n’est pas effectuée immédiatement, entreposez les diapositives dans un bocal Coplin avec PBST à RT pendant quelques heures ou à 4 oC pendant 1-2 jours.</li>
</ol>3. Tache avec le deuxième anticorps
<ol><li>Commencez par l’étape de blocage et suivez les mêmes procédures dans l’étape 1.5 à l’étape 1.14. Aux étapes de développement du signal (étape 1,15 et étape 1,16), utilisez le fluorophore-tyramide dans un spectre de fluorescence différent. REMARQUE : Les diapositives peuvent être dépouillées à l’aide de cette méthode plusieurs fois pour permettre la coloration multiplexe. Le dernier anticorps n’a pas besoin de fluorophore-tyramide comme le journaliste. Un anticorps secondaire conjugué au fluorophore pourrait être utilisé pour montrer les signaux du dernier anticorps primaire.</li>
	<li>Incuber les toboggans avec 2 g/mL 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ou la solution Hoechst pendant 1 min à RT si la coloration du compteur nucléaire est nécessaire. Ensuite, lavez les diapositives avec PBST pendant 3 min 2x.</li>
</ol>4. Imagerie à l’aide d’un microscope à fluorescence pour détecter les signaux
<ol><li>Montez un bordereau avec une goutte de milieu de montage adapté à l’immunofluorescence.</li>
	<li>Pour l’imagerie, utilisez un microscope à fluorescence pour détecter les signaux de chaque canal de fluorescence. Commencez par le canal de coloration nucléaire (DAPI) et la lentille 4x pour localiser le tissu sur la diapositive.</li>
	<li>Passez à l’objectif 10x pour l’imagerie. Ajuster le temps d’exposition (300 ms) et l’intensité des sources lumineuses (intensité de 80 %). Ajustez ces réglages si le signal est trop lumineux ou trop foncé. Prenez des photos de chaque canal sans déplacer la scène. Un recentrage peut être nécessaire pour chaque canal. Fusionnez les images de chaque canal à l’aide du logiciel du microscope ou de l’ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).</li>
</ol>

<ol><li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li>
<li>Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+simple%2C+reliable%2C+and+sensitive+method+for+multiple+immunoenzyme+staining%3A+use+of+microwave+oven+heating+to+block+antibody+crossreactivity+and+retrieve+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).</li>
<li>Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwaving+for+double+indirect+immunofluorescence+with+primary+antibodies+from+the+same+species+and+for+staining+of+mouse+tissues+with+mouse+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies.</a> Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).</li>
<li>Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-wide+immunohistochemical+analysis+of+protein+co-localization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization.</a> PLoS One. 7 (2), e32043(2012).</li>
<li>Bolognesi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Staining+by+Sequential+Immunostaining+and+Antibody+Removal+on+Routine+Tissue+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).</li>
<li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li>
<li>Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+immunolabeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+in+combination+with+tyramide+signal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification.</a> Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).</li>
<li>Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitation+of+microwave+treatment+for+double+immunolabelling+with+antibodies+of+the+same+species+and+isotype%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype.</a> Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).</li>
<li>Pirici, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+elution+method+for+multiple+immunohistochemistry+on+primary+antibodies+raised+in+the+same+species+and+of+the+same+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).</li>
<li>Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIMPLE%3A+a+sequential+immunoperoxidase+labeling+and+erasing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+5-plex+fluorescent+immunohistochemistry+with+tyramide+signal+amplification+and+same+species+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies.</a> Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).</li>
<li>Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+biotin+as+a+marker+of+adrenocortical+cells+with+steroidogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).</li>
<li>Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrieved+endogenous+biotin%3A+a+novel+marker+and+a+potential+pitfall+in+diagnostic+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry.</a> Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).</li>
<li>Wang, H., Pevsner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+endogenous+biotin+in+various+tissues%3A+novel+functions+in+the+hippocampus+and+implications+for+its+use+in+avidin-biotin+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology.</a> Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Multiplex immunostaining est utile pour examiner la colocalisation cellulaire de deux ou plusieurs antigènes. Cette technique largement utilisée donne des résultats convaincants de colocalisation lorsque les anticorps primaires sont conjugués avec différents journalistes (coloration directe). Cependant, la coloration directe fournit habituellement des signaux plus faibles par rapport à la coloration indirecte, ce qui implique des anticorps secondaires conjugués pour détecter les anticorps primaires. Dans la coloration in...

Dans l’immunostaining multiplex, la coloration directe utilisant des anticorps primaires conjugués peut fournir des résultats informatifs. Sans utiliser d’anticorps secondaires, la méthode de coloration directe présente un faible risque de faux signaux de colocalisation provenant de la réactivité croisée des anticorps. Cependant, les reporters conjugués (fluorophore, enzymes) ou la biotine sur l’anticorps primaire limitent son utilisation future. Alternativement, l’immunostaining indirect fournit habituellement des signaux plus forts en utilisant un anticorps primaire non conjugué avec un anticorps secondaire étiqueté. Idéalement, les anticorps primaires non conjugués utilisés dans l’immunostaining multiplex devraient provenir de différentes espèces hôtes pour éviter la réactivité croisée des anticorps. Cependant, la combinaison appropriée d’anticorps primaires provenant de différentes espèces hôtes n’est pas toujours disponible.
Plusieurs méthodes ont été établies pour éliminer le risque que l’anticorps secondaire réagisse avec un anticorps primaire indésirable. Une méthode courante est l’utilisation d’un anticorps monomeric F(ab) pour bloquer les épitopes de liaison restants sur le premier complexe d’anticorps primaires avant de coloration avec le deuxième anticorps primaire1. Le décapage des anticorps, qui est similaire à la bande et à la résondance d’une feuille de tache occidentale, enlève le complexe d’anticorps précédemment taché sans dépouiller le dépôt de molécules de reporter détectables telles que le tétrahydrochlorure de 3,3'-diaminobenzidine (DAB)2 et le dépôt fluorescent de tyramide3. Avec cette méthode, les molécules de reporter dans différentes couleurs peuvent montrer un résultat multiplexe sur la même diapositive. La coloration multiplexe est également réalisable par l’élimination complète des couches précédemment déposées d’anticorps et l’alignement des images acquises ultérieurement à partir d’autres anticorps4,5. Ces méthodes donnent toutes des résultats fiables, bien que chaque méthode ait ses limites et nécessite soit des procédures compliquées, soit un système d’imagerie spécial.
Le protocole actuel montre l’application d’une méthode de décapage des anticorps avec l’utilisation de tampons couramment disponibles. Ce protocole peut être utilisé pour effectuer des taches immunofluorescentes multiplex sur des sections surrénales de souris intégrées à la paraffine (FFPE) avec deux anticorps primaires non étiquetés de la même espèce hôte.

<table><tbody><tr><td>Antifade Mounting Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Âne biotinylé anti-souris</td><td>JacksonImmuno</td><td>715-066-151</td><td>dilution 1:500</td></tr><tr><td>âne biotinylé anti-lapin</td><td>JacksonImmuno</td><td>711-066-152</td><td>dilution 1:500</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>BioLegend</td><td>422801</td><td>2 &mu ; g/mL dans de l’eau distillée</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence</td><td>ECHO</td><td>Revolve 4</td><td></td></tr><tr><td>Raifort streptavidine conjuguée à la peroxydase</td><td>JacksonImmuno</td><td>016-030-084</td><td>Dilution 1:1 000</td></tr><tr><td>Four à micro-ondes, 700 W</td><td>General Electric</td><td>JEM3072DH1BB</td><td></td></tr><tr><td>Souris anti-CYP2F2</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-374540</td><td>dilution 1:250</td></tr><tr><td>Souris anti-TH</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-25269</td><td>dilution 1:1 000</td></tr><tr><td>Sérum d’âne normal</td><td>JacksonImmuno</td><td>017-000-121</td><td>Sérum à 2 % dans PBST</td></tr><tr><td>Lapin anti-20&alpha ; HSD</td><td>Kerafast</td><td>EB4002</td><td>dilution 1:500</td></tr><tr><td>Lapin anti-3&beta ; HSD</td><td>TransGenic</td><td>KO607</td><td>dilution 1:250</td></tr><tr><td>Rabbit anti-TH</td><td>NOVUS</td><td>NB300-109</td><td>dilution 1:1 000</td></tr><tr><td>Rabbit anti-&beta ;-catenin</td><td>Abcam</td><td>ab32572</td><td>dilution 1:500</td></tr><tr><td>Streptavidin Raifort Peroxydase (SA-HRP)</td><td>JacksonImmuno</td><td>016-303-084</td><td>Dilution 1:1 000</td></tr><tr><td>TSA Cy3 Tyramide</td><td>PerkinElmer</td><td>SAT704B001EA</td><td>Dilution de 1:100</td></tr><tr><td>TSA Fluorescéine Tyramide</td><td>PerkinElmer</td><td>SAT701001EA</td><td>dilution 1:100</td></tr></tbody></table>

micro-ondes et fluorophore-tyramide pour l’immunostaining multiplex sur les surrénales de souris - utilisation d’anticorps primaires non conjugués de la même espèce hôte

Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals &#8722; Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species

Immunostaining est largement utilisé dans la recherche biomédicale pour montrer le modèle d’expression cellulaire d’une protéine donnée. L’immunostaining multiplex permet l’étiquetage à l’aide de plusieurs anticorps primaires. Pour minimiser la réactivité croisée des anticorps, l’immunostaining multiplex à l’aide de taches indirectes nécessite des anticorps primaires non étiquetés provenant de différentes espèces hôtes. Cependant, la combinaison appropriée de différents anticorps d’espèces n’est pas toujours disponible. Ici, nous décrivons une méthode d’utilisation des anticorps primaires non étiquetés de la même espèce hôte (par exemple, dans ce cas, les deux anticorps sont du lapin) pour l’immunofluorescence multiplex sur les sections surrénales de souris formalin-fixes (FFPE). Cette méthode utilise la même procédure et les réactifs utilisés dans l’étape de récupération d’antigène pour dépouiller l’activité du complexe d’anticorps primaire précédemment taché. Des glissières ont été souillées avec le premier anticorps primaire utilisant un protocole d’immunostaining général suivi d’une étape de liaison avec un anticorps secondaire biotinylated. Ensuite, une méthode de développement de signal avidin-biotine-peroxidase a été utilisée avec le fluorophore-tyramide comme substrat. L’immunoactivité du premier complexe primaire d’anticorps a été dépouillée par immersion dans une solution de citrate de sodium bouillante au micro-ondes pendant 8 min. Le dépôt insoluble de fluorophore-tyramide est resté sur l’échantillon, ce qui a permis à la glissière d’être tachée avec d’autres anticorps primaires. Bien que cette méthode élimine la plupart des faux signaux positifs, un certain fond de la réactivité croisée des anticorps peut rester. Si les échantillons sont enrichis en biotine endogène, un anticorps secondaire conjugué par peroxidase peut être utilisé pour remplacer l’anticorps secondaire biotinylated pour éviter le faux positif de la biotine endogène récupérée.

Les résultats ont été obtenus à partir d’échantillons traités avec toutes les étapes décrites, y compris l’étape de récupération d’antigène 1.2. Tous les anticorps secondaires utilisés ici ont été biotinylated. Fluorophore-tyramide a été utilisé pour développer des signaux à partir des premiers et deuxièmes anticorps primaires. Des images ont été capturées à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’un cube FITC (pour la fluorescence verte), d’un cube TxRED (pour Cy3) et d’un cube DA...

Plusieurs méthodes différentes ont été établies pour l’immunostaining multiplex utilisant des anticorps primaires de la même espèce hôte. Ici, nous décrivons l’utilisation du décapage micro-ondes d’anticorps et du fluorophore-tyramide pour bloquer la réactivité croisée d’anticorps pendant l’immunostaining multiplex sur les sections surrénales paraffines formalin-fixes de paraffine.

Micro-ondes et Fluorophore-Tyramide pour l’immunostaining multiplex sur les surrénales de souris - utilisation d’anticorps primaires non conjugués de la même espèce hôte

Immunostaining is widely used in biomedical research to show the cellular expression pattern of a given protein. Multiplex immunostaining allows labeling ...

L’immunostaining est largement utilisé dans la recherche biomédicale pour identifier l’emplacement d’une protéine d’intérêt. L’immunostaining multiplexe peut détecter plusieurs cibles sur le même échantillon à l’aide d’anticorps primaires différents. L’avantage de cette méthode est l’utilisation de tampons couramment disponibles pour éliminer la réactivité croisée des anticorps permettant l’immunostaining à l’aide de deux ou plusieurs anticorps primaires non étiquetés de la même espèce hôte.Sophia Zheng, étudiante diplômée, et Qiongxia Lyu, chercheur invité de mon laboratoire, démontreront la procédure. Avant de tacher, de-cirer et de réhydrater les diapositives intégrées à la paraffine fixées à la formaline avec des immersions de cinq minutes dans chaque solution comme indiqué. Après la deuxième immersion d’eau distillée, placez les glissières dans 275 millilitres de solution bouillante de citrate de sodium au fond d’une boîte à pointes pipette avec couvercle et placez la boîte dans un four à micro-ondes de 700 watts à 75 % de puissance pendant huit minutes.À la fin du traitement, ouvrez le couvercle et laissez refroidir la solution à température ambiante avant de laver les glissières avec trois lavages de cinq minutes de PBST frais dans un bocal Coplin. Pour bloquer les sites de fixation non spécifiques, après le dernier lavage secouer l’excès de PBST de chaque diapositive et couvrir les diapositives avec un volume suffisant d’une solution de blocage appropriée. Après 30 minutes à température ambiante dans une chambre humidifiée, secouez la solution de blocage excédentaire de chaque glissière et ajoutez 250 microlitres du premier anticorps primaire d’intérêt à chaque échantillon.Pour éviter que des échantillons ne se dessèchent, les diapositives peuvent être recouvertes d’un morceau de film de paraffine. Après une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius dans une chambre humidifiée, lavez les glissières trois fois avec du PBST frais pendant cinq minutes par lavage. Secouez l’excès de PBST puis couvrez rapidement chaque toboggan avec 250 microlitres d’une solution d’anticorps secondaire appropriée pour une incubation d’une heure dans une chambre humidifiée à température ambiante.À la fin de l’incubation, lavez les glissières trois fois dans le PBST frais tel que démontré et ajoutez 250 microlitres de peroxyde de raifort streptavidine fraîchement préparé à chaque diapositive. Après 30 minutes à température ambiante, lavez les glissières trois fois dans du PBST frais. Ensuite, secouez l’excès de PBST et couvrez chaque toboggan de 250 microlitres de solution fluorophore-tyramide fraîchement préparée.Une minute plus tard, submergez les glissières dans le PBST frais suivi de trois lavages de deux minutes dans le PBST frais. Après le dernier lavage, appliquez quelques gouttes d’une solution glycérol-pbs en tête-à-tête aux sections et vérifiez la présence d’un signal de fluorescence par microscopie de fluorescence. Pour dépouiller le premier complexe d’anticorps, placez les glissières étiquetées anticorps dans 275 millilitres de solution bouillante de citrate de sodium pendant au moins huit minutes, comme démontré.À la fin du traitement, ouvrez le couvercle et laissez refroidir la solution à température ambiante avant de laver les glissières trois fois avec le PBST pendant cinq minutes par lavage. Pour tacher la deuxième protéine cible d’intérêt, après blocage pour la liaison non spécifique comme démontré, étiquetez chaque échantillon avec 250 microlitres du deuxième anticorps primaire d’intérêt à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, lavez les glissières trois fois pendant cinq minutes en PBST frais par lavage avant de couvrir chaque toboggan de 250 microlitres d’une solution d’anticorps secondaire appropriée pour une incubation d’une heure à température ambiante.À la fin de l’incubation, lavez les glissières trois fois dans le PBST frais tel que démontré et ajoutez 250 microlitres de peroxyde de raifort streptavidine fraîchement préparé à chaque diapositive. Pour développer le signal de la deuxième protéine cible d’intérêt, après trois lavages PBST, traiter les diapositives avec le tyramide conjugué fluorophore dans un spectre de fluorescence différent. Pour arrêter le développement du signal tyramide, submergez les glissières dans PBST.Ensuite, teindre les échantillons avec un colorant nucléaire approprié. Pour l’imagerie par microscopie par fluorescence, montez chaque colorant nucléaire étiqueté glisser avec une goutte d’un milieu de montage approprié dans un coverslip. Utilisez l’objectif 4X pour localiser le tissu sur la lame.Passez à l’objectif 10X pour l’imagerie et ajustez le temps d’exposition à 100 à 400 millisecondes avec la source lumineuse entre 40 et 80% d’intensité. Obtenez ensuite des images dans chaque canal sans déplacer la scène. Les images de chaque canal peuvent être fusionnées pour former une image fluorescente multiplexe.Sans décapage entre la première et la coloration secondaire d’anticorps, la deuxième coloration pour l’hydroxylase de tyrosine ramassera des signaux de la première protéine cible d’intérêt ayant pour résultat une coloration faussement positive d’hydroxylase de tyrosine, par exemple dans cet échantillon dans le cortex surrénalien. Pour éliminer la réactivité croisée des anticorps dans le peroxyde de raifort du premier décapage à micro-ondes d’une minute et de huit minutes, il est possible d’effectuer un décapage propre à double coloration. Aucun signal significatif n’est capté dans les échantillons de contrôle négatifs.Le décapage de huit minutes dans le tampon bouillant de citrate est également suffisant pour éliminer la réactivité croisée d’anticorps pour beaucoup d’anticorps couramment utilisés dans la glande surrénale. Dans certains cas, un faible signal faux positif est encore détectable, cependant, et une augmentation de 20 minutes au traitement par micro-ondes peut encore ne pas enlever complètement la réactivité croisée de l’anticorps. Pendant l’imagerie par fluorescence, il est important de ne pas déplacer la scène lors de la commutation des canaux.Toutefois, il peut être nécessaire de réajuster l’accent pour obtenir des images claires de chaque canal. Pour chaque canal, assurez-vous d’ajuster le temps d’exposition pour vous assurer que les signaux sont correctement exposés sans pixels ou zones surexposés dans les images. Au cours de la procédure de coloration, il est important de garder les diapositives hydratées de la dé-épilation et les diapositives peuvent être dépouillées en utilisant les mêmes méthodes de décapage à plusieurs reprises pour permettre la coloration multiplexe.

microwaving-fluorophore-tyramide-for-multiplex-immunostaining-on

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Cette vidéo présente un test permettant d’effectuer une immunocoloration multiplex à l’aide d’anticorps primaires de la même espèce hôte. Dans cette méthode, une section de tissu surrénalien subit un processus d’immunocoloration en deux étapes. Initialement, la section est colorée avec des anticorps spécifiques des marqueurs du cortex, suivie d’un démantèlement de l’anticorps lié et d’une recoloration avec des anticorps spécifiques des marqueurs de la moelle.

Procédé d’immunomarquage multiplex utilisant des anticorps primaires de la même espèce hôte

Cet article vidéo illustre un protocole complet permettant de détecter et de quantifier tous les stades de la neurogenèse de l’hippocampe adulte au sein d’une même section de tissu. Nous avons élaboré une méthode pour surmonter les limites de l’immunofluorescence multiple indirecte qui surviennent lorsque des anticorps appropriés de différentes espèces hôtes ne sont pas disponibles.

Immunohistochimie et d&#39;étiquetage multiple avec des anticorps de l&#39;espèce hôte mêmes pour l&#39;étude des adultes hippocampe neurogenèse

L’immunohistochimie est une technique de laboratoire puissante pour évaluer la localisation et l’expression des protéines dans les tissus. Les méthodes semi-automatisées actuelles de quantification introduisent de la subjectivité et créent souvent des résultats irreproductibles. Nous décrivons ici des méthodes d’immunohistochimie multiplexée et de quantification objective de l’expression et de la co-localisation des protéines à l’aide de l’imagerie multispectrale.

Quantification de l&#39;expression protéique et co-localisation utilisant multiplexé Immuno-histochimie Coloration et multispectrale Imaging

La localisation de l’expression génique sur des types de cellules spécifiques peut être difficile en raison de l’absence d’anticorps spécifiques. Nous décrivons ici un protocole de triple détection simultanée de l’expression génique en combinant l’hybridation in situ d’ARN à double fluorescence avec l’immunomarquage.

Combinant Double Fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation avec Immunomarquage pour la détection de l&#39;expression de trois gènes chez la souris Sections du cerveau

Nous présentons ici une méthode pour isoler les glandes surrénales de souris, difficulté les tissus, leur section et effectuez l’immunofluorescence souillant.

Isolation, Fixation et l’Immunofluorescence imagerie des glandes surrénales de souris

Nous décrivons ici un protocole pour multiplex immunohistochemical fluorescent de coloration et d’imagerie pour la localisation simultanée de plusieurs antigènes associés aux cancer des lymphomes. Ce protocole peut être étendu à l’analyse de colocalisation de biomarqueurs dans toutes les coupes de tissus.

Marquage immunohistochimique Fluorescent multiplexé, l’imagerie et l’analyse des échantillons histologique du lymphome

L'immunohistochimie fluorescente multiplex est une technologie émergente qui permet la visualisation de plusieurs types de cellules dans le tissu intact de formaline-fixe, incorporé de paraffine (FFPE). Présentés sont des lignes directrices pour assurer un multiplexe 7-couleur réussie avec des instructions pour optimiser les anticorps et les réactifs, la préparation des diapositives, la conception et des conseils pour éviter les problèmes communs.

Optimisation, conception et éviter les pièges dans l'immunohistochimie fluorescente du multiplex manuel

L’analyse d’images de codes à barres multiplexés a récemment amélioré la caractérisation du microenvironnement tumoral, permettant des études approfondies de la composition cellulaire, de l’état fonctionnel et des interactions cellule-cellule. Nous décrivons ici un protocole de coloration et d’imagerie utilisant le codage à barres d’anticorps conjugués oligonucléotidiques et l’imagerie cyclique, qui permet l’utilisation d’une technique d’analyse d’images de haute dimension.

Analyse d’images de codes à barres multiplexés pour l’immunoprofilage et la caractérisation de la cartographie spatiale dans l’analyse unicellulaire d’échantillons de tissus de paraffine

Dans cet article, un protocole d’immunofluorescence multiplex (mIF) manuelle d’amplification du signal tyramide (TSA) combiné à l’analyse d’images et à l’analyse spatiale est décrit. Ce protocole peut être utilisé avec des coupes de paraffine fixées au formol (FFPE) pour la coloration de deux à six antigènes par lame selon le scanner de lames disponible en laboratoire.

Immunofluorescence multiplex combinée à l’analyse d’images spatiales pour l’évaluation clinique et biologique du microenvironnement tumoral

L’immunohistochimie cyclique multiplex permet la détection in situ de plusieurs marqueurs simultanément en utilisant l’incubation répétée d’antigène-anticorps, le balayage d’images et l’alignement et l’intégration d’images. Nous présentons ici le protocole opératoire pour identifier les substrats des cellules immunitaires avec cette technologie dans des échantillons de cancer du poumon et de métastases cérébrales appariées.

Immunohistochimie par fluorescence cyclique multiplex

Ce protocole fournit un guide étape par étape pour la conception d’un panel d’anticorps d’immunofluorescence multiplex pour l’imagerie basée sur un code-barres d’ADN des tissus murins de mélanome FFPE. Nous décrivons également un pipeline d’analyse d’images utilisant des outils open-source pour générer des informations protéomiques spatiales sur le microenvironnement immunitaire de la tumeur du mélanome murin.

Imagerie par immunofluorescence multiplex basée sur un code-barres d’ADN pour analyser des échantillons FFPE provenant d’un mélanome murin génétiquement reprogrammé

Découvrez l'immunostaining multiplex sur surrénales de souris par micro-ondes et fluorophore-tyramide. Cette méthode élimine la réactivité croisée des anticorps primaires non conjugués de même espèce hôte.

Micro-ondes et Fluorophore-Tyramide pour l’immunostaining multiplex sur les surrénales de souris - utilisation d’anticorps primaires non conjugués de la même espèce hôte (Vidéo) | JoVE Journal

Micro-ondes et Fluorophore-Tyramide pour l’immunostaining multiplex sur les surrénales de souris - utilisation d’anticorps primaires non conjugués de la même espèce hôte

Explorer plus de vidéos