Micro-ondes et Fluorophore-Tyramide pour l’immunostaining multiplex sur les surrénales de souris - utilisation d’anticorps primaires non conjugués de la même espèce hôte

L’immunostaining est largement utilisé dans la recherche biomédicale pour identifier l’emplacement d’une protéine d’intérêt. L’immunostaining multiplexe peut détecter plusieurs cibles sur le même échantillon à l’aide d’anticorps primaires différents. L’avantage de cette méthode est l’utilisation de tampons couramment disponibles pour éliminer la réactivité croisée des anticorps permettant l’immunostaining à l’aide de deux ou plusieurs anticorps primaires non étiquetés de la même espèce hôte.

Sophia Zheng, étudiante diplômée, et Qiongxia Lyu, chercheur invité de mon laboratoire, démontreront la procédure. Avant de tacher, de-cirer et de réhydrater les diapositives intégrées à la paraffine fixées à la formaline avec des immersions de cinq minutes dans chaque solution comme indiqué. Après la deuxième immersion d’eau distillée, placez les glissières dans 275 millilitres de solution bouillante de citrate de sodium au fond d’une boîte à pointes pipette avec couvercle et placez la boîte dans un four à micro-ondes de 700 watts à 75 % de puissance pendant huit minutes.

À la fin du traitement, ouvrez le couvercle et laissez refroidir la solution à température ambiante avant de laver les glissières avec trois lavages de cinq minutes de PBST frais dans un bocal Coplin. Pour bloquer les sites de fixation non spécifiques, après le dernier lavage secouer l’excès de PBST de chaque diapositive et couvrir les diapositives avec un volume suffisant d’une solution de blocage appropriée. Après 30 minutes à température ambiante dans une chambre humidifiée, secouez la solution de blocage excédentaire de chaque glissière et ajoutez 250 microlitres du premier anticorps primaire d’intérêt à chaque échantillon.

Pour éviter que des échantillons ne se dessèchent, les diapositives peuvent être recouvertes d’un morceau de film de paraffine. Après une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius dans une chambre humidifiée, lavez les glissières trois fois avec du PBST frais pendant cinq minutes par lavage. Secouez l’excès de PBST puis couvrez rapidement chaque toboggan avec 250 microlitres d’une solution d’anticorps secondaire appropriée pour une incubation d’une heure dans une chambre humidifiée à température ambiante.

À la fin de l’incubation, lavez les glissières trois fois dans le PBST frais tel que démontré et ajoutez 250 microlitres de peroxyde de raifort streptavidine fraîchement préparé à chaque diapositive. Après 30 minutes à température ambiante, lavez les glissières trois fois dans du PBST frais. Ensuite, secouez l’excès de PBST et couvrez chaque toboggan de 250 microlitres de solution fluorophore-tyramide fraîchement préparée.

Une minute plus tard, submergez les glissières dans le PBST frais suivi de trois lavages de deux minutes dans le PBST frais. Après le dernier lavage, appliquez quelques gouttes d’une solution glycérol-pbs en tête-à-tête aux sections et vérifiez la présence d’un signal de fluorescence par microscopie de fluorescence. Pour dépouiller le premier complexe d’anticorps, placez les glissières étiquetées anticorps dans 275 millilitres de solution bouillante de citrate de sodium pendant au moins huit minutes, comme démontré.

À la fin du traitement, ouvrez le couvercle et laissez refroidir la solution à température ambiante avant de laver les glissières trois fois avec le PBST pendant cinq minutes par lavage. Pour tacher la deuxième protéine cible d’intérêt, après blocage pour la liaison non spécifique comme démontré, étiquetez chaque échantillon avec 250 microlitres du deuxième anticorps primaire d’intérêt à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, lavez les glissières trois fois pendant cinq minutes en PBST frais par lavage avant de couvrir chaque toboggan de 250 microlitres d’une solution d’anticorps secondaire appropriée pour une incubation d’une heure à température ambiante.

À la fin de l’incubation, lavez les glissières trois fois dans le PBST frais tel que démontré et ajoutez 250 microlitres de peroxyde de raifort streptavidine fraîchement préparé à chaque diapositive. Pour développer le signal de la deuxième protéine cible d’intérêt, après trois lavages PBST, traiter les diapositives avec le tyramide conjugué fluorophore dans un spectre de fluorescence différent. Pour arrêter le développement du signal tyramide, submergez les glissières dans PBST.

Ensuite, teindre les échantillons avec un colorant nucléaire approprié. Pour l’imagerie par microscopie par fluorescence, montez chaque colorant nucléaire étiqueté glisser avec une goutte d’un milieu de montage approprié dans un coverslip. Utilisez l’objectif 4X pour localiser le tissu sur la lame.

Passez à l’objectif 10X pour l’imagerie et ajustez le temps d’exposition à 100 à 400 millisecondes avec la source lumineuse entre 40 et 80% d’intensité. Obtenez ensuite des images dans chaque canal sans déplacer la scène. Les images de chaque canal peuvent être fusionnées pour former une image fluorescente multiplexe.

Sans décapage entre la première et la coloration secondaire d’anticorps, la deuxième coloration pour l’hydroxylase de tyrosine ramassera des signaux de la première protéine cible d’intérêt ayant pour résultat une coloration faussement positive d’hydroxylase de tyrosine, par exemple dans cet échantillon dans le cortex surrénalien. Pour éliminer la réactivité croisée des anticorps dans le peroxyde de raifort du premier décapage à micro-ondes d’une minute et de huit minutes, il est possible d’effectuer un décapage propre à double coloration. Aucun signal significatif n’est capté dans les échantillons de contrôle négatifs.

Le décapage de huit minutes dans le tampon bouillant de citrate est également suffisant pour éliminer la réactivité croisée d’anticorps pour beaucoup d’anticorps couramment utilisés dans la glande surrénale. Dans certains cas, un faible signal faux positif est encore détectable, cependant, et une augmentation de 20 minutes au traitement par micro-ondes peut encore ne pas enlever complètement la réactivité croisée de l’anticorps. Pendant l’imagerie par fluorescence, il est important de ne pas déplacer la scène lors de la commutation des canaux.

Toutefois, il peut être nécessaire de réajuster l’accent pour obtenir des images claires de chaque canal. Pour chaque canal, assurez-vous d’ajuster le temps d’exposition pour vous assurer que les signaux sont correctement exposés sans pixels ou zones surexposés dans les images. Au cours de la procédure de coloration, il est important de garder les diapositives hydratées de la dé-épilation et les diapositives peuvent être dépouillées en utilisant les mêmes méthodes de décapage à plusieurs reprises pour permettre la coloration multiplexe.