Name: Opsono-Adherence Test pour évaluer les anticorps fonctionnels dans le développement de vaccins contre les anthracis Bacillus et autres pathogènes encapsulés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Découvrez le test d'opsono-adhérence pour évaluer les anticorps fonctionnels dans le développement de vaccins contre Bacillus anthracis. Cette méthode sûre remplace les essais traditionnels et se réalise en laboratoire BSL-1 ou BSL-2.

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J. Chua, D. Chabot et A. Friedlander ont conçu les procédures décrites dans le manuscrit. J. Chua et T. Putmon-Taylor ont effectué les expériences. D. Chabot a effectué une analyse des données. J. Chua a écrit le manuscrit.
Les auteurs remercient Kyle J. Fitts pour son excellente assistance technique.
Le travail a été soutenu par la subvention de l’Agence de réduction des menaces de défense CBM. VAXBT.03.10.RD.015, numéro de plan 921175.
Les opinions, interprétations, conclusions et recommandations sont celles des auteurs et ne sont pas nécessairement approuvées par l’armée américaine. Le contenu de cette publication ne reflète pas nécessairement les points de vue ou les politiques du département de la Défense, et la mention de noms commerciaux, de produits commerciaux ou d’organisations n’implique pas nécessairement l’approbation du gouvernement des États-Unis.

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Les auteurs n’ont pas d’association commerciale ou autre qui pourrait poser un conflit d’intérêts.

Les vaccins à base de capsules se sont montrés efficaces contre de nombreux agents pathogènes bactériens, et beaucoup sont homologués pour uneutilisation chez l’homme 25,26,27. Ces vaccins fonctionnent en générant des anticorps ciblant la capsule et beaucoup de ces études utilisent l’OPKA pour montrer les fonctions opsono-phagocytiques des anticorps13,14,<sup ...

La reconnaissance, l’adhérence, l’internalisation et la dégradation d’un agent pathogène font partie intégrante de la phagocytose1, une voie saillante dans la réponse immunitaire innée de l’hôte décrite pour la première fois par Ilya Metchnikoff en 18832,3. Les leucocytes phagocytiques, ainsi que d’autres cellules du système immunitaire, sont très discriminatoires dans leur sélection des cibles; ils sont capables de faire la distinction entre le « non-soi infectieux » et le « soi non infectieux » par des modèles moléculaires associés à l’agent pathogène par leur répertoire de récepteurs de reconnaissance des motifs (PRR)4,5. La reconnaissance par l’hôte d’un agent pathogène peut également se produire avec la liaison des opsonines hôtes, comme le complément et lesanticorps 6. Ce processus, appelé opsonisation, enrobe l’agent pathogène de ces molécules, améliorant l’internalisation en se liant aux récepteurs opsoniques (p. ex., récepteurs de complément et de Fc) sur les cellules phagocytiques6. Pour qu’un agent pathogène adhère à un phagocyte, la liaison collective de récepteurs multiples avec leurs ligands cognate est nécessaire. Ce n’est qu’alors que l’adhérence peut déclencher et soutenir des cascades de signalisation à l’intérieur de la cellule hôte pour initier l’internalisation6.
En raison de l’importance de la phagocytose dans le dégagement des agents pathogènes et la prévention de l’infection, les agents pathogènes extracellulaires ont développé de nombreuses façons de subvertir ce processus pour prolonger leur survie. Une stratégie d’importance est la production d’une capsule anionique polymérique (p. ex., polysaccharide ou acide polyamino) qui est anti-phagocytique en raison de sa charge, est mal immunogène, et protège les molécules sur l’enveloppe bactérienne des PRR6,7. Des agents pathogènes tels que cryptococcus néoformans et streptocoques pneumoniae ont des capsules composées de polymères saccharides, tandis que Staphylococcus epidermidis et certaines espèces de Bacillus produisent de l’acide poly-ɣ-glutamique (PGGA)7,8. Pourtant, d’autres agents pathogènes produisent des capsules qui ressemblent à l’auto non infectieuse. Par exemple, Streptococcus pyogenes et une souche pathogène de B. cereus ont une capsule d’acide hyaluronique qui est non seulement anti-phagocytique, mais qui peut également ne pas être reconnu comme étranger par le système immunitaire9,10.
La conjugaison de la capsule en protéines porteuse les convertit à partir d’antigènes pauvres et indépendants en T hautement immunogènes dépendants des antigènes qui peuvent induire des titres anticorps anti-capsule sériquesélevés 11,12. Cette stratégie est utilisée pour les vaccins homologués contre S. pneumoniae, Haemophilus influenzaeet Neisseria meningitides11. Les activités opsoniques des anticorps anti-capsules ont généralement été évaluées par des analyses de mise à mort opsono-phagocytiques (OPKA)13,14,15,16. Ces analyses testent si les anticorps fonctionnels peuvent déclencher la phagocytose et tuer14. Toutefois, l’utilisation de l’OPKA avec des agents pathogènes infectieux, tels que les agents et toxines biologiques de niveau 1 (BSAT), y compris B. anthracis17,est dangereuse et présente des risques pour la sécurité; ces analyses nécessitent une manipulation approfondie d’un agent sélectionné. La manipulation d’agents sélectionnés ne peut se faire que dans des laboratoires restreints de niveau 3 (BSL-3); les travaux dans ces domaines exigent des procédures d’exploitation prolongées en raison des nombreuses précautions de sécurité qui doivent être suivies. Les laboratoires BSL-3 ne sont généralement pas équipés de l’équipement spécialisé utilisé pour le travail opka, comme les microscopes et les cytomètres. Ainsi, nous avons développé un essai alternatif basé sur l’utilisation de bactéries inactivées18,19. Nous appelons cela un essai opsono-adhérence (OAA) qui ne dépend pas de l’internalisation et de tuer comme sorties d’analyse; au lieu de cela, l’adhérence des agents pathogènes inactivés opsonized est employée comme index de phagocytosis. Mécaniquement, oaa est un substitut approprié parce que l’adhérence se produit a priori et est intimement liée à l’internalisation et à la mise à mort intracellulaire. Du point de vue de la biosécurité, l’OAA est préférable parce qu’elle nécessite une manipulation minimale d’un agent infectieux, est expérimentalement de plus courte durée que l’OPKA et peut être effectuée dans les laboratoires BSL-2 après qu’un stock de l’agent pathogène inactivé a été produit et transféré.
Nous démontrons l’utilisation de l’OAA pour examiner la fonction opsonique des anticorps anti-capsules trouvés dans sera des primates non humains (NHPs) vaccinés avec une capsule conjuguée [c.-à-PGGA de B. anthracis conjugué au complexe de protéine de membrane externe (OMPC) des méningitides de Neisseria]20. Des bacilles opsonized de sérum ont été incubés avec une ligne adhérente de cellules de macrophage de souris, RAW 264.7. Après fixation, le monocouche cellulaire et les bacilles adhérents ont été photographiés par microscopie de fluorescence. L’adhérence bactérienne a augmenté quand les bacilles ont été incubés avec le sérum des NHPs vaccinés avec le conjugué de capsule comparé au sérumde contrôle 20. L’adhérence est corrélée avec la survie du défi anthrax20,21. Ainsi, l’utilisation de l’OAA a caractérisé la fonction des anticorps anti-capsule et a grandement facilité l’essai de notre candidat de vaccin.

<table><tbody><tr><td>0,20 et micro ; Filtre à seringue m (25 mm, cellulose régénérée)</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>Seringue 431222</td><td></td></tr><tr><td>10 mL (pointe Luer-Lok)</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>15&micro ; 96 plaques noires à 96 puits (plaque #1 pour l’imagerie)</td><td>In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA</td><td>P96-1-N</td><td></td></tr><tr><td>16 % paraformaldéhyde</td><td>Microscopie électronique Science, Hatfield, PA</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Fiole traitée pour culture tissulaire de 75 cm carrés</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Agar (poudre)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Complément pour bébé lapin</td><td>Cedarlane Labs, Burlington, NC</td><td>CL3441</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure Bacto</td><td>BD, Sparks, MD</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>BBL Perfusion cerveau-cœur (BHI)</td><td>BD, Sparks, MD</td><td>211059</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de gélose au sang (TSA avec sang de mouton)</td><td>Remel, Lenexa, KS</td><td>R01198</td><td></td></tr><tr><td>Racleur de cellules</td><td>Sarstedt, Newton, NC</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire Costar 96 puits (plaques #2 & 3 pour les dilutions)</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Verre de couverture</td><td>Microscopie électronique Science, Hatfield, PA</td><td>72200-10</td><td></td></tr><tr><td>Bouillon de nutriments Difco</td><td>BD, Sparks, MD</td><td>234000</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), haute teneur en glucose</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>11965-092</td><td>contient 4500 mg/L de glucose, 4 mM de L-glutamine, Phenol Red</td></tr><tr><td>EVOS FL Auto Cell Imaging System (microscope à fluorescence)</td><td>Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>AMAFD1000</td><td></td></tr><tr><td>Sérum</td> <td>de veau fœtalHyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT</td><td>SH30071.03</td><td>non irradié aux rayons gamma, non inactivé par la chaleur</td></tr><tr><td>Isothiocyanate de fluorescéine</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>F143</td><td></td></tr><tr><td>HCS Cell Mask Orange Cell Stain</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>H32713</td><td></td></tr><tr><td>hémocytomètre (Neubauer amélioré)</td><td>Hausser Scientific, Horsham, PA</td><td>3900</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’encre d’Inde</td><td>BD, Sparks, MD</td><td>261194</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine (200 mM)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA</td><td>25030081</td><td>support de complément avec 2 mM supplémentaires de L-glutamine</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-U (microscope composé inversé)</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY</td><td>TE2000</td><td></td></tr><tr><td>PBS sans calcium ni magnésium</td><td>Lonza, Walkersville, MD</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Solution de pénicilline-streptomycine, 100x</td><td>Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT</td><td>SV30010 boîtes de</td><td></td></tr><tr><td>Pétri (100 x 15 mm)</td><td>Falcon, Corning, Durham, NC</td><td>351029</td><td>pour plaques de gélose</td></tr><tr><td>RAW 264.7 lignée cellulaire de macrophage (Tib47)</td><td>ATCC, Manassas, VA</td><td>ATCC TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Lames</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>16004-422</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate</td><td>de sodium Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Solution de bleu de trypan (0,4 %)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Microscopie à balayage laser Zeiss 700 (microscope confocal)</td><td>Microimagerie Carl Zeiss, Thornwood, NY</td><td>4109001865956000</td><td></td></tr></tbody></table>

opsono-adherence test pour évaluer les anticorps fonctionnels dans le développement de vaccins contre les anthracis bacillus et autres pathogènes encapsulés

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

L’essai d’opsono-adhérence est un essai fonctionnel qui énumère l’attachement des pathogènes bactériens aux phagocytes professionnels. Puisque l’adhérence est nécessaire à la phagocytose et à la mise à mort, l’essai est une méthode alternative aux analyses opsono-phagocytiques de mise à mort. Un avantage de l’essai d’opsono-adhérence est l’option d’utiliser des agents pathogènes inactivés et des lignées cellulaires de mammifères, qui permet la normalisation à travers plusieurs expériences. L’utilisation d’un agent pathogène inactivé dans l’analyse facilite également le travail avec des agents infectieux de niveau 3 de biosécurité et d’autres agents pathogènes virulents. Dans nos travaux, l’essai d’opsono-adhérence a été employé pour évaluer la capacité fonctionnelle des anticorps, du sera des animaux vaccinés avec un vaccin à base de capsule d’anthrax, pour induire l’adhérence des anthracis fixes de Bacillus à une lignée cellulaire de macrophage de souris, RAW 264.7. La microscopie automatisée de fluorescence a été employée pour capturer des images des bacilles adhérant aux macrophages. L’adhérence accrue a été corrélée avec la présence des anticorps d’anti-capsule dans le sérum. Les primates non humains qui présentaient des concentrations élevées d’anticorps anti-capsules sériques ont été protégés contre le défi de l’anthrax. Ainsi, l’essai d’opsono-observance peut être employé pour élucider les fonctions biologiques des anticorps spécifiques d’antigène dans sera, pour évaluer l’efficacité des candidats de vaccin et d’autres thérapeutiques, et pour servir de corrélation possible de l’immunité.

Cette section montre des micrographes représentatifs recueillis au cours d’une expérience de l’OAA ainsi que des résultats montrant que l’OAA peut être utilisé pour examiner la fonction biologique des anticorps. Ici, l’analyse a été utilisée avec succès pour évaluer l’efficacité d’un candidat vaccin contre l’anthrax. Il est essentiel de vérifier l’état de l’encapsulation sur les bacilles que peu ou pas d’encapsulation les amène à adhérer aux cellules hôtes, produisant un fond élevé. La figure 1</stro...

L’essai d’opsono-adhérence est une méthode alternative à l’essai opsono-phagocytic de tuer pour évaluer les fonctions opsonic des anticorps dans le développement de vaccin.

Opsono-Adherence Test pour évaluer les anticorps fonctionnels dans le développement de vaccins contre les anthracis Bacillus et autres pathogènes encapsulés

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is ...

Le test Opsono-Adherence analyse la présence d’anticorps oposoniques fonctionnels produits chez les animaux après la vaccination, qui se sont avérés corrélés avec l’efficacité de plusieurs vaccins humains homologués. Ce test est préféré pour une utilisation avec des agents biologiques sélectifs et d’autres agents pathogènes infectieux et peut être effectué dans un laboratoire BSL-1 ou BSL-2 après le transfert de l’agent BSL-3 inactivé. L’efficacité des anticorps dirigés contre les capsules bactériennes, y compris la capsule de Bacillus anthracis, s’est avérée efficace dans des modèles animaux d’infection.Les tests Opsono-Adherence évaluent fonctionnellement les anticorps sans infecter les animaux. Respecter toutes les procédures de sécurité de l’établissement lorsque vous travaillez avec des souches virulentes encapsulées de Bacillus anthracis. Pour cette vidéo, nous utilisons une souche inactivée dans des conditions de biosécurité de niveau deux.Commencez cette procédure par la préparation des cellules RAW 264.7, comme décrit dans le protocole texte. Pour plaquer les cellules pour le test d’opsono-adhérence, remplacez le ballon par un milieu frais et utilisez un grattoir cellulaire pour gratter doucement les cellules du ballon. Pipette de haut en bas pour briser les amas de cellules et faciliter le comptage des cellules.Plaquez 14 000 cellules par puits dans une plaque à fond plat en verre de 0,15 micron d’épaisseur de 96 puits. Laissez les cellules se développer pendant trois jours, en remplaçant le milieu épuisé un jour avant d’effectuer l’OAA. Après trois jours d’incubation, le nombre de cellules devrait être d’environ 50 000 cellules par puits.Pour commencer l’essai, préparez une plaque maîtresse de Bacillus anthracis à partir d’un stock de spores en la striant pour l’isoler sur une plaque de gélose NBY. À des fins de démonstration, une plaque de gélose au sang de mouton a été utilisée. Incuber à 37 degrés Celsius pendant une journée avant de cultiver dans le bouillon.Ensuite, inoculez 30 millilitres de bouillon de culture dans une fiole ventilée de 250 millilitres avec plusieurs colonies de bacilles. Secouez la culture de bouillon à 125 tr/min, 37 degrés Celsius, avec 20 % de CO2 et d’humidité pendant 18 à 24 heures. Utilisez une coloration négative avec de l’encre de Chine pour assurer une encapsulation suffisante et que les bacilles sont en chaînes courtes avant la fixation.Pour ce faire, mélangez cinq microlitres de suspension bactérienne avec deux microlitres d’encre de Chine sur une lame de microscope. Ensuite, placez un verre de couverture d’un ou 1,5 micron d’épaisseur sur le dessus de la suspension sans créer de bulles. Observez la suspension bactérienne à l’aide d’une lentille d’objectif à huile 40 à 100 fois sur un microscope optique.Une capsule épaisse exclut l’encre de Chine. Assurez-vous que les bacilles sont encapsulés en observant une zone de clairance autour de chaque bactérie. Assurez-vous également que les chaînes de Bacilles sont courtes.Pour déterminer les unités formant colonies, ou UFC, diluez en série 100 microlitres de culture un à 10 dans une solution de PBS et les dilutions de culture sur des plaques de gélose au sang de mouton. Incuber pendant 12 à 18 heures à 37 degrés Celsius. Comptez les UFC et déterminez le nombre de bactéries par millilitre de culture.Après s’être assuré que les bacilles sont suffisamment encapsulés, dilués et plaqués, fixez la culture bactérienne restante en ajoutant 10 millilitres de paraformaldéhyde à 16 % aux 30 millilitres de culture à une concentration finale de 4 % de paraformaldéhyde. Transférez le volume dans un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, agitez lentement sur un agitateur à température ambiante pendant sept jours.Pour tester la stérilité, transférez quatre millilitres, soit 10 % du volume, de suspension bactérienne fixe dans un tube conique de 50 millilitres. Lavez la suspension en ajoutant du PBS et en granulant à un minimum de 3000 G pendant 45 minutes. Retirez ensuite le surnageant, en veillant à ce que la pastille moelleuse ne soit pas dérangée.Après avoir répété ce lavage au moins deux fois, remettez l’échantillon fixé en suspension dans quatre millilitres de PBS. Il est nécessaire de retirer tout le fixateur pendant les lavages afin que le fixateur n’interfère pas avec les tests de viabilité. Si nécessaire, augmentez le nombre de lavages.Pour tester la viabilité, inoculez 40 millilitres d’un milieu de croissance bactérienne avec quatre millilitres de suspension lavée et incubez à 37 degrés Celsius pendant sept jours. Vérifiez la densité optique à 600 nanomètres dans un spectrophotomètre avant et après sept jours pour mesurer la turbidité. Après sept jours d’incubation dans une culture en bouillon, déposer au moins 100 microlitres de bouillon sur une plaque de gélose et incuber pendant sept autres jours.Si aucune augmentation de la turbidité et aucune croissance sur les plaques n’est observée, la culture originale est considérée comme stérile et peut être transférée dans un laboratoire BSL-2. Suivez les directives de l’établissement pour l’approbation des transferts. Lavez le stock bactérien inactivé trois fois dans du PBS pour éliminer le fixateur.Ajouter la solution FITC à une concentration finale de 75 microgrammes par millilitre. Agitez lentement le mélange pendant 18 à 24 heures à quatre degrés Celsius. Lavez les bactéries comme avant pour éliminer l’excès de FITC.Après le lavage final, remettez les Bacilles en suspension dans PBS dans le même volume de départ. et conservez les Bacilles à moins 20 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Inactivez par la chaleur un petit volume de sérums de test provenant de primates non humains à 56 degrés Celsius pendant 30 minutes dans un bloc de chaleur ou une machine PCR.Faites tomber et lavez deux fois les bactéries marquées au FITC avec du PBS en les granulant à 15 000 fois G pendant trois à cinq minutes. Suspendez à nouveau dans PBS dans le même volume de démarrage. Dans une plaque à fond rond de 96 puits, diluer en série les sérums d’essai dans un milieu cellulaire.Dans une autre plaque à fond rond de 96 puits, ajoutez 10 microlitres de sérum de test dilué dans chaque puits. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de compliment bébé lapin fraîchement reconstitué. À la planche numéro trois, ajoutez le volume approprié de bacilles marqués FITC pour une multiplicité d’infection de 20.Par exemple, à un volume contenant 50 000 fois 20 bacilles pour 50 000 cellules. Remplissez chaque puits de la plaque numéro trois avec le volume approprié de milieu cellulaire jusqu’à un total de 105 microlitres. Incuber la plaque numéro trois à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes en présence de 5 % de CO2 avec de l’humidité pour opsoniser les Bacilles.Placez la plaque numéro un, qui contient des cellules d’adhérence, sur un bloc de chaleur de 37 degrés Celsius. Utilisez une pipette multicanaux pour retirer le milieu usé des puits et remplacez-le rapidement par 100 microlitres de bactéries opsonize de la plaque numéro trois, en veillant à ce qu’aucune bulle ne soit générée dans les puits pendant le pipetage. Pour ne pas perturber la monocouche cellulaire, ajoutez du volume sur les côtés des puits.Incuber la plaque numéro un à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 et d’humidité pendant 30 minutes pour l’adhérence. Lavez chaque puits cinq fois avec 150 microlitres de PBS, au-dessus du bloc de chaleur de 37 degrés Celsius, pour éliminer les bacilles non attachés. Pipette sur le côté des puits pour s’assurer que les cellules ne sont pas dispersées accidentellement pendant le lavage.Ajoutez 150 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % dans chaque puits et fixez les cellules pendant une heure. Après avoir lavé les cellules deux fois avec du PBS, mélangez deux microlitres de coloration des cellules orange de criblage à haut contenu dans 10 millilitres de PBS. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de cette solution de coloration pour fixer les cellules, et incubez pendant 30 minutes à température ambiante.Placez la plaque numéro un sur la scène et concentrez-vous sur les cellules en utilisant le fond clair ou le contraste de phase. Dans l’onglet Acquisition, sélectionnez le format 96 puits comme réglage de la plaque. Ensuite, sélectionnez Paramètres de la chaîne.Ensuite, sélectionnez le réglage en mode Tuile. Indiquez le nombre d’images à acquérir. Changez le mode d’acquisition en noir et blanc ou monochrome, et réglez le binning sur au moins deux par deux.Activez l’autofocus ou le module de mise au point. Indiquez la fréquence à laquelle la fonction de mise au point automatique doit être effectuée. Ensuite, activez la fonction Z-Stack, si elle est disponible.Indiquez le nombre d’empilements Z qui captureront l’épaisseur de la monocouche cellulaire et des bacilles adhérents. Désignez un dossier de fichiers dans lequel enregistrer les images. Maintenant, exécutez le programme d’imagerie automatisé.Effectuer la collecte et l’analyse des données comme décrit dans le protocole texte. La souche Ames de Bacillus anthracis a été colorée négativement à l’encre de Chine pour examiner l’encapsulation. L’état d’encapsulation doit être vérifié, car peu ou pas d’encapsulation les fait adhérer aux cellules hôtes sans anticorps, produisant un bruit de fond élevé.L’intensité de la fluorescence et les caractéristiques de photoblanchiment des bacilles ont été examinées à l’aide de la microscopie confocale. Il est essentiel de vérifier que la fluorescence des bacilles ne s’estompe pas de manière significative avec le temps, car les bacilles subiront de longues expositions à la lumière pendant l’imagerie. Les images de projection maximale de Bacillus anthracis attachées aux monocouches cellulaires sont présentées ici.Il s’agit de champs de vision représentatifs qui ont été comptés et notés pour le test d’adhérence optique. L’augmentation de la fixation des bacilles incubés avec l’antisérum conjugué des capsules est due à la présence d’anticorps anti-capsule qui opsonisent les bacilles. Les titres sériques des primates non humains vaccinés avec 10 et 50 microgrammes de conjugué de gélule sont significativement plus élevés que les titres de conjugué et de gélule seuls.Nous développons un test similaire qui utilise la cytométrie en flux et les neutrophiles humains, qui sont des cellules non adhérentes, pour mesurer l’activité opsonique et également pour quantifier la capsule à la surface des bactéries. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension du test d’opsono-adhérence. N’oubliez pas que travailler avec des agents pathogènes BSL-3 est extrêmement dangereux.Les directives institutionnelles et les précautions de sécurité doivent être strictement suivies.

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Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

La vidéo montre un essai de destruction opsonophagocytaire in vitro utilisant une co-culture de neutrophiles humains avec Streptococcus pneumoniae. Les anticorps et les protéines du complément facilitent l’opsonisation des bactéries, permettant aux neutrophiles de reconnaître et de tuer les bactéries, montrant ainsi une activité opsonophagocytaire réussie des neutrophiles.

Évaluation de l’activité de destruction des opsonophagocytes contre les agents pathogènes bactériens

Cette vidéo présente un test d’opsono-adhérence pour examiner l’interaction entre les bactéries opsonisées et les cellules immunitaires. Des bactéries marquées par fluorescence, traitées avec un sérum de test contenant des anticorps anti-capsule, sont incubées avec des macrophages. Après avoir coloré les macrophages avec la fluorescence, les bactéries attachées à la surface des macrophages sont observées au microscope pour la visualisation.

Dosage de l’opsono-adhérence pour évaluer l’opsonisation de bactéries encapsulées par des anticorps anti-capsule

Une nouvelle technique pour l’affichage rapide de l’antigène sur la surface bactérienne est présente, ce qui implique biotinylation surface suivie d’une exposition à des protéines d’intérêt en fusion avec avidine monomère. Chargement de BCG avec certains antigènes avec succès améliore son immunogénicité, suggérant que la décoration de surfaces peut remplacer les approches génétiques traditionnelles.

Expression des antigènes exogènes dans le Mycobacterium bovis BCG par l’intermédiaire de décoration de Surface Non génétiques avec le système avidine-biotine

Nous présentons ici un protocole élégant pour in vivo l’évaluation du vaccin hôte et l’efficacité des réponses immunitaires. Ce protocole peut être adapté pour des modèles de vaccin qui étudient les virus, bactéries ou parasites pathogènes.

Évaluation des réponses de l’hôte-pathogène et l’efficacité du vaccin chez la souris

Ce test de mise à mort d’opsonophagocytic est utilisé pour comparer la capacité des cellules immunitaires phagocytaires de répondre à et de tuer les bactéries issus des différents traitements et/ou des conditions. Classiquement, ce test sert de l’étalon-or pour évaluer les fonctions effectrices des anticorps contre une bactérie comme opsonine.

Opsonophagocytic meurtre dosage pour évaluer les réponses immunologiques contre les bactéries pathogènes

Ici, un protocole simple est présenté pour produire des nanoparticules d’ARNm à base de polymères poly(bêta aminoesster), faciles à adapter en changeant l’ARNm encapsulé. Le flux de travail de synthèse des polymères, des nanoparticules et de leur caractérisation essentielle in vitro est également décrit. Une preuve de concept concernant la vaccination est également ajoutée.

Synthèse et caractérisation de nanoparticules poly(bêta-aminoesters) chargées d’ARNm à des fins de vaccination

Le protocole présente des méthodes détaillées pour évaluer si l’adjuvant de nanoémulsion ophiopogonine D favorise des réponses immunitaires cellulaires efficaces.

In vitro Évaluation de l’activité cellulaire de l’adjuvant du vaccin à nanoémulsion ophiopogonine D

Dans l’infection à Mycoplasma pneumoniae, les tests sérologiques peuvent générer de bons résultats, mais avec une faible spécificité en raison de la réaction immunologique croisée. Le test ELISA interne de capture d’antigènes, décrit dans cet article, garantit une spécificité élevée de l’espèce et s’est avéré être un test de dépistage fiable pour un diagnostic précis de M. pneumoniae.

DOSAGE IMMUNO-ENZYMATIQUE DE CAPTURE D’ANTIGÈNE POUR LA DÉTECTION SPÉCIFIQUE DE MYCOPLASMA PNEUMONIAE

Le présent protocole prépare et évalue les propriétés physiques, la réponse immunitaire et l’effet protecteur in vivo d’un nouveau vaccin adjuvant à base de nanoémulsion.

Évaluation de la réponse immunitaire d’un vaccin adjuvant à base de nanoémulsion contre l’infection à Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM)

Ici, nous présentons un protocole alternatif pour induire activement l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale chez les souris C57BL / 6, en utilisant l’épitope immunogène myéline oligodendrocyte glycoprotéine (MOG)35-55 en suspension dans l’adjuvant de Freund incomplet contenant la sous-espèce paratuberculose de Mycobacterium avium tuée par la chaleur.

Activité adjuvante de Mycobacterium paratuberculosis dans l’amélioration de l’immunogénicité des autoantigènes au cours de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale

Dans ce protocole, nous avons développé un acide rétinoïque (AR) encapsulé dans une nanoémulsion cationique à utiliser comme adjuvant pour favoriser les réponses systémiques et muqueuses spécifiques de l’antigène. En ajoutant l’AR approuvé par la FDA à la nanoémulsion, la sIgA spécifique de l’antigène a été promue dans le vagin et l’intestin grêle après l’injection intramusculaire de la nanoémulsion.

Acide rétinoïque encapsulé dans une nanoémulsion cationique en tant qu’adjuvant pour favoriser les réponses systémiques et muqueuses spécifiques de l’OVA

Découvrez le test d'opsono-adhérence pour évaluer les anticorps fonctionnels dans le développement de vaccins contre Bacillus anthracis. Cette méthode sûre remplace les essais traditionnels et se réalise en laboratoire BSL-1 ou BSL-2.

Opsono-Adherence Test pour évaluer les anticorps fonctionnels dans le développement de vaccins contre les anthracis Bacillus et autres pathogènes encapsulés (Vidéo) | JoVE Journal

Opsono-Adherence Test pour évaluer les anticorps fonctionnels dans le développement de vaccins contre les anthracis Bacillus et autres pathogènes encapsulés

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