Name: Un modèle de souris de sarcome de tissus mous incomplètement réséqué pour l’essai (Neo)adjuvant thérapies (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Découvrez un modèle de souris de sarcome des tissus mous avec résection chirurgicale incomplète pour tester les thérapies (néo)adjuvantes. Cette méthode standardisée permet d'évaluer les traitements anticancéreux dans un contexte de guérison postopératoire contrôlée.

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Ce travail est soutenu par des subventions de la Sock it au Sarcome! Fondation, l’Australian and New Zealand Sarcoma Association, la Children’s Leukemia & Cancer Research Foundation et Perpetual Philanthropy. W.J.L est soutenu par une bourse Simon Lee et une bourse de recherche du National Health and Medical Research Council et du Cancer Council WA.

Les animaux utilisés dans ces expériences ont été obtenus auprès du Centre de ressources animales (Perth, Australie-Occidentale). Les animaux ont été maintenus dans des conditions standard exemptes d’agents pathogènes à l’installation du Nord du Harry Perkins Institute of Medical Research (Perth, Australie-Occidentale). Toutes les expériences ont été réalisées suivant le protocole approuvé par le Comité d’éthique animale de l’Institut Harry Perkins. Des souris BALB/c de 8-12 semaines ont été employées dans ces expériences. La lignée cellulaire du fibrosarcome WEHI 164 a été obtenue auprès de CellBank Australia (Westmead, NSW).
1. Inoculation des cellules
<ol><li>Préparation des cellules et des animaux<ol>
<li>Assurez-vous que la ligne de cellule est maintenue dans le support recommandé. Par exemple, maintenir la ligne cellulaire WEHI 164 dans le Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 moyen complété par 2 mM L-glutamine, 10% sérum bovin fœtal, 20 mM HEPES, 0,05 mM 2-mercaptoethanol, 100 U/mL pénicillin, et 100 μg/mL streptomycine. REMARQUE : Cellules de passage au moins 3 et jusqu’à 5 fois après avoir été retirées du stockage cryogénique. Pour assurer une viabilité cellulaire optimale, les cellules doivent être divisées lorsqu’elles sont comprises entre 70 et 80 % de confluentes. Les lignées cellulaires tumorales doivent être testées pour le mycoplasme, car l’infection peut altérer la croissance cellulaire et influencer la réponse immunitaire in vivo.</li>
		<li>Un jour avant l’inoculation, raser les souris sur le flanc inférieur droit à l’aide de tondeuses. REMARQUE : Des souris femelles BALB/c, âgées de 8 à 12 semaines, de poids normal (16 -22 grammes) ont été utilisées dans cette expérience.</li>
		<li>Le jour de l’inoculation, récolter les cellules WEHI 164 lorsque 70-80% confluent par trypsinisation.<ol>
<li>Apirate le milieu de culture des flacons de culture tissulaire, puis ajouter la solution tamponnée de phosphate stérile (1x PBS), pour enlever les traces restantes de sérum bovin foetal (FBS).</li>
			<li>Apirate le PBS des flacons de culture tissulaire. Ajouter 3 ml de trypsine de 0,05 % (pour une fiole T75) puis faire tourbillonner la fiole de sorte que toute la surface de la fiole avec des cellules soit recouverte de trypsine.</li>
			<li>Incuber la fiole à 37 °C, incubateur de CO2 à 5 % pendant 3 min. Vérifiez périodiquement les cellules en tapant sur les côtés de la fiole pour voir si les cellules se sont délogées.</li>
			<li>Retirez les flacons de l’incubateur de culture cellulaire et ajoutez 5 ml de support complété par FBS pour neutraliser la trypsine. REMARQUE : Ne laissez pas les cellules dans la trypsie plus longtemps que nécessaire, car cela peut endommager les cellules et conduire à une faible viabilité cellulaire.</li>
			<li>Suspension pipet plusieurs fois pour obtenir une suspension à cellule unique. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse conique.</li>
			<li>Cellules de granulés en tournant à 350 x g pendant 3 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Laver les cellules trois fois en 1x PBS.<ol>
<li>Resuspender les cellules dans 50 mL de 1x PBS stérile et laver les cellules par la suspension de cellules de canalisation de haut en bas. Cellules de granulés en tournant à 350 x g pendant 3 min.</li>
			<li>Remplacer les cellules supernatantes et resuspend dans 15 mL de 1x PBS stérile. Laver les cellules par la suspension cellulaire de canalisation de haut en bas. Cellules de granulés en tournant à 350 x g pendant 3 min.</li>
			<li>Remplacer les cellules supernatantes et resuspend dans exactement 10 mL de 1x PBS stérile. Laver les cellules à l’étape 1.1.4.2 et transférer une petite quantité (environ 100 μL) de suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse pour le comptage. Cellules de granulés en tournant à 350 x g pendant 3 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Déterminez le numéro de cellule à l’aide de la méthode d’exclusion bleue Trypan à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé. Resuspender les cellules dans 1x PBS stériles à une concentration de 5 x 106 cellules/mL. Gardez la suspension cellulaire sur la glace. NOTE : La viabilité des cellules tumorales devrait être égale ou supérieure à 80 % pour assurer la croissance reproductible de tumeur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inoculation sous-cutanée<ol>
<li>Mélanger soigneusement la suspension cellulaire et remplir une seringue d’une aiguille de 26 G avec 100 μL de suspension cellulaire (5 x 105 cellules) en 1x PBS stérile. Répéter le mélange des cellules avant de charger la seringue suivante. REMARQUE : Gardez les cellules sur la glace tout au long de la procédure pour maintenir leur viabilité.</li>
		<li>Retenez la souris de manière appropriée, assurant l’accès au flanc inférieur droit. Inoculer la souris sous-cutanéement sur le flanc bas droit rasé. REMARQUE : Assurez-vous que l’inoculation n’est pas dans le péritoine en soulevant légèrement l’aiguille, qui doit être visible sous la peau. Une boule de bulle devrait se former sous la peau après l’inoculation.</li>
		<li>Surveiller les souris selon les besoins de l’approbation éthique applicable et effectuer la résection chirurgicale lorsque les tumeurs ont atteint une taille d’environ 50 mm2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Résection chirurgicale partielle de la tumeur
REMARQUE : Ce protocole nécessite DEUX chercheurs; l’un pour les interventions chirurgicales (SURGEON), et l’autre pour la surveillance de la souris (ASSISTANT).
<ol><li>Configuration de la chirurgie<ol>
<li>Le jour 12 après l’inoculation, lorsque les tumeurs ont atteint une taille d’environ 50 mm2, les souris dose avec 100 μL (0,1 mg/kg) de buprénorphine s.c. dans le éraflures du cou, 30 minutes avant la chirurgie.</li>
		<li>Installez la zone chirurgicale avec un coussin chauffant recouvert d’un manteau de banc et installez un cône de nez pour l’anesthésie. Stériliser les outils chirurgicaux avant l’utilisation, et entre chaque animal à l’aide d’un stérilisateur de perles thermiques, permettant aux outils de refroidir avant l’utilisation. Demandez à l’équipement chirurgical suivant de nettoyer et de le toucher : chlorhexidine, écouvillon, gaze, gel pour les yeux, deux forceps incurvés, ciseaux, applicateur de clip, démaquillant, pinces de recharge (Figure 2A, 2B).</li>
		<li>Chauffer la chambre chauffante à 37 °C et mettre en place un autre coussin chauffant pour la récupération (figure 2C). Placez les outils stérilisés sur une surface stérile comme les coussinets autoclaved.</li>
	</ol></li>
	<li>Anesthésie<ol>
<li>Placez la souris dans la chambre d’induction et anesthésiez la souris avec 4% d’isoflurane (4% en oxygène à 100% à un débit de 1 L/min) jusqu’à ce que le taux de respiration ralentisse à environ 60 respirations par minute (1 par seconde) (cela prend habituellement <1 min). REMARQUE : Ne laissez pas la souris dans la chambre trop longtemps, car cela peut entraîner une asphyxie et la mort. N’ont qu’une souris sous anesthésie à la fois.</li>
		<li>Transférer la souris sur le bloc thermique sur la table de chirurgie, placer la souris avec son nez dans le cône de nez et maintenir l’état anesthésique avec 3-4% isoflurane dans 100% d’oxygène à un débit de 0,5 L/min. Surveiller le taux de respiration pour s’assurer que la profondeur de l’anesthésie est maintenue. REMARQUE : L’ASSISTANT doit surveiller la respiration de la souris tout au long de la chirurgie pour s’assurer que le niveau correct d’anesthésie est maintenu. Réduisez la concentration anesthésique si la respiration devient trop lente ou augmentez la concentration si la profondeur de l’anesthésie est trop faible. Si la souris commence à haleter, retirer la souris du cône de nez, diminuer la concentration anesthésique, et attendre jusqu’à ce que la respiration se normalise avant de placer sur le cône de nez à nouveau.</li>
		<li>Effectuez un « test de pincement » et un « test réflexe cornéen »14 pour s’assurer que la souris est entièrement anesthésiée avant de commencer la chirurgie. REMARQUE : Le mouvement de n’importe quelle partie de la souris est une indication que la souris n’est pas entièrement anesthésiée. L’animal doit immédiatement recevoir un anesthésique supplémentaire en augmentant la concentration anesthésique.</li>
		<li>Couvrez les yeux de la souris d’une petite quantité de gel ophtalmique pour éviter la sécheresse oculaire.</li>
	</ol></li>
	<li>Intervention chirurgicale (SURGEON)<ol>
<li>Prélever la zone chirurgicale 3 fois avec la chlorhexidine alcoolique. À l’aide de forceps et d’une paire de ciseaux, faire une incision droite de 1 cm le long du côté dorsal, à 3 mm de la tumeur (Figure 3A, 3B). REMARQUE : La normalisation de l’incision à 1 cm dans chaque souris (à l’aide d’une règle) permet une évaluation uniforme de la cicatrisation des plaies entre souris. Localiser l’incision à 3 mm de la tumeur permet une thérapie adjuvante intratumorale ultérieure sans fuite de la plaie.</li>
		<li>À l’aide de pinces à épiler, retirez la facia et le tissu adipeux sous-cutané entre la tumeur et le péritoine. La tumeur sous-cutanée est normalement attachée au côté de la peau.</li>
		<li>Ouvrez la plaie en tenant doucement la peau sur le côté porteur de la tumeur à l’aide de pinces à épiler, et « nvertir » la tumeur de sorte qu’elle soit visible à l’extérieur (Figure 3C, 3D). NOTE: La section de la tumeur à débulked doit être le plus proche de l’ouverture, d’avoir assez de peau pour fermer la plaie. Veillez à ne pas couper la peau lors de l’ablation de la tumeur.</li>
		<li>À l’aide d’une paire de ciseaux, couper la capsule tumorale de la moitié pour enlever, à partir de la base de la tumeur la plus proche de l’ouverture.</li>
		<li>Pour 50% de chirurgie debulk, couper à travers le milieu de la tumeur. À l’aide de forceps incurvés, ramasser la section de la tumeur à enlever (50%); ramasser tous les restes de la zone débulked.</li>
		<li>Pour 75% debulk, effectuer un débulk de tumeur de 50% comme dans la partie 2.3.5 ci-dessus. Puis couper dans la moitié des 50% restants de la tumeur et ramasser 25% de la tumeur, en utilisant des forceps incurvés comme décrit ci-dessus.</li>
	</ol></li>
	<li>Fermeture du site chirurgical<ol>
<li>Placez la tumeur restante de nouveau sous la peau, et utilisant des forceps, tirez les volets de peau ensemble et alignez la peau le long de la blessure.</li>
		<li>Maintenez la peau ensemble à 5 mm du bord de la plaie et utilisez des pinces chirurgicales pour refermer la plaie, en commençant par le côté le plus proche des forceps. Appliquez autant de clips que nécessaire pour vous assurer qu’aucun tissu sous-jacent n’est exposé. En général, trois à quatre clips sont appliqués avec des écarts de 2 mm entre les clips. REMARQUE : Si des clips ne sont pas bien appliqués, supprimez-le à l’aide d’un dissolvant de clip et remplacez-le par de nouveaux clips.</li>
	</ol></li>
	<li>Récupération de souris (ASSISTANT)<ol>
<li>Permettre aux souris de récupérer en les mettant dans la chambre chauffante (37 °C).</li>
		<li>Placez la cage de la souris sur le bloc de chaleur. Surveillez les souris dans la chambre chauffante jusqu’à ce qu’elles se soient remises de l’anesthésique (éveillée et marchante) puis remettez les souris dans la cage. Laissez la cage sur le coussin chauffant pendant 10 minutes supplémentaires, jusqu’à ce que les souris soient devenues plus actives.</li>
		<li>Donnez aux souris des aliments humides et mous. Surveillez les souris 1 heure après la chirurgie pour la récupération et assurez-vous que les clips restent en place. Assurez-vous que la cage est à moitié sur / la moitié hors de la plate-forme de chaleur pour permettre aux animaux d’auto-réguler la température pendant qu’ils sont sans surveillance.</li>
		<li>Dose de souris avec 0,1 mg/kg de buprénorphine (100 μL sous-cutanéement dans le col), 6-8 heures après la chirurgie (à la fin de la journée). Surveiller les souris tôt le lendemain matin et doser à nouveau les souris avec 0,1 mg/kg de buprénorphine (100 μL sous-cutanéement dans les éraflures du cou). Donnez plus de nourriture humide au besoin.</li>
		<li>Surveillez les souris tous les jours pendant les sept prochains jours. Les clips peuvent être supprimés après sept jours à l’aide du dissolvant de clip.</li>
	</ol></li>
	<li>Traitement adjuvant ou néoadjuvant<ol>
<li>Traiter les souris de façon périopératoire avec une thérapie (néo)adjuvante à tout moment, selon le traitement de l’intérêt.</li>
		<li>Par exemple, traiter les souris avec une dose de 100 μg d’anti-CTLA-4 intrapéritoneally (i.p.) le jour 15 après l’inoculation, ou avec trois doses de 200 μg anti-PD-1 i.p. les jours 15, 17 et 19 après inoculation.</li>
	</ol></li>
	<li>Contrôles expérimentaux<ol>
<li>Lors de l’utilisation de ce modèle pour évaluer les effets de l’inflammation / cicatrisation des plaies, envisager d’utiliser les groupes témoins suivants: 1) Contrôle sans chirurgie (les traitements peuvent encore être administrés intratumoral); 2) Contrôle de chirurgie de sham : Une incision chirurgicale est faite dans la peau ; la tumeur est manipulée et exposée, mais aucun tissu de tumeur n’est enlevé ; la blessure est fermée avec des clips.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Aucune divulgation.

Nous fournissons un protocole pour un modèle de souris de résection chirurgicale incomplète du sarcome de tissu mou pour tester des thérapies péri-opératoires. Nous avons également normalisé l’incision chirurgicale pour permettre l’évaluation de la cicatrisation de blessure entre les souris suivant le traitement.
Le placement de tumeur est une partie importante de ce protocole. Nous avons opté pour un modèle de tumeur sous-cutanée pour permettre un accès chirurgical facile au site de tumeur et...

La chirurgie reste l’option de traitement principale pour de nombreuses tumeurs solides1, y compris le sarcome des tissus mous2,3. Malgré l’amélioration des techniques de chirurgie du cancer, et des combinaisons avec des thérapies (néo)adjuvant, il ya encore un risque élevé de rechute du cancer et de métastases suite à la résection primaire de tumeur4,5. Dans le sarcome des tissus mous, les rechutes se produisent particulièrement locorégionally, au site de la chirurgie, ayant pour résultat la morbidité et la mortalité accrues. Dans le cadre clinique, il peut être difficile d’obtenir des marges suffisamment larges (par exemple, en raison de contraintes anatomiques), ce qui entraîne une résection incomplète et une récurrence tumorale subséquente6. Le stress chirurgical et le processus ultérieur de cicatrisation des plaies sont connus pour créer un microenvironnement de tumeur immunosuppressive favorable à la répétition de tumeur7,8. Par conséquent, la découverte et le développement de nouvelles thérapies pour le sarcome des tissus mous, en particulier les immunothérapies, devraient idéalement tenir compte de la réponse chirurgicale de guérison des plaies.
La plupart des études précliniques pour les thérapies adjuvantes sont initialement effectuées à l’aide de modèles de souris syngénéiques ou xénotransplantes sous-cutanées, sans incorporer le stress chirurgical et la réponse de guérison des plaies9,10. Par conséquent, nous avons développé un modèle syngeneic sous-cutané de sarcome de tissu mou de souris incorporant la résection chirurgicale incomplète. WEHI 164 cellules de fibrosarcome sont inoculés sous-cutanéement, et une fois que les tumeurs sont établies, nous enlevons 50-75% du volume de tumeur (Figure 1A-E). Les tumeurs se repoussent constamment de la tumeur restante. Ce modèle permet de tester des thérapies adjuvantes tout en considérant l’effet du stress chirurgical et de la cicatrisation des plaies. Des modèles chirurgicaux similaires de résection incomplète ont été utilisés dans un certain nombre d’études par plusieurs groupes et se sont avérés reproductibles et efficaces11,12,13. Ici, nous fournissons une description détaillée de ce protocole.

<table><tbody><tr><td>Seringue à insuline de calibre 26 0,5 mL</td><td>Becton Dickinson, Australie</td><td>326769</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>21985023</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Machine à gaz anesthétique</td><td>Darvall Vet, Australie</td><td>SKU : 2848</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Anti-CTLA-4</td><td>BioXcell, États-Unis</td><td>BE0164</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Anti--1</td><td>BioXcell, États-Unis</td><td>BP0273</td><td>Aucun Chlorhydrate</td></tr><tr><td>de buprénorphine injectable, 0,3 mg/mL</td><td>RB healthcare UK Limited, UK</td><td>55175</td><td>Ordonnance</td></tr><tr><td>Chlorhexidine Surgical Scrub 4 %</td><td>Perigo Australia, Australia</td><td>CHL01449F(scrub</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Sérum de bovin fœtal</td><td>CellSera, Australie</td><td>AU-FBS-PG</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Forceps Fine 10,5 cm</td><td>Maison chirurgicale, Australie-Occidentale</td><td>CC74110</td><td>None</td></tr><tr><td>Forceps Fine 12 cm Maison de chirurgie dentelée</td><td>, Australie-Occidentale</td><td>CC74212</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Pince Halsted 14 cm</td><td>Maison de chirurgie, Australie-Occidentale</td><td>CD01114</td><td>None</td></tr><tr><td>Chambre de chauffage</td><td>Datesand Ltd, UK</td><td>Mini-Thermacage</td><td>None</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>None Isoflurane</td><td>Henry Schein Animal Health, Australie</td><td>SKU : 29405</td><td>Ordonnance</td></tr><tr><td>Pommade Oculaire Lubrifiante</td><td>Alcon</td><td>n/a</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine 1000X</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>15140122</td><td>None</td></tr><tr><td>Solution tamponnée au phosphate 10x</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>70013-032</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Reflex 7mm Clips</td><td>Able scientifique, Australie</td><td>AS59038</td><td>None</td></tr><tr><td>Reflex 7mm Wound Clip Applicator</td><td>Able scientific, Australie</td><td>AS59036</td><td>None</td></tr><tr><td>Reflex Wound Clip Remover</td><td>Able scientific, Australie</td><td>AS59037</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Rongeur Qube Anesthésie Circuit de respiration</td><td>Darvall Vet, Australie</td><td>#7885</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Moyen + L-glutamine</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>21870092</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Ciseaux Iris STR 11 cm</td><td>Maison chirurgicale, Australie-Occidentale</td><td>KF3211</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Ciseaux Iris STR 9 cm</td><td>Maison chirurgicale, Australie-Occidentale</td><td>JH4209</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Petite chambre d’induction</td><td>Darvall Vet, Australie</td><td>SKU : 9630</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>TrypLE express 1x</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>12604-021</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Germinator 500 Stérilisateur à billes de verre</td><td>Cellpoint Scientific Inc., États-Unis</td><td>5-1460-DK</td><td></td></tr></tbody></table>

un modèle de souris de sarcome de tissus mous incomplètement réséqué pour l’essai (neo)adjuvant thérapies

A Mouse Model of Incompletely Resected Soft Tissue Sarcoma for Testing (Neo)adjuvant Therapies

La chirurgie est souvent le premier traitement pour de nombreuses tumeurs solides. Cependant, les rechutes locales se produisent fréquemment suivant la résection primaire de tumeur, en dépit des thérapies adjuvantes ou néo-adjuvantes. Ceci se produit lorsque les marges chirurgicales sont insuffisamment sans tumeur, ce qui entraîne des cellules cancéreuses résiduelles. D’un point de vue biologique et immunologique, la chirurgie n’est pas un événement nul; l’environnement de cicatrisation des plaies est connu pour induire des voies pro- et anti-tumorigenic. En conséquence, les modèles précliniques pour le développement de médicaments visant à prévenir la rechute locale devraient intégrer la résection chirurgicale lors de l’essai de nouvelles thérapies (néo)adjuvantes, pour modéliser les paramètres cliniques chez les patients traités par la chirurgie.
Ici, nous décrivons un modèle de souris de résection chirurgicale incomplète du sarcome de tissu mou de WEHI 164 qui permet l’essai des thérapies (néo)adjuvantes dans le arrangement d’une réponse de guérison de blessure. Dans ce modèle, 50% ou 75% de la tumeur est enlevée, laissant derrière elle quelques tissus cancéreux in situ pour modéliser la maladie résiduelle brute après la chirurgie dans le cadre clinique. Ce modèle permet de tester des thérapies dans le contexte de la chirurgie tout en considérant la réponse de guérison des plaies, qui peut affecter l’efficacité des traitements (néo)adjuvants. La résection chirurgicale incomplète résulte dans la repousse reproductible de la tumeur dans toutes les souris en l’absence de thérapie adjuvante. Le traitement adjuvant avec le blocus de point de contrôle a des résultats dans la repousse réduite de tumeur. Ce modèle est donc approprié pour tester des thérapies dans le contexte de la chirurgie de débulking et sa réponse de guérison des plaies associée et peut être étendu à d’autres types de cancer solide.

La croissance tumorale à une taille de 50 mm2 est une taille idéale pour le débulk partiel. La résection chirurgicale incomplète de 50 mm2 tumeurs entraîne une repousse reproductible de 100% (n=5) des tumeurs en l’absence d’immunothérapie adjuvante (Figure 4A). Nous avons ensuite utilisé le modèle pour tester les immunothérapies adjuvantes à l’aide d’anticorps contre les molécules de point de contrôle Cytotoxique T Lymph...

Dans ce protocole, nous décrivons un modèle de souris de résection chirurgicale incomplète du sarcome de tissu mou pour tester (neo)thérapies adjuvantes.

Un modèle de souris de sarcome de tissus mous incomplètement réséqué pour l’essai (Neo)adjuvant thérapies

Surgery is often the first treatment for many solid tumors. However, local relapses frequently occur following primary tumor resection, despite adjuvant ...

Ce protocole vise à imiter le cadre clinique de la maladie résiduelle après la chirurgie de débulking de tumeur, et nous permet donc de tester de nouvelles thérapies de cancer dans le contexte de la guérison postopératoire de blessure. L’avantage de cette technique est qu’elle permet la normalisation de la quantité de blessure infligée et de la quantité de tumeur à rester. Cette technique est particulièrement importante pour les études précliniques dans la mesure où l’identification de nouveaux traitements pour les cancers, qu’il rechute localement un exemple de ce qui est sarcome des tissus mous.Cette démonstration visuelle est essentielle pour démontrer la technique d’inversion, qui nous permet d’exposer la tumeur attachée au côté de la peau. Commencez cette procédure par l’inoculation sous-cutanée des cellules cancéreuses préparées chez la souris, telle que décrite dans le protocole textuel. Le jour 12, après l’inoculation, lorsque les tumeurs ont atteint une taille d’environ 50 millimètres carrés, dosez des souris avec 100 microlitres de buprénorphine sous-cutanée dans le scruff du cou, 30 minutes avant la chirurgie.Installez la zone chirurgicale avec le coussin chauffant recouvert d’un manteau de banc et installez un cône nasal pour l’anesthésie. Disposez de l’équipement chirurgical propre afin qu’ils soient facilement accessibles, y compris la chlorhexadine, l’écouvillon, la gaze, le gel pour les yeux, deux forceps incurvés, des ciseaux, un applicateur de clip, un dissolvant de clip et des recharges de clip. Réchauffez la chambre chauffante à 37 degrés Celsius et installez un autre coussin chauffant pour la récupération.Notez que cette procédure nécessite deux personnes. Un assistant doit surveiller de près la respiration de la souris pendant l’intervention. Après anesthésier la souris telle que décrite dans le protocole de texte, effectuez un test de pincement et un test réflexe cornéen pour s’assurer que la souris est entièrement anesthésiée avant de commencer la chirurgie.Couvrez les yeux de la souris d’une petite quantité de gel ophtalmique pour éviter la sécheresse oculaire. Commencez cette chirurgie en écouvillonnant la zone chirurgicale avec de la chlorhexadine. À l’aide de forceps et d’une paire de ciseaux faire une incision droite d’un centimètre le long du côté dorsale, à trois millimètres de la tumeur.Ne coupez pas la peau directement couvrant la tumeur car elle ne guérira pas bien. Évitez d’utiliser un scalpel pour couper la tumeur et utilisez des pinces à épiler pour ramasser les morceaux. À l’aide d’une pince à épiler, retirer le fascia et les tissus adipeux sous-cutanés entre la tumeur et le péritoine.La tumeur sous-cutanée est normalement attachée au côté de la peau. Ouvrez la plaie en tenant doucement la peau sur le côté porteur de tumeur à l’aide d’une pince à épiler et inverser la tumeur de sorte qu’elle soit visible à l’extérieur. À l’aide d’une paire de ciseaux, couper la capsule tumorale de la moitié pour enlever, à partir de la base de la tumeur la plus proche de l’ouverture.Pour la chirurgie de 50%debulk, coupé à travers le milieu de la tumeur. À l’aide de forceps incurvés ramasser la section de la tumeur à enlever. Ramassez les restes de la zone de débulk.Pour 75% debulk, commencez par effectuer un débulk de tumeur de 50%puis coupez dans la moitié les 50% restants de tumeur. Ramasser 25% de la tumeur à l’aide de forceps incurvés. Pour fermer le site chirurgical, placez le reste de la tumeur sous la peau et à l’aide de forceps, tirez les volets de la peau ensemble et alignez la peau le long de la plaie.Maintenez la peau ensemble à cinq millimètres du bord de la plaie et utilisez des pinces chirurgicales pour fermer la plaie à partir du côté, le plus proche des forceps. Appliquez autant de clips que nécessaire pour vous assurer qu’aucun tissu sous-jacent n’est exposé. En général, trois à quatre clips sont appliqués avec des écarts de deux millimètres entre les clips.Laissez les souris récupérer en les mettant dans la chambre chauffante chaude. Placez la cage de la souris sur le coussin chauffant. Surveillez les souris dans la chambre chauffante jusqu’à ce qu’elles se soient remises de l’anesthésie.Ensuite, remettre les souris dans la cage, laisser la cage sur le coussin chauffant pendant encore 10 minutes jusqu’à ce que les souris soient devenues plus actives. Donnez aux souris des aliments humides et mous. Surveillez les souris une heure après la chirurgie pour la récupération.Surveillez à nouveau les souris à la fin de la journée et le lendemain matin et assurez-vous que les clips restent en place. Traitez les souris de façon périopératoire avec la thérapie de l’avent ou du néoadjuvant à un moment donné, selon le traitement d’intérêt. Traiter, par exemple, les souris avec une dose de 100 microgrammes d’anti-CTLA-4 intraperitoneally le jour 15 après l’inoculation.Alternativement, traitez les souris avec trois doses de 200 microgrammes d’anti-PD-1 intraperitoneally les jours, 15, 17, et 19 après inoculation. La résection chirurgicale incomplète des tumeurs millimétriques carrées de 50, indiquée ici par la ligne pointillée a comme conséquence la repousse 100% reproductible des tumeurs en l’absence de l’immunothérapie adjuvant. Par conséquent, la croissance tumorale à une taille de 50 millimètres carrés est une taille idéale pour le débulk partiel.Le modèle a ensuite été utilisé pour tester les immunothérapies adjuvantes à l’aide d’anticorps contre les modules de point de contrôle, la protéine quatre associée aux lymphocytes T cytotoxiques et le récepteur de la mort programmé. Traitement des souris avec anti-CTLA-4, a abouti à un taux de guérison de 80%Alors que le traitement des souris avec anti-PD-1 a abouti à un taux de guérison de 25%La réponse avec anti-PD-1 fournit une occasion de le tester de nouvelles combinaisons, pour améliorer encore le taux de réponse. Il est important que la tumeur restante reste attachée à la peau, sinon l’approvisionnement en sang sera coupé et la tumeur deviendra nécrotique.Après cette procédure, les tumeurs peuvent être analysées par une variété de méthodes, telles que la cytométrie de flux afin d’évaluer comment la chirurgie affecte les cellules d’infiltration tumorale. Ce modèle de souris nous a permis d’explorer comment la cicatrisation des plaies influe sur les immunothérapies cancéreuses.

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