Perfusion et stimulation combinées avec voltampérométrie cyclique à balayage rapide (CIS-FSCV) pour évaluer la régulation du récepteur de la zone tegmentale ventrale de la dopamine phasique

Cette approche peut aider à élucider le rôle d’une aire tegmentale ventrale spécifique, des récepteurs somatodendritiques et de la libération de dopamine phasique dans le noyau accumbens. Le principal avantage de cette approche est que les questions sur le contrôle de la fonction des récepteurs sur la libération de dopamine phasique peuvent être abordées dans le cerveau intact. L’optimisation de l’emplacement de la microélectrode en fibre de carbone et du stimulateur bipolaire peut être difficile, et un conseil pour les débutants est de commencer à enregistrer dans le striatum dorsal.

En raison de l’utilisation et de la manipulation de plusieurs types d’électrodes, y compris les électrodes d’enregistrement, de référence et de stimulation, un guide visuel du moment et de l’endroit où ces électrodes sont implantées sera utile. Après avoir confirmé une absence de réponse au réflexe de pédale, nettoyez le cuir chevelu d’un rat anesthésié avec trois gommages séquentiels à l’iodopovidone et à l’éthanol à 70 %. Après le dernier gommage, utilisez une pince à épiler à bec aiguille stérilisée et des ciseaux chirurgicaux pour couper suffisamment de tissu du cuir chevelu pour faire de la place pour les électrodes implantées.

Nettoyez délicatement la surface exposée du crâne à l’aide d’applicateurs en coton stérilisé avant d’appliquer deux à trois gouttes de peroxyde d’hydrogène à 3 % pour aider à identifier le lambda et le bregma. Ensuite, utilisez un foret d’un millimètre réglé sur environ 20 000 tours par minute pour faire un trou de 1,5 millimètre de diamètre, 2,5 millimètres à l’avant et 3,5 millimètres latéralement à la bregma. Implantez une vis de 1,59 millimètre de diamètre extérieur et de 3,2 millimètres de long à mi-chemin dans le trou jusqu’à ce que la vis soit fermement en place.

Ensuite, percez un trou d’électrode de référence d’un millimètre de diamètre dans l’hémisphère gauche, 1,5 millimètre en avant et 3,5 millimètres latéralement au bregma. Insérez environ deux millimètres de fil de référence dans le trou tout en enroulant le fil autour et sous la tête de la vis implantée. Ensuite, implantez complètement la vis, en épinglant l’électrode de référence en place.

Dans l’hémisphère droit, percez un trou de 1,5 millimètre de diamètre, 1,2 millimètre en avant et 1,4 millimètre latéralement par rapport au bregma, et utilisez une pince à épiler pour retirer soigneusement la dure-mère. Pour l’électrode de stimulation, percez un trou carré de deux millimètres avant-postérieur et de cinq millimètres médio-latéral centré à 5,2 millimètres en arrière et à un millimètre latéralement du bregma. À l’aide de barres de bras stéréotaxiques, abaissez la canule guide de l’électrode de stimulation bipolaire à cinq millimètres sous la dure-mère.

À l’aide des barres de bras stéréotaxiques, abaissez la microélectrode en fibre de carbone à quatre millimètres sous la dure-mère au niveau de la partie la plus dorsale du striatum et connectez le fil de référence et la fibre de carbone à un potentiostat. Appliquez ensuite une forme d’onde triangulaire de moins 0,4 à 1,4 volt, 400 volts par seconde pendant 15 minutes à 60 Hertz, suivie d’un stimulus de 10 minutes à 10 Hertz. Pour optimiser l’emplacement de l’électrode de stimulation, réglez le stimulateur pour qu’il produise une forme d’onde électrique bipolaire avec une fréquence de 60 Hertz, 24 impulsions, un courant de 300 microampères et une largeur d’impulsion de deux millisecondes par phase.

Abaissez doucement le stimulateur par incréments de 0,2 millimètre de 5 à 7,8 millimètres sous la dure-mère, en stimulant le VTA à chaque incrément. Continuez à abaisser la canule guide de l’électrode bipolaire jusqu’à ce qu’une stimulation produise une libération de dopamine phasique au niveau de la microélectrode en fibre de carbone dans le striatum dorsal. Une fois qu’une libération de dopamine a été observée, abaissez la microélectrode en fibre de carbone jusqu’à ce qu’elle soit à au moins six millimètres sous la dure-mère dans la partie la plus dorsale du noyau du noyau accumbens.

Lorsque l’électrode est en position, stimulez le VTA et enregistrez l’amplitude maximale du pic de dopamine, puis abaissez ou élevez la microélectrode en fibre de carbone jusqu’au site qui produit la plus grande libération de dopamine, en vous assurant que le pic de la réponse dopaminergique est représenté par un pic d’oxydation clair à 0,6 volt et un pic de réduction à moins 0,2 volts. Une fois que l’emplacement de la canule guide en fibre de carbone et en électrodes stimulantes a été optimisé, stimulez l’animal toutes les trois minutes pendant 20 à 30 minutes. Après avoir obtenu une ligne de base stable, abaissez doucement la canule interne à la main dans la canule guide pré-installée dans le stimulateur bipolaire et obtenez deux à trois enregistrements de base supplémentaires pour confirmer que l’insertion de la canule n’a pas provoqué de changement dans le signal évoqué.

Une fois qu’une réponse de base a été établie, utilisez un pousse-seringue et une microseringue pour injecter 0,5 microlitre de la solution médicamenteuse d’intérêt dans l’ATV sur une période de deux minutes. Après la perfusion, laissez la canule interne en place pendant au moins une minute avant de la retirer, en continuant à enregistrer la réponse toutes les trois minutes pour mesurer les effets post-perfusion. Comme le démontrent ces graphiques de couleurs représentatifs, la perfusion saline n’altère pas la libération de dopamine phasique stimulée.

La perfusion de NMDA produit une augmentation robuste de la libération de dopamine phasique stimulée, tandis que l’antagoniste compétitif du récepteur NMDA, AP5, produit une diminution robuste. La mécamylamine, antagoniste non compétitif des récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine, et la scopolamine, antagoniste non sélectif des récepteurs de l’acétylcholine muscarinique, produisent une diminution robuste de la libération stimulée de dopamine phasique. Dans ce graphique, on peut observer un résumé des effets des médicaments testés au fil du temps.

La canule d’infusion doit être soigneusement insérée dans l’électrode de stimulation bipolaire. Sinon, des dommages excessifs peuvent survenir, entraînant des changements artificiels dans la libération de dopamine phasique. Cette approche a permis aux chercheurs d’aborder plus finement les mécanismes récepteurs spécifiques par lesquels la libération de dopamine phasique est régulée in vivo.