Name: Micropatterning simple lithographie-libre à cellule unique à l’aide de stencils laser-cut (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Découvrez une méthode de micropatterning sans lithographie utilisant des pochoirs laser réutilisables pour moduler la morphologie cellulaire. Cette technique accessible permet le criblage à haut débit et l'étude de la mécanotransduction.

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Ce travail a été soutenu par une bourse postdoctorale du Stanford Child Health Research Institute (CHRI) et du National Institute of Health (1F32HL142205-01) à S.L, le NIH Office of Director’s Pioneer Award (LM012179-03), l’American Heart Association Established Investigator Award (17EIA33410923), le Stanford Cardiovascular Institute, la Hoffmann and Schroepfer Foundation et la Stanford Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine to S.M.W , prix de l’Institut national de la santé (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) et Tobacco-related Disease Research Program (TRDRP 27IR-0012) à J.C.W, l’American Heart Association (AHA) Postdoctoral Fellowship Award (18POST340106) à H.Y, et la bourse Hengstberger à T.S. Nous remercions le Dr Andrew Olsen du Stanford Neuroscience Microscopy Service pour le soutien de l’imagerie confocienne du hiPSC-CM micropatternisé. Nous remercions H.Y. pour la première conception de pochoir, fabrication, micropatterning à cellule unique d’iPSC-CM sur le coverlip enrobé d’hydrogel de polyacrylamide, et l’imagerie confocale préliminaire de la structure de sarcomere des iPSC-CM micropatterned à cellule unique.

1. Fabrication de pochoirs à base de polyimide à motif négatif
<ol><li>Générer un modèle (figure 2A) en format .dxf à l’aide d’un logiciel de conception assisté par ordinateur (p. ex., AutoCAD, SolidWorks, Onshape, Adobe Illustrator).<ol>
<li>Générer un cercle (diamètre de 22 mm) pour délimiter la bordure du pochoir.</li>
		<li>Dessinez une forme solide ou le motif désiré.</li>
		<li>Inclure une lettre chiral (p. ex., R) pour marquer le côté avant des pochoirs. REMARQUE : À titre d’exemple, un éventail de carrés et de rectangles est généré pour modeler les iPSC-CM aux niveaux d’une seule cellule et de paire cellulaire. Les fichiers de conception sont disponibles (voir Fichiers supplémentaires). La limite de résolution de microfabrication est de 10 m.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Soumettez la conception à une société de microfabrication à des films en polyimide découpés au laser et à la fabrication de pochoirs(figure 2B,C).</li>
</ol>2. Préparation des aliquots sulfo-SANPAH
REMARQUE : Le protocole est modifié à partir de Fischer et coll.11.
<ol><li>Utilisez une boîte de rangement d’échantillons de carton résistante à l’humidité (p. ex., 100 puits, 10 x 10 espaces pour les tubes à centrifugeuses, dimensions : 13,4 cm x 13,4 cm x 5,1 cm). Étiquetez-le « nom/date/sulfo-SANPAH 40 L/reconstitué avec 1 200 L de PBS ».</li>
	<li>Étiqueter 50 tubes de microcentrifuge (polypropylène, 1,5 ml) avec un «S» sur le couvercle.</li>
	<li>Prenez 4 ml de sulfoxide de diméthyle anhydre et extra sec (DMSO) et filtrer stérile la solution à l’aide d’une unité de filtre à membrane (taille de pore à 0,22 m) dans un tube conique stérile de 15 ml.</li>
	<li>Préparer un bain d’azote liquide et couvrir avec le couvercle pour minimiser l’évaporation de l’azote liquide.</li>
	<li>Dissoudre 50 mg de sulfo-SANPAH dans 2 ml du DMSO filtré.</li>
	<li>Vortex bien pour dissoudre complètement le sulfo-SANPAH dans le DMSO.</li>
	<li>Distribuez des aliquots de 40 L de la solution sulfo-SANPAH dans des tubes stériles de 1,5 mL.</li>
	<li>Transférer les tubes dans la boîte.</li>
	<li>Geler flash les tubes dans de l’azote liquide pendant 5 min.</li>
	<li>Rangez les aliquots à -80 oC. REMARQUE : Les aliquots peuvent être utilisés jusqu’à 6 mois sans efficacité diminuée. La concentration de sulfo-SANPAH de stock est de 25 mg/mL ou 50,77 mM.</li>
</ol>3. Stérilisation des outils
<ol><li>Autoclavez deux forceps, 24 housses en verre (22 x 22 mm, no 1 ou no 1.5), une lame de rasoir et trois lingettes absorbantes sans peluche. REMARQUE : Pour faire 12 constructions d’hydrogel, 24 couvertures en verre sont nécessaires. Il devrait y avoir deux reprises par construction. Il est conseillé de préparer des coverlips de rechange.</li>
	<li>Placer deux morceaux de film de paraffine (4 x 4 pouces) dans une boîte en plastique résistante à l’éthanol (p. ex., une boîte à pipette de 1 000 l) et les stériliser dans de l’éthanol frais de 70 % pendant au moins 15 minutes.</li>
</ol>4. Préparation de la solution précurseur de l’hydrogel en polyacrylamide
REMARQUE : Le protocole est modifié à partir de Lee et coll.12.
<ol><li>Dissoudre 125 mg de méthacrylate aminoéthyl (AEM) dans 36,25 ml d’eau déionisée dans un tube de centrifugeuse en polypropylène de 50 mL par vortexing.</li>
	<li>Pour préparer 50 ml de solution précurseur en polyacrylamide de 10 kPa (8 à 0,15 à 15 mM), mélanger 10 ml de solution d’acrylamide de 40 %, 3,75 mL de solution bis-acrylamide de 2 % et 36,25 ml de la solution AEM préparée à l’étape 4.1 dans un nouveau tube de centrifugeuse en polypropylène de 50 mL. REMARQUE : La concentration finale de la solution précurseur est de 8 % d’acrylamide, de 0,15 % de bis-acrylamide et de 15 mM AEM, qui a été mesurée pour avoir une rigidité de 10 kPa par microscopie de force atomique. Selon les applications tissulaires d’intérêt, la rigidité de l’hydrogel peut être modifiée en changeant le rapport de l’acrylamide de 40% à la solution de 2% bis-acrylamide. Par exemple, 8 % d’acrylamide à 0,08 % de solution bis-acrylamide donne 3 kPa hydrogels; 8 % d’acrylamide à 0,48 % de solution bis-acrylamide donne 38 kPa hydrogels; 8% d’acrylamide à 0,48% de solution bis-acrylamide donne 60 kPa hydrogels. Il est conseillé de confirmer la rigidité des hydrogels fabriqués à partir des solutions précurseurs avec des rapports modifiés.</li>
</ol>5. Préparation de la solution photoinitiator
<ol><li>Pour 1 mL de solution de photoinitiator de 5 %, dissoudre d’abord 50 mg de 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-poudre de méthylpropiophenone dans 700 L d’éthanol de 100% dans un tube de centrifugeuse en polypropylène de 1,5 mL avec couvercle. REMARQUE : 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone n’est pas soluble dans l’eau. Assurez-vous de dissoudre complètement la poudre dans l’éthanol en vortexing.</li>
	<li>Après avoir complètement dissous le 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone en éthanol par vortexing, ajouter 300 l de saline tamponnée de phosphate (PBS) pour un volume final de 1 mL. REMARQUE : La concentration finale de la solution 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone est de 5%. La solution de photoinitiator déjouée de 5% est bonne pendant 4 semaines à 4 oC.</li>
</ol>6. Préparation de la solution de protéine de matrice de membrane de sous-sol
REMARQUE : La matrice de membrane de sous-sol(tableau des matériaux) est un matériau sensible à la température. Assurez-vous de travailler sur la glace avec des pointes et des tubes de pipette réfrigérés ainsi que des solutions glacées. Un nouveau stock de matrice de membrane de sous-sol devrait être décongelé lentement sur la glace à 4 oC pendant la nuit.
<ol><li>Préparer 200 L de solution de protéine de matrice de membrane de sous-sol par construction d’hydrogel. Pour 12 constructions, 2,4 ml de solution de protéine de matrice de membrane de sous-sol sont nécessaires. Préparer une solution supplémentaire de 10 % (p. ex., 2,6 ml).</li>
	<li>Pour chaque nouveau lot /lot de solution de protéine de matrice de membrane de sous-sol, optimisez le rapport de dilution. Pour la première fois, testez des rapports de dilution de 1:10, 1:20, 1:40 pour trouver le rapport de dilution qui donne les meilleures qualités pour le modelage cellulaire. REMARQUE : Si la solution de protéine de matrice de membrane de sous-sol est trop visqueuse, elle formera un gel au-dessus du pochoir, et elle est plus susceptible de décoller enlevant le pochoir. Si la solution protéique est trop fluide, elle pénétrera à travers les trous de motif des pochoirs, ce qui se traduira par un mauvais modelage de qualité.</li>
	<li>Diluer la solution de stock de protéines de matrice de membrane du sous-sol sur la glace avec le milieu modifié de du mélange d’aigles modifiés F-12 (DMEM/F12) de Dulbecco à la glace au rapport de dilution optimisé ci-dessus. Par exemple, diluer 120 l’un de la solution de stock dans 2,4 ml de support DMEM/F12 (1:20) et garder sur la glace pour une utilisation ultérieure.</li>
</ol>7. Fabrication d’Hydrogel
<ol><li>Placer une lampe de banc UV (365 nm, 4 mW/cm2) dans une hotte biologique de sécurité.</li>
	<li>Placez les films de paraffine stérilisés de l’étape 3.2 et séchez complètement dans des conditions stériles. Si les films de paraffine ne sont pas complètement secs, utilisez un système d’aspiration sous vide pour éliminer tout liquide résiduel. Placez six reprises autoclaved de l’étape 3.1 sur chaque film de paraffine à l’aide des forceps autoclaved.</li>
	<li>Préparer la solution précurseur en polyacrylamide UV-crosslinkable en diluer la solution de photoinitiator de 5 % (étape 5.2) avec la solution précurseur en polyacrylamide (étape 4.2) dans un tube de centrifugeuse en polypropylène de 50 mL. Pour 5 ml de solution précurseur en polyacrylamide transversal UV, ajoutez 50 L de solution de photoinitiator à 5 mL de solution précurseur de polyacrylamide.</li>
	<li>Filtrer la solution précurseur à partir de l’étape 7.3 à l’aide d’une unité de filtre de 50 ml avec une taille de pore de 0,22 m pour la stérilisation. REMARQUE : Préparez toujours une solution de précurseurs frais.</li>
	<li>Dispensez 200 L de solution précurseur en polyacrylamide de l’étape 7.4 sur chaque glissière en verre de 22 x 22 mm dans le plat De Petri filmé paraffine et couvrez soigneusement avec un autre couvre-verre de 22 x 22 mm sur le dessus pour sandwich la solution entre les deux (figure 3A). REMARQUE : Le film de paraffine est utilisé pour éviter les déversements et pour confiner la solution précurseur entre les reprises.</li>
	<li>Placez le plat Petri contenant des housses de l’étape 7.5 sous la lampe de banc UV et photopolymerize les hydrogels en polyacrylamide pendant 5 min(figure 3B). REMARQUE : Si la surface n’est pas blanche, l’absorption UV de la surface réduit l’efficacité du photocrosslinking. La couverture du livre blanc sur la surface non blanche est importante pour minimiser la perte d’intensité UV. Pour se protéger contre les rayons UV, recouvrir la lampe de papier d’aluminium et portez des lunettes de protection UV.</li>
	<li>Détachez soigneusement une couverture glisser de l’autre à l’aide d’une lame de rasoir par action de levier(figure 3C). REMARQUE : L’hydrogel s’en tiendra habituellement au coverlip supérieur. Faites attention supplémentaire lorsque vous détachez le coverlip de l’hydrogel mou, car il est susceptible de se briser.</li>
	<li>Remplissez un réservoir jetable de polypropylène avec PBS. Transférer les composites hydrogel-coverslip dans un réservoir contenant des PBS pour rincer les hydrogels dans PBS pendant 5 min. Après le rinçage, placez la construction d’hydrogel sur le film de paraffine dans le plat Petri.</li>
</ol>8. Conjugaison de protéines
<ol><li>Préparer un seau à glace et un précool PBS. REMARQUE : Pour six hydrogels, 1 200 L de PBS froid sont nécessaires.</li>
	<li>Sortez l’aliquot sulfo-SANPAH (1 flacon et 6 gels). REMARQUE : Si nécessaire, la quantité de sulfo-SANPAH utilisée peut être réduite après optimisation.</li>
	<li>Ajouter 1 200 l de PBS froid dans une fiole d’aliquot sulfo-SANPAH et mélanger en tuyautant de haut en bas.</li>
	<li>Dispensez 200 L de sulfo-SANPAH sur le film de paraffine dans le plat Petri et couvrez-le de l’hydrogel-coverslip composite avec hydrogel contactant sulfo-SANPAH (figure 3D). REMARQUE : Le sulfo-SANPAH est très sensible à l’eau en raison de l’hydrolyse. Dégelez fraîchement à partir de -80 oC juste avant l’utilisation. Ne réutilisez pas ou ne recongelez pas les restes.</li>
	<li>Exposez l’hydrogel à la lampe UV à 365 nm, 4 mW/cm2 pendant 5 min pour activer le sulfo-SANPAH. REMARQUE : Après exposition, le sulfo-SANPAH passera de l’orange au brun(figure 3E). Si l’hydrogel devient brun, il indique l’activation réussie du groupe d’azide de phényl de sulfo-SANPAH et l’incorporation de sulfo-SANPAH sur l’hydrogel. Procédez directement aux étapes 8.6-8.9 dans un maximum de 10 min, parce que l’activité du sulfo-SANPAH diminuera.</li>
	<li>Réapprovisionnez un réservoir de polypropylène jetable avec un PBS frais. Après l’activation de sulfo-SANPAH, transférer les hydrogels activés et rincer rapidement les hydrogels dans un réservoir PBS pour enlever le sulfo-SANPAH non lié. REMARQUE : Un long lavage peut entraîner une faible efficacité de conjugaison en protéines.</li>
	<li>Après un rinçage rapide, placez les housses hydrogel-attachées sur le film de paraffine dans les plats De Petri et tamponnez soigneusement les hydrogels avec des lingettes stériles sans peluches. REMARQUE : Le PBS restant au-dessus de l’hydrogel entraînera une fuite de la solution de protéine de matrice de membrane de sous-sol par le pochoir, et le séchage trop largement mènera à la rupture de l’hydrogel à l’enlèvement du pochoir en raison de l’adhésion trop élevée au pochoir.</li>
	<li>Placez le pochoir sur les hydrogels et tamponnez avec des lingettes autoclavées sans peluche pour assurer l’étanchéité serrée entre le pochoir et l’hydrogel(figure 3F).</li>
	<li>Distribuez soigneusement 200 L de la solution diluée de protéine de matrice de membrane de sous-sol préparée à partir de l’étape 6.3(figure 3G) sur le dessus. Laissez toute la nuit dans l’incubateur (37 oC). REMARQUE : Lorsque le contact pochoir-hydrogel est serré et que la concentration de la solution de protéine de matrice de membrane du sous-sol est optimale, la solution de protéine de matrice de membrane de sous-sol sera séquestrée et restera au-dessus du pochoir(figure 3H). Le temps d’incubation peut être réduit lors de l’optimisation. Théoriquement, il peut être réduit à 30 min-2 h.</li>
	<li>Le lendemain, transférer les hydrogels dans une plaque de 6 puits et les immerger pleinement dans PBS. REMARQUE : Il est recommandé de décoller le pochoir avec l’immersion PBS sur le coverlip pour empêcher la déchirure et le collage de l’hydrogel au pochoir.</li>
	<li>Retirez soigneusement le pochoir à l’aide de pinces autoclavées sans déchirer l’hydrogel. Bien s’occuper du DMEM, remettre les hydrogels à motifs à l’incubateur et les laisser toute nuit pour vérifier toute contamination.</li>
	<li>Si les médias restent clairs, les hydrogels sont prêts à être utilisés pour le placage cellulaire. Optimiser la densité de placage cellulaire et le temps d’incubation pour permettre l’adhérence des cellules pour des applications respectives. REMARQUE : Pour le modèle à cellule unique des sm-CPS, semences et incubations pendant la nuit. Les numéros cellulaires suivants sont recommandés pour l’ensemencement : 30 000, 60 000 et 90 000 cellules/puits. L’ensemencement de trop de cellules conduit à plus d’une cellule par modèle. Une passoire cellulaire est recommandée pour filtrer les cellules non simples avant l’ensemencement cellulaire.</li>
	<li>Le lendemain, observez l’attachement et la propagation des cellules, et modifiez les médias pour se débarrasser des cellules détachées.</li>
</ol>9. Nettoyage des pochoirs usagés
<ol><li>Pour éliminer les protéines de matrice résiduelle sur les pochoirs usagés, submergez les pochoirs en solution enzymatique(Tableau des matériaux) pendant 10 min à 37 oC. REMARQUE : L’enzyme doit être sélectionnée en fonction des protéines de matrice utilisées. Pour la solution de protéines de matrice riche en collagène, utilisez le collagène. Un ultrasonication de 10 à 15 min dans la solution enzymatique est également recommandé.</li>
	<li>Aspirer la solution et le reconstituer avec 10% d’eau de Javel. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante.</li>
	<li>Rincer 3x avec PBS.</li>
	<li>Conserver dans 70% d’éthanol à 4 oC jusqu’à utilisation.</li>
</ol>

<ol><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+Defined+and+Small+Molecule-Based+Generation+of+Human+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
<li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+of+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells%3A+From+Clinical+Trial+in+a+Dish+to+Precision+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine.</a> Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li>
<li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractility+of+single+cardiomyocytes+differentiated+from+pluripotent+stem+cells+depends+on+physiological+shape+and+substrate+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).</li>
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<li>Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+by+microcontact+printing+of+self-assembled+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers.</a> Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).</li>
<li>Théry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).</li>
<li>Toepke, M. W., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+absorption+of+small+molecules+and+consequences+in+microfluidic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).</li>
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<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+PDGF+pathway+links+LMNA+mutation+to+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy.</a> Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).</li>
<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+diastolic+dysfunction+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+from+hypertrophic+cardiomyopathy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients.</a> European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).</li>
<li>Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiffness-controlled+three-dimensional+extracellular+matrices+for+high-resolution+imaging+of+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior.</a> Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).</li>
<li>Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+with+enhanced+protein+conjugation+efficiency+reveal+stiffness-induced+YAP+localization+in+stem+cells+depends+on+biochemical+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues.</a> Biomaterials. 202, 26-34 (2019).</li>
<li>Théry, M., Pépin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+distribution+of+stress+fibres+in+response+to+the+geometry+of+the+adhesive+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility%22%5BJournal%5D)">Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment.</a> Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).</li>
<li>Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+cues+for+directing+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous décrivons une méthode de micropatterning sans sténographie qui permet un modelage efficace des cellules adhérentes. Dans ce protocole, nous démontrons le modelage des hiPSC-CMs dans différents rapports longueur-largeur par micropatterning îles de protéine de matrice de membrane de sous-sol sur des hydrogels polyacrylamide avec des rigidités physiologiques ou pathologiquement pertinentes de tissu ou des substrats d’élastomère à base de silicium. Cette méthode est relativement simple et très accessible à tous les cher...

L’avènement des hiPSC et le développement ultérieur de protocoles pour leur différenciation dirigée dans différents types de cellules ont permis d’étudier le développement et la maladie à un niveau moléculaire et spécifique au patient, en utilisant spécifiquement les cardiomyocytes iPSC dérivés du patient (iPSC-CMs) pour modéliser les cardiomyopathies1,2. Cependant, l’absence d’un microenvironnement structuré est une limitation majeure de l’étude du développement et de la physiologie à l’aide du système iPSC et d’autres modèles in vitro. In situ, les cellules sont soumises aux contraintes de la matrice extracellulaire (ECM), ainsi que des cellules voisines. La composition biochimique particulière et la rigidité de ces microenvironnements dictent la distribution spatiale des cellules aussi bien que les facteurs disponibles pour s’engager dans l’adhérence cellulaire. Ceci, à son tour, influence les voies de signalisation intracellulaires, l’expression des gènes, et la détermination du destin cellulaire. Par exemple, l’iPSC-CM micropatterned dans une forme adulte-comme la tige a une capacité contractile significativement meilleure, le flux de calcium, l’organisation mitochondriale, l’électrophysiologie, et la formation de transverse-tubule3. Ainsi, les propriétés du microenvironnement font partie intégrante de la régulation des fonctions cellulaires.
Les techniques précédentes de micropatterning reposaient fortement sur la photolithographie(figure 1A). Dans cette technique, une couche de polymère photosensible, ou photorésist, est filée sur un substrat plat de la solution pour former un film mince d’environ 1 m d’épaisseur. Ensuite, la lumière ultraviolette (UV) est appliquée sur le photorésist à l’adresse à l’intermédiaire d’un masque contenant le motif désiré. L’exposition à la lumière ultraviolette (UV) modifie chimiquement le photorésist en modifiant sa solubilité dans sa solution de développement respective, transférant le motif désiré du masque sur le substrat. De nombreuses méthodes de micropatterning intègrent la photolithographie, car elle confère le nanomètre au contrôle au niveau micromètre sur la conception des modèles cellulaires. Cependant, la rotation du photorésist est très sensible aux impuretés, parce que les plus petites particules de poussière perturberont la propagation de la solution dans un film mince. La photolithographie doit donc être effectuée dans des installations non contaminées, qui sont coûteuses à entretenir et nécessitent une expertise particulière à utiliser. En outre, les produits chimiques utilisés dans la photolithographie sont souvent toxiques pour les cellules et peuvent dénaturer des biomolécules importantes. Ainsi, la photolithographie pose des obstacles importants à la fabrication de micropatternes pour des applications biologiques pratiques.
En 1994, Whitesides et ses collègues4 ont surmonté certains des défis associés à la photolithographie en mettant en avant une collection de techniques appelées lithographie douce. Dans la lithographie douce, une surface microstructurée à base de polydimethylsiloxane (PDMS), un matériau transparent ressemblant à du caoutchouc, est utilisée pour générer un modèle de protéines ECM4. Les techniques lithographiques douces courantes comprennent l’impression de microcontacts et le modelage microfluidique. Dans l’impression microcontactique, actuellement la méthode lithographique douce la plus populaire, un timbre PDMS recouvert de protéines ECM transfère le matériau sur une surface des zones contactées par le timbre(figure 1B). Dans le modelage microfluidique, les microstructures sont conçues sur une surface PDMS de telle sorte que lorsque le timbre est pressé sur un substrat, un réseau de microcanaux, par lequel les fluides peuvent être livrés aux zones désirées, est créé (figure 1C)5. La lithographie douce offre plusieurs avantages sur la photolithographie. Une fois qu’une plaquette de maître est microfabriquée, les timbres PDMS peuvent facilement être reproduits sans autre emploi d’installations de salle blanche. En outre, l’absence de solvants organiques dans le processus de lithographie douce permet l’utilisation de matériaux polymériques tels que le polystyrène, généralement utilisé dans la culture cellulaire. Enfin, le micropatterning utilisant des méthodes lithographiques douces n’est pas limité aux surfaces plates. Ainsi, la lithographie douce augmente l’accessibilité et la fonctionnalité de la fabrication de micropatternes par rapport à la photolithographie6. Cependant, la lithographie douce a des inconvénients significatifs. Par exemple, une première étape de gravure, à l’aide de la photolithographie, est toujours nécessaire pour microfabriquer le timbre. En outre, le micropatterning à l’aide d’un timbre PDMS est sujet à des variations dans la qualité du transfert de protéines sur le substrat6. Éviter ces écarts nécessite une optimisation et une cohérence de la pression exercée sur le timbre PDMS lors du transfert de protéines, sinon la déformation et la distorsion des tailles de fonctionnalités des moules PDMS peuvent se produire6. Il ya aussi une préoccupation majeure de l’utilisation répétée de la PDMS en raison de l’absorption de petites molécules7.
Pour éviter d’utiliser la photolithographie douce et les timbres PDMS, nous décrivons une méthode de micropatterning à cellule unique sans lithographie au pochoir qui surmonte bon nombre des obstacles associés à la photolithographie et à la lithographie douce. Dans cette méthode, un hydrogel en polyacrylamide est utilisé comme substrat pour l’incorporation de protéines ECM à base de pochoir, permettant un placage sélectif de hiPSC-CMs simples. Cette technique est hautement compatible avec les matériaux polymères utilisés dans des conditions de culture cellulaire classique. En outre, avec un nettoyage et un entretien adéquats, les pochoirs sont réutilisables et résistants à la dégradation et à l’absorption des protéines pendant le processus de microfabrication. Enfin, le processus de modelage est techniquement robuste, peu coûteux, personnalisable et accessible à ceux qui n’ont pas de compétences spécialisées en bioingénierie. Cette technique de micropatterning à base de pochoir a été largement utilisée dans nos publications récentes modélisant des cardiomyopathies variées8,9,10.

<table><tbody><tr><td>Chlorhydrate de méthacrylate de 2-aminoéthyle (poudre)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516155</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’acrylamide 40 % (solution)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-4058-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Lampe UV de banc 365 nm</td><td>UVP</td><td>UVP 95-0042-07, XX-15L</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture BioFlex</td><td>FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC</td><td></td><td>Plaque à 6 puits avec substrat en élastomère de silicium</td></tr><tr><td>Solution de bis-acrylamide à 2 % (solution)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1533-25mL</td><td></td></tr><tr><td>Lunettes de protection Corning carrées, n° 2, W & fois ; L 22 mm & temps ; 22 mm</td><td>Sigma</td><td>CLS285522</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure (2-Hydroxy-4&prime ;-(2-hydroxyéthoxy)-2-méthylpropiophénone) (poudre)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>410896</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>solution protéique de matrice membranaire basale</td></tr><tr><td>Méthyl sulfoxyde, 99.7+ %, Extra Dry, AcroSeal, ACROS</td><td>Organics Acros Organics</td><td>326881000</td><td></td></tr><tr><td>Millex (13mm) filter unité avec membrane Durapore</td><td>Millipore</td><td>SLGV013SL</td><td></td></tr><tr><td>Millipore 50mL Steriflip (0,22 &micro ; m)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Pochoirs Potomac</td><td></td><td>conception</td><td></td>personnalisée</tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select 10x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1217702</td><td>Enzyme utilisée pour le nettoyage au pochoir</td></tr></tbody></table>

micropatterning simple lithographie-libre à cellule unique à l’aide de stencils laser-cut

Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils

Les techniques de micropatterning ont été largement utilisées dans la biologie cellulaire pour étudier les effets du contrôle de la forme et de la taille des cellules sur la détermination du destin cellulaire à la résolution d’une seule cellule. Les techniques actuelles de micropatterning à cellules uniques à la fine pointe de la technologie impliquent une lithographie douce et une impression micro-contact, qui est une technologie puissante, mais qui nécessite des compétences techniques de formation et un certain soutien aux installations en microfabrication. Ces limitations nécessitent une technique plus accessible. Ici, nous décrivons une méthode alternative simple sans lithographie : le modelage à cellule unique à base de pochoir. Nous fournissons des procédures étape par étape, y compris la conception de pochoir, la fabrication d’hydrogel de polyacrylamide, l’incorporation de protéine à base de pochoir, et le placage et la culture de cellules. Cette méthode simple peut être utilisée pour modeler un tableau de 2 000 cellules. Nous démontrons le modelage des cardiomyocytes dérivés des cellules souches pluripotentes induites par l’homme simple (hiPSC) avec des formes cellulaires distinctes, d’un carré de 1:1 à un rectangle adulte cardiomyocyte-like. Ce modèle à cellule unique à base de pochoir est sans lithographie, techniquement robuste, pratique, peu coûteux, et surtout accessible à ceux qui ont un fond limité de bioingénierie.

La fabrication de pochoirs contenant un tableau de carrés ou de rectangles a été démontrée(figure 4A). À la suite de ce protocole, nous avons obtenu des îles protéinées à matrice à motifs(figure 4B et figure 5A) et des cellules(figure 4C). La concentration de la solution de protéine de matrice sous-optimale a mené à un modelage sous-optimal(figure 5B). Il est essentiel d’ut...

Ce protocole introduit une méthode de micropatterning sans lithographie qui est simple et accessible à ceux qui ont un fond limité de bioingénierie. Cette méthode utilise des pochoirs découpés au laser personnalisés pour micropatterniser les protéines de matrice extracellulaire dans une forme d’intérêt pour moduler les morphologies cellulaires. Le procédé pour le micropatterning est démontré utilisant les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites.

Micropatterning simple lithographie-libre à cellule unique à l’aide de stencils laser-cut

Micropatterning techniques have been widely used in cell biology to study effects of controlling cell shape and size on cell fate determination at single ...

Nous décrirons une méthode de micropatrin monocellule sans lithographie à base de pochoir qui surmonte de nombreux obstacles associés à la photolithographie et à la lithographie douce. Les pochoirs sont réutilisables et le processus est peu coûteux et personnalisable. Cette méthode a ouvert une nouvelle voie pour les chercheurs non-ingénieurs pour étudier la forme cellulaire et la mécanotransduction induite par la région dans divers contextes physiologiques et pathologiques.En outre, ce protocole permet la micropatrisation de milliers de cellules qui peuvent être utilisées pour le dépistage des médicaments à haut débit et la modélisation des maladies dans un plat. La démonstration visuelle facilitera l’implantation de deux étapes cruciales : le détachement du coverslip de l’hydrogel, le séchage de l’hydrogel suffisamment avant de placer le pochoir. Préparez la solution hydrogel en polyacrylamide dans un nouveau tube de centrifugeuse propylène de 50 millilitres tel que décrit dans le manuscrit.Ensuite, pour préparer la solution photoinitiateur à 5 %, dissoudre les ingrédients dans 700 microlitres de 100 % d’éthanol. Les ingrédients ne sont pas solubles dans l’eau alors assurez-vous de dissoudre complètement par vortex. Ajouter 300 microlitres de PBS pour un volume final d’un millilitre.Travailler sur la glace, diluer la solution de stock protéique de la matrice membranaire du sous-sol avec des supports de DMEM F12 glacés ou 1X PBS au rapport de dilution optimisé. Garder sur la glace pour une utilisation ultérieure. Lorsque vous travaillez avec la matrice membranaire du sous-sol, assurez-vous de toujours travailler sur la glace et d’utiliser des solutions glacées dans des pointes et des tubes de pipette réfrigérés.Placez une lampe de banc UV dans un capot de sécurité biologique. Ensuite, placez les films de paraffine stérilisés préparés précédemment. Si les films de paraffine ne sont pas complètement secs, utilisez un système d’aspiration sous vide pour éliminer tout liquide résiduel.À l’aide de forceps autoclavés, placer six couvre-pièces autoclavés sur le film de paraffine six dans chaque boîte de Petri. Pour préparer la solution finale de polyacrylamide interdé linkable UV, diluez la solution photoinitiateur avec la solution précurseur du polyacrylamide hydrogel. Stériliser la solution à l’aide d’une unité de filtre de 50 millilitres avec une taille de pore de 0,22 micromètre.Distribuez ensuite 200 microlitres de solution finale de polyacrylamide interdélindible UV sur chacune des six couvertures de verre dans les boîtes de Petri. À l’aide de forceps autoclavés, couvrir soigneusement chaque coverslip d’un deuxième coverslip piégeant une couche de la solution entre les deux coverslips. Placez les boîtes de Pétri contenant les couvre-pièces sous la lampe de banc UV avec le couvercle non fermé.La couverture du livre blanc sur la surface non blanche est importante pour minimiser la perte d’intensité UV. Pour vous protéger contre les rayons UV, recouvrez la lampe de papier d’aluminium. Photopolymériser les hydrogels de polyacrylamide pendant cinq minutes.Utilisez une lame de rasoir pour séparer soigneusement chaque paire de coverslips. Remplissez le réservoir contenant six composites hydrogel coverslip avec PBS. Après le rinçage pendant cinq minutes, retourner les composites de coverslip hydrogel au film de paraffine dans la boîte de Petri.Obtenez un tube sulfo-SANPAH de stockage à moins 80 degrés Celsius. Ajouter 1 200 microlitres de PBS pré-réfrigérés au tube et mélanger en pipetant de haut en bas. Distribuez 200 microlitres du Sulfo-SANPAH dilué sur le film de paraffine dans la boîte de Petri.Placez un composite de coverslip hydrogel sur le Sulfo-SANPAH avec l’hydrogel contactant le Sulfo-SANPAH. Ensuite, placez les composites hydrogel coverslip sous la lampe UV et exposez-les pendant cinq minutes pour activer le Sulfo-SANPAH. Si le Sulfo-SANPAH passe de l’orange au brun indiquant une activation et une incorporation réussies, passez aux étapes suivantes dans les 10 minutes.Reconstituer le réservoir jetable de polypropylène avec du PBS frais. Transférez les composites de coverslip hydrogel activés au réservoir et rincez-les brièvement pour enlever sulfo-SANPAH non lié. Placez les composites hydrogel coverslip sur le film de paraffine dans les boîtes de Petri et tamponnez-les soigneusement avec des lingettes stériles sans peluche.Placer un pochoir sur chaque composite de coverslip hydrogel. Pour assurer un joint étanche entre le pochoir et le composite, éliminez l’excès d’humidité en tamponnant avec des lingettes autoclavées sans peluche. Distribuez soigneusement la solution de protéine matricielle membranaire diluée du sous-sol en plaçant 200 microlitres au-dessus de chaque composite de coverslip hydrogel.Incuber les constructions pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, transférez les composites dans une assiette de six puits. Un joint étanche entre l’hydrogel et le pochoir peut être facilement validé en observant si la solution protéique matricielle a été conservée au-dessus du pochoir.Le défaut de former un joint étanche entraîne une fuite rapide de la solution protéique à travers les trous. Plongez complètement les composites dans PBS. À l’aide d’une pince autoclavée, détachez soigneusement les pochoirs des hydrogels sans déchirer les hydrogels.Retirez le PBS des puits et remplissez les puits avec du DMEM. Incuber la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Après avoir retiré la plaque de l’incubateur, examiner le DMEM.Si le DMEM n’est pas nuageux, les composites hydrogel coverslip sont prêts à être utilisés pour le placage cellulaire. Des pochoirs ont été fabriqués contenant des rangées de carrés et de rectangles. Des substrats hydrogel micropatternés ont été créés à partir des pochoirs et des îlots de protéines matricielles ont été obtenus.Des îles cellulaires ont également été obtenues. Par exemple, des îlots de cardiomyocytes pluripotents d’origine humaine dérivés de cellules souches. La concentration de protéines matricielles a joué un rôle essentiel dans la génération de modèles appropriés.Une concentration optimale a conduit à une distribution homogène des protéines. Les concentrations de solutions protéiques matricielles sous-optimales ont conduit à des modelages sous-optimaux. Il est essentiel d’utiliser le côté avant du pochoir.Si l’arrière du pochoir est utilisé, la taille des îlots protéiques matricielles augmente en raison de la direction de la découpe au laser. Bien que l’utilisation du côté arrière du pochoir n’ait pas eu d’incidence significative sur la largeur des motifs rectangulaires, la hauteur a considérablement augmenté, ce qui a réduit le rapport d’aspect prévu. Le modelage à base de pochoir a été appliqué sur les substrats élastomères en silicium.Les cardiomyocytes modelés sur des substrats d’élastomère de silicium ont été visualisés par immunocytochimie de troponine cardiaque T à faible grossissement et par alpha-actinin de protéine sarcomeric à grossissement élevé. Le modelage à base de pochoir a également été appliqué pour modeler deux cardiomyocytes côte à côte sur des hydrogels avec des rigidités différentes. La découverte de cellules souches pluripotentes induites par l’homme et les protocoles de différenciation correspondants en ont fait un modèle humain in vitro idéal pour étudier l’oncogenèse et la pathogénie.Cependant, une limitation majeure de l’utilisation du système IPS est l’absence de structure au microenvironnement qui a une composition biochimique particulière et la rigidité d’interagir avec les cellules. Le modelage peut être combiné avec la microscopie de force de traction et les essais d’immunocytochimie pour caractériser la structure et la fonction des cardiomyocytes. L’analyse des types de cellules dérivées de l’IPS, dans notre cas cardiomyocyte, dans une morphologie plus physiologique ouvre des possibilités d’étudier les cardiomyocytes stimulants dans le plat de culture.La technique peut également être appliquée à de nombreux autres systèmes tels que et les plaques de criblage à haute teneur. La forme et le substrat peuvent être facilement ajustés à l’application.

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JoVE Journal

Developmental Biology

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