Micropatterning simple lithographie-libre à cellule unique à l’aide de stencils laser-cut
3 avril 2020
Ce protocole introduit une méthode de micropatterning sans lithographie qui est simple et accessible à ceux qui ont un fond limité de bioingénierie. Cette méthode utilise des pochoirs découpés au laser personnalisés pour micropatterniser les protéines de matrice extracellulaire dans une forme d’intérêt pour moduler les morphologies cellulaires. Le procédé pour le micropatterning est démontré utilisant les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites.
Nous décrirons une méthode de micropatrin monocellule sans lithographie à base de pochoir qui surmonte de nombreux obstacles associés à la photolithographie et à la lithographie douce. Les pochoirs sont réutilisables et le processus est peu coûteux et personnalisable. Cette méthode a ouvert une nouvelle voie pour les chercheurs non-ingénieurs pour étudier la forme cellulaire et la mécanotransduction induite par la région dans divers contextes physiologiques et pathologiques.
En outre, ce protocole permet la micropatrisation de milliers de cellules qui peuvent être utilisées pour le dépistage des médicaments à haut débit et la modélisation des maladies dans un plat. La démonstration visuelle facilitera l’implantation de deux étapes cruciales : le détachement du coverslip de l’hydrogel, le séchage de l’hydrogel suffisamment avant de placer le pochoir. Préparez la solution hydrogel en polyacrylamide dans un nouveau tube de centrifugeuse propylène de 50 millilitres tel que décrit dans le manuscrit.
Ensuite, pour préparer la solution photoinitiateur à 5 %, dissoudre les ingrédients dans 700 microlitres de 100 % d’éthanol. Les ingrédients ne sont pas solubles dans l’eau alors assurez-vous de dissoudre complètement par vortex. Ajouter 300 microlitres de PBS pour un volume final d’un millilitre.
Travailler sur la glace, diluer la solution de stock protéique de la matrice membranaire du sous-sol avec des supports de DMEM F12 glacés ou 1X PBS au rapport de dilution optimisé. Garder sur la glace pour une utilisation ultérieure. Lorsque vous travaillez avec la matrice membranaire du sous-sol, assurez-vous de toujours travailler sur la glace et d’utiliser des solutions glacées dans des pointes et des tubes de pipette réfrigérés.
Placez une lampe de banc UV dans un capot de sécurité biologique. Ensuite, placez les films de paraffine stérilisés préparés précédemment. Si les films de paraffine ne sont pas complètement secs, utilisez un système d’aspiration sous vide pour éliminer tout liquide résiduel.
À l’aide de forceps autoclavés, placer six couvre-pièces autoclavés sur le film de paraffine six dans chaque boîte de Petri. Pour préparer la solution finale de polyacrylamide interdé linkable UV, diluez la solution photoinitiateur avec la solution précurseur du polyacrylamide hydrogel. Stériliser la solution à l’aide d’une unité de filtre de 50 millilitres avec une taille de pore de 0,22 micromètre.
Distribuez ensuite 200 microlitres de solution finale de polyacrylamide interdélindible UV sur chacune des six couvertures de verre dans les boîtes de Petri. À l’aide de forceps autoclavés, couvrir soigneusement chaque coverslip d’un deuxième coverslip piégeant une couche de la solution entre les deux coverslips. Placez les boîtes de Pétri contenant les couvre-pièces sous la lampe de banc UV avec le couvercle non fermé.
La couverture du livre blanc sur la surface non blanche est importante pour minimiser la perte d’intensité UV. Pour vous protéger contre les rayons UV, recouvrez la lampe de papier d’aluminium. Photopolymériser les hydrogels de polyacrylamide pendant cinq minutes.
Utilisez une lame de rasoir pour séparer soigneusement chaque paire de coverslips. Remplissez le réservoir contenant six composites hydrogel coverslip avec PBS. Après le rinçage pendant cinq minutes, retourner les composites de coverslip hydrogel au film de paraffine dans la boîte de Petri.
Obtenez un tube sulfo-SANPAH de stockage à moins 80 degrés Celsius. Ajouter 1 200 microlitres de PBS pré-réfrigérés au tube et mélanger en pipetant de haut en bas. Distribuez 200 microlitres du Sulfo-SANPAH dilué sur le film de paraffine dans la boîte de Petri.
Placez un composite de coverslip hydrogel sur le Sulfo-SANPAH avec l’hydrogel contactant le Sulfo-SANPAH. Ensuite, placez les composites hydrogel coverslip sous la lampe UV et exposez-les pendant cinq minutes pour activer le Sulfo-SANPAH. Si le Sulfo-SANPAH passe de l’orange au brun indiquant une activation et une incorporation réussies, passez aux étapes suivantes dans les 10 minutes.
Reconstituer le réservoir jetable de polypropylène avec du PBS frais. Transférez les composites de coverslip hydrogel activés au réservoir et rincez-les brièvement pour enlever sulfo-SANPAH non lié. Placez les composites hydrogel coverslip sur le film de paraffine dans les boîtes de Petri et tamponnez-les soigneusement avec des lingettes stériles sans peluche.
Placer un pochoir sur chaque composite de coverslip hydrogel. Pour assurer un joint étanche entre le pochoir et le composite, éliminez l’excès d’humidité en tamponnant avec des lingettes autoclavées sans peluche. Distribuez soigneusement la solution de protéine matricielle membranaire diluée du sous-sol en plaçant 200 microlitres au-dessus de chaque composite de coverslip hydrogel.
Incuber les constructions pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, transférez les composites dans une assiette de six puits. Un joint étanche entre l’hydrogel et le pochoir peut être facilement validé en observant si la solution protéique matricielle a été conservée au-dessus du pochoir.
Le défaut de former un joint étanche entraîne une fuite rapide de la solution protéique à travers les trous. Plongez complètement les composites dans PBS. À l’aide d’une pince autoclavée, détachez soigneusement les pochoirs des hydrogels sans déchirer les hydrogels.
Retirez le PBS des puits et remplissez les puits avec du DMEM. Incuber la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Après avoir retiré la plaque de l’incubateur, examiner le DMEM.
Si le DMEM n’est pas nuageux, les composites hydrogel coverslip sont prêts à être utilisés pour le placage cellulaire. Des pochoirs ont été fabriqués contenant des rangées de carrés et de rectangles. Des substrats hydrogel micropatternés ont été créés à partir des pochoirs et des îlots de protéines matricielles ont été obtenus.
Des îles cellulaires ont également été obtenues. Par exemple, des îlots de cardiomyocytes pluripotents d’origine humaine dérivés de cellules souches. La concentration de protéines matricielles a joué un rôle essentiel dans la génération de modèles appropriés.
Une concentration optimale a conduit à une distribution homogène des protéines. Les concentrations de solutions protéiques matricielles sous-optimales ont conduit à des modelages sous-optimaux. Il est essentiel d’utiliser le côté avant du pochoir.
Si l’arrière du pochoir est utilisé, la taille des îlots protéiques matricielles augmente en raison de la direction de la découpe au laser. Bien que l’utilisation du côté arrière du pochoir n’ait pas eu d’incidence significative sur la largeur des motifs rectangulaires, la hauteur a considérablement augmenté, ce qui a réduit le rapport d’aspect prévu. Le modelage à base de pochoir a été appliqué sur les substrats élastomères en silicium.
Les cardiomyocytes modelés sur des substrats d’élastomère de silicium ont été visualisés par immunocytochimie de troponine cardiaque T à faible grossissement et par alpha-actinin de protéine sarcomeric à grossissement élevé. Le modelage à base de pochoir a également été appliqué pour modeler deux cardiomyocytes côte à côte sur des hydrogels avec des rigidités différentes. La découverte de cellules souches pluripotentes induites par l’homme et les protocoles de différenciation correspondants en ont fait un modèle humain in vitro idéal pour étudier l’oncogenèse et la pathogénie.
Cependant, une limitation majeure de l’utilisation du système IPS est l’absence de structure au microenvironnement qui a une composition biochimique particulière et la rigidité d’interagir avec les cellules. Le modelage peut être combiné avec la microscopie de force de traction et les essais d’immunocytochimie pour caractériser la structure et la fonction des cardiomyocytes. L’analyse des types de cellules dérivées de l’IPS, dans notre cas cardiomyocyte, dans une morphologie plus physiologique ouvre des possibilités d’étudier les cardiomyocytes stimulants dans le plat de culture.
La technique peut également être appliquée à de nombreux autres systèmes tels que et les plaques de criblage à haute teneur. La forme et le substrat peuvent être facilement ajustés à l’application.
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Aperçu
Ce protocole présente une méthode de micropatterning sans lithographie basée sur des pochoirs, accessible aux chercheurs ayant une expérience limitée en bioingénierie. La méthode utilise des pochoirs réutilisables découpés au laser pour créer des motifs micrométriques de protéines de la matrice extracellulaire, permettant ainsi de moduler la morphologie cellulaire, en particulier chez les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Bioingénierie
- Recherche sur les cellules souches
Contexte
- Les méthodes traditionnelles de photolithographie et de lithographie douce peuvent être complexes et coûteuses.
- Cette nouvelle méthode est conçue pour être peu coûteuse et personnalisable.
- Elle permet aux chercheurs non spécialisés en génie de s'intéresser à la forme des cellules et à la mécanotransduction.
- Le micropatterning peut être appliqué à des milliers de cellules pour des applications à haut débit.
Objectif de l'étude
- Offrir une méthode simple de micropatterning accessible à un plus grand nombre de chercheurs.
- Faciliter les études sur la morphologie cellulaire et la mécanotransduction dans divers contextes.
- Permettre le criblage à haut débit de médicaments et la modélisation des maladies.
Méthodes utilisées
- Préparation d'une solution d'hydrogel de polyacrylamide.
- Utilisation de pochoirs découpés au laser pour la micropatterning.
- Détachement du coverslip de l'hydrogel.
- Séchage de l'hydrogel avant la pose du pochoir.
Résultats principaux
- La méthode permet de façonner avec succès les protéines de la matrice extracellulaire.
- Elle démontre la capacité de moduler efficacement la morphologie cellulaire.
- Des applications à haut débit sont réalisables avec cette approche.
- Des démonstrations visuelles améliorent la compréhension du protocole.
Conclusions
- Cette méthode sans lithographie simplifie le processus de micropatterning.
- Elle ouvre de nouvelles voies de recherche en biologie cellulaire et en mécanotransduction.
- Le protocole convient à un large éventail d'applications en recherche biomédicale.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette méthode de micropatterning basée sur des pochoirs, sans lithographie, remédie aux obstacles d'accès dans l'analyse de la cellule unique, permettant à un plus grand nombre d'équipes de recherche et développement d'étudier la mécanotransduction et la détermination du destin cellulaire sans nécessiter d'expertise spécialisée en microfabrication. En permettant un micropatterning à haut débit de milliers de cellules, elle améliore la confiance prédictive dans les validations ciblées et les procédés de criblage phénotypique. L'approche réduit la complexité technique et les coûts, facilitant ainsi une adoption évolutive dans la phase de découverte précoce et le développement de modèles précliniques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet d'interroger des hypothèses thérapeutiques en modulant la forme et la taille des cellules afin d'étudier les voies de mécanotransduction dans des systèmes pertinents pour la maladie.
- Valeur opérationnelle : Offre une plateforme robuste et peu coûteuse pour la validation fonctionnelle de cibles à l'aide de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) et d'autres types cellulaires.
- Fiabilité prédictive : Facilite le tri du portefeuille en générant des paramètres quantitatifs morphologiques et fonctionnels qui réduisent les risques liés aux hypothèses mécanistiques.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés pour l'évaluation de composés en aval en créant des substrats micropatterning standardisés avec une présentation contrôlée de la matrice extracellulaire.
- Valeur opérationnelle : Permet la standardisation et la reproductibilité des tests grâce à des pochoirs réutilisables découpés au laser et à un marquage protéique reproductible basé sur des hydrogels.
- Extensibilité : Facilite la préparation pour le criblage à haut débit en permettant la création de réseaux pouvant contenir jusqu'à 2 000 cellules par expérience, ce qui permet des profils de réponse en fonction de la dose et des profils phénotypiques.
Recherche translationnelle et préclinique
- Système pertinent pour la maladie : S'applique aux cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC), permettant l'étude de morphologies rectangulaires semblables à celles des adultes, qui modélisent mieux la mécanotransduction physiologique dans les contextes de maladies cardiaques.
- Continuité translationnelle : Relie la découverte et les travaux précliniques en permettant l'évaluation de la structure et de la fonction cellulaire sur des substrats de rigidité variable, soutenant l'harmonisation des biomarqueurs et une progression adaptée au risque.
- Réduction des incertitudes mécanistiques : Diminue l'ambiguïté des relations génotype-phénotype en isolant l'effet de la géométrie cellulaire sur les voies de signalisation, améliorant ainsi la valeur prédictive pour la traduction in vivo.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre dans le continuum de découverte, depuis le test d'hypothèses jusqu'à l'identification de composés candidats, en fournissant une préparation cellulaire standardisée pour des tests mécanistiques et phénotypiques.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en permettant un contrôle précis de la forme et de la surface cellulaire afin d'étudier la mécanotransduction dans des modèles dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC).
- Criblage : Offre une prêts-à-usage pour les tests et des sorties quantitatives grâce à un micropatterning reproductible de milliers de cellules, permettant un criblage fiable de composés dans des applications de modélisation de maladies.
- Analytique : Produit des données mesurables telles que l'alignement cellulaire, la formation d'îlots protéiques et des métriques morphologiques, aidant les équipes à comparer les conditions après des perturbations génétiques ou pharmacologiques.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique en permettant le patterning sur des substrats ajustables (par exemple, élastomère de silicium) pour évaluer les réponses dépendantes de la rigidité, pertinentes pour les modèles cardiaques fibrotiques ou ischémiques.
- Réutilisation en entreprise : Positionne l'approche basée sur des pochoirs comme une capacité réutilisable dans différents projets, réduisant les configurations redondantes et favorisant leur adoption transversale dans les plateformes de mécanobiologie et de criblage phénotypique.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique grâce à un micromodèlage cellulaire unique et contrôlé.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation, la reproductibilité et l'évolutivité par l'utilisation de pochoirs réutilisables et de modélisation basée sur des hydrogels, compatibles avec les protocoles standards de culture cellulaire.
- Valeur stratégique : Affine les décisions d'avancement ou d'abandon en permettant la détection précoce de réponses phénotypiques dépendantes de la forme, réduisant ainsi les risques biologiques en phase avancée dans les programmes axés sur la cardiologie et la mécanotransduction.
- Impact sur le portefeuille : Favorise une priorisation ajustée au risque en générant des données riches liées à la morphologie, qui éclairent le choix des cibles et l'optimisation des candidats.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite des compétences de base en culture cellulaire et en biologie moléculaire ; aucune formation spécialisée en microfabrication n'est requise.
- Suppose l'accès à une source de lumière UV, à la fabrication de pochoirs par découpe laser (pouvant être externalisée) et aux réactifs standards d'hydrogels (par exemple, acrylamide, Sulfo-SANPAH).
- Exige une standardisation inter-équipes de l'orientation des pochoirs et de la préparation des hydrogels afin d'assurer un marquage protéique cohérent et un contrôle précis du rapport d'aspect.
- Les considérations d'adaptation incluent la compatibilité du substrat (par exemple, verre, élastomères) et l'optimisation des protéines de la matrice extracellulaire selon les types cellulaires spécifiques.
- Les limites pratiques comprennent la manipulation soigneuse des pochoirs pour éviter le déchirement de l'hydrogel, ainsi qu'un chronométrage précis lors de l'activation du Sulfo-SANPAH afin d'assurer une immobilisation efficace des protéines.
