Fabrication de réseaux de nanotubes lipidiques multi-composants à l’aide du test de motilité de la kinésine glissante
26 juillet 2021
Ce protocole décrit un processus de fabrication de réseaux de nanotubes lipidiques en utilisant la motilité de la kinésine glissante en conjonction avec des vésicules lipidiques unilamellaires géantes.
Ce protocole permet la génération simple de réseaux de nanotubes lipidiques à grande échelle dans lesquels les nanotubes individuels présentent un comportement de séparation de phase similaire à celui de la vésicule parente. Le principal avantage de cette approche est que nous cooptons le travail effectué par les moteurs moléculaires pour auto-assembler les nanotubes lipidiques de manière très parallèle et sans intervention humaine. Pour mettre en place un test de motilité de glissement, fixez d’abord trois ensembles de bandes de ruban adhésif double face sur une glissière de verre espacée de cinq millimètres.
Appuyez doucement sur un couvercle et ajoutez 30 microlitres d’une solution de kinésine monomolaire dans la cellule d’écoulement préparée. Après cinq minutes, ajouter 30 microlitres d’une solution de microtubules de 10 microgrammes /millilitres dans la cellule, en appuyant doucement sur une lingette de laboratoire contre l’extrémité opposée du canal d’écoulement pour faciliter l’échange de solution. Après une autre incubation de cinq minutes, lavez la cellule une à trois fois avec 50 microlitres de solution de motilité à température ambiante par lavage avant d’ajouter 30 microlitres de solution de streptavidine de 10 microgrammes / millilitres à la cellule d’écoulement.
Après 10 minutes, ajouter 30 microlitres d’une solution GUV 10X pour une incubation de 30 minutes à température ambiante. Ensuite, ajoutez deux microlitres d’une solution AMP-PNP de 100 millimolaires et fermez la chambre avec du scellant. Transférez la chambre d’écoulement dans un microscope inversé pour l’imagerie et sélectionnez le jeu de filtres approprié.
Utilisez un objectif d’huile 100X pour focaliser d’abord la surface du couvercle avant d’acquérir une image d’un réseau d’intérêt. Ouvrez ensuite l’image dans ImageJ et cliquez sur Image, Couleur et Composite pour superposer les couches rouge et verte afin de créer une image composite. Après l’imagerie, ouvrez l’image qui vous intéresse et cliquez sur Analyser et définir l’échelle pour calibrer l’échelle du microscope.
Remplissez les pixels au facteur de conversion du micromètre et cliquez sur OK. Utilisez l’outil de ligne multipoint pour tracer les nanotubes à partir du GUV parent et maintenez enfoncés Ctrl et M pour mesurer la longueur. L’outil de traitement d’image enregistrera chaque nouvelle mesure dans la fenêtre de résultats. Lorsque tous les tubes ont été mesurés, sélectionnez Image, Ajuster et Seuil, puis cliquez sur Appliquer pour appliquer le seuil.
Ensuite, dessinez un rectangle de longueur connue sur le tube souhaité. Pour mesurer la densité intégrée de la zone, cliquez sur Analyser et mesurer Pour déterminer la partition des lipides dans les nœuds de nanotubes liquides, utilisez l’outil Ligne pour tracer une ligne sur le nœud d’intérêt et mesurer l’intensité du nœud dans les canaux vert et rouge. Dans cette analyse représentative, des réseaux de nanotubes liquides ont été fabriqués pour générer des phases désordonnées et ordonnées par des liquides, ainsi que des vésicules séparées par phase.
Par exemple, les vésicules synthétisées avec 45% de lipides saturés et 55% de lipides insaturés donnent des vésicules qui se séparent en phases coexistantes désordonnées liquides et solides. Si le cholestérol est inclus, cependant, la coexistence liquide-liquide peut alors être observée, créant des GUV qui se séparent en phases coexistantes d’ordre liquide et de désordre liquide. De plus, des nœuds peuvent être observés dans les mélanges séparés par phase.
La chose la plus importante à retenir est de choisir le temps d’exposition approprié et le jeu de filtres ND pour pouvoir visualiser les nanotubes lipidiques sans photo-blanchiment des fluorophores. L’adaptation de la composition du comportement de phase des nanotubes lipidiques nous permet d’utiliser un système de modèle minimaliste pour commencer à étudier la biophysique des nanotubes à effet tunnel qui relient les cellules.
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Aperçu
Ce protocole permet la génération simple de réseaux de nanotubes lipidiques à grande échelle en utilisant la mobilité glissante de la kinésine. Les nanotubes individuels présentent un comportement de séparation de phase similaire à celui des vésicules parentes.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biophysique
- Biologie cellulaire
Contexte
- Les nanotubes lipidiques sont importants pour l'étude de la dynamique des membranes.
- Les moteurs kinésines facilitent l'auto-assemblage des structures lipidiques.
- La séparation de phase dans les systèmes lipidiques peut fournir des informations sur les processus cellulaires.
- Cette méthode améliore la reproductibilité de la production de nanotubes.
Objectif de l'étude
- Fabriquer efficacement des réseaux de nanotubes lipidiques.
- Utiliser des moteurs moléculaires pour l'auto-assemblage sans intervention humaine.
- Explorer le comportement de phase des nanotubes lipidiques.
Méthodes utilisées
- Préparation d'un test de motilité par glissement utilisant la kinésine et les microtubules.
- Utilisation d'un ruban adhésif double face pour créer une chambre d'écoulement sur une lame en verre.
- Ajout séquentiel de solutions de kinésine et de microtubules.
- Lavage et ajout de streptavidine pour faciliter la formation de nanotubes.
Résultats principaux
- Génération réussie de réseaux de nanotubes lipidiques.
- Démonstration d'un comportement de séparation de phase dans les nanotubes.
- Forte évolutivité de la méthode grâce à l'utilisation de moteurs moléculaires.
- Applications potentielles dans l'étude de la dynamique membranaire et des processus cellulaires.
Conclusions
- Le protocole fournit une méthode fiable pour fabriquer des nanotubes lipidiques.
- L'utilisation de moteurs kinésine permet un auto-assemblage efficace.
- Cette approche peut faire progresser la recherche en biologie des lipides et en dynamique membranaire.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
La fabrication rapide de réseaux de nanotubes lipidiques multicomposants à l'aide du test de mobilité par glissement de la kinésine permet de créer des modèles in vitro évolutifs et reproductibles pour l'étude du transport associé aux membranes et de la biophysique lipidique. Cette approche favorise la découverte en phase précoce en fournissant des systèmes ajustables et biologiquement pertinents qui imitent la complexité des tubules lipidiques cellulaires. La méthode améliore la fiabilité prédictive dans les études mécanistiques et le tri des portefeuilles en recherche thérapeutique ciblant les membranes.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet l'étude des mécanismes de transport membranaire dans un système contrôlé et ajustable.
- Permet la validation fonctionnelle de cibles moléculaires impliquées dans la dynamique et le transport des lipides.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en modélisant la séparation de phases et le partage des lipides.
- Offre une plateforme pour tester des hypothèses sur les interactions lipides-protéines liées aux voies de maladies.
Développement de criblages et de tests
- Permet une préparation reproductible et évolutive de réseaux de nanotubes lipidiques pour des tests en aval.
- Permet la mesure quantitative de la longueur, de la largeur des nanotubes et de la répartition des lipides pour la standardisation des tests.
- Permet la génération rapide de systèmes lipidiques complexes à l’aide d’équipements de laboratoire standards.
- Facilite le criblage de composés affectant la structure membranaire ou les processus de transport.
Recherche translationnelle et préclinique
- Fournit un modèle pertinent pour l'étude des nanotubes de tunnelisation impliqués dans la communication intercellulaire.
- S'inscrit dans la découverte translationnelle de biomarqueurs en permettant l'analyse du comportement de phase et du partitionnement des lipides.
- Permet une continuité allant de la découverte à la validation préclinique d'interventions ciblant les membranes.
- Réduit l'ambiguïté biologique dans le choix des modèles précliniques pour les composés actifs sur les membranes.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode s'intègre dans la continuité de la découverte, depuis les premières études mécanistiques jusqu'au développement de modèles précliniques pour les cibles associées aux membranes.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies impliquées dans le transport et la signalisation médiés par les lipides.
- Criblage : Fournit des réseaux de nanotubes lipidiques prêts à l'emploi, reproductibles et aux propriétés ajustables.
- Analytique : Permet la mesure quantitative des dimensions des nanotubes et du partitionnement lipidique pour des analyses comparatives.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les connaissances mécanistiques obtenues in vitro et les phénomènes membranaires pertinents pour les maladies.
- Réutilisation en milieu professionnel : Offre une plateforme standardisée et évolutible, adaptable à plusieurs programmes de recherche.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la recherche en biologie membranaire.
- Valeur opérationnelle : Simplifie la fabrication, la standardisation et la reproductibilité des systèmes lipidiques complexes.
- Valeur stratégique : Améliore la prise de décision « aller/stop » et l'efficacité du capital pour les portefeuilles ciblant les membranes.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des candidats thérapeutiques actifs sur les membranes.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en biophysique des lipides et en microscopie de fluorescence pour l'analyse quantitative.
- Requiert un équipement de laboratoire standard pour le montage de la cellule d'écoulement et l'imagerie.
- Exige une standardisation interéquipes des protocoles d'imagerie et de mesure.
- Adaptable à diverses compositions lipidiques et systèmes modèles pour répondre à différents besoins de recherche.
- Dépend d'un contrôle rigoureux des paramètres d'imagerie afin d'éviter la photodégradation des fluorophores.
