Échantillonnage et analyse des signaux olfacteurs d’animaux

Nous avons développé une méthodologie efficace pour l’échantillonnage et l’analyse des signaux d’odeur afin de comprendre comment ils peuvent être utilisés dans la communication animale. En particulier, nous utilisons la microextraction en phase solide de l’espace de tête couplée à la chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse pour analyser les composants volatils des odeurs animales et des marquages olfacteurs.

Le rôle joué par l’odeur dans la communication animale est actuellement sous-estimé et donc sous-étudié. En particulier, on sait très peu de choses sur les changements chimiques qui sous-tendent les signaux olfactifs chez les animaux, y compris les humains. Et cela est également dû à des défis méthodologiques, l’enregistrement et la quantification des composés chimiques des odeurs utilisées par les animaux pour communiquer.

Il existe plusieurs défis potentiels lorsque vous travaillez avec des mélanges chimiques très complexes et ceux-ci incluent également lors de l’échantillonnage et de l’analyse des échantillons d’odeur. Nous effectuons l’analyse des odeurs utilisées par les animaux afin de comprendre comment ils peuvent être utilisés par eux lorsqu’ils communiquent entre eux. Nous avons combiné la cytochimie avec l’endocrinologie et la cytologie de bioécologie pour améliorer notre compréhension du rôle joué par l’odeur dans la communication animale.

Pour notre méthodologie actuelle à Wolverhampton, nous avons adopté la technique de la microstructure en phase solide Headspace couplée à la spectrométrie de masse par chromatographie en phase gazeuse, construite sur et un invisible de la méthodologie sont utilisés dans le passé. Les odeurs d’échantillons sont collectées de l’une des manières suivantes. Un, spontanément libéré des odeurs d’échantillon de sujets d’étude habitués.

Par exemple, les primates des zoos recueillent les sécrétions d’odeurs des glandes en marquant les odeurs sur du papier filtre stérile ou des échantillons d’urine directement dans des flacons. Deux, après avoir entraîné les sujets d’étude en utilisant le renforcement positif recueillir les sécrétions d’odeurs en frottant le regard de parfum avec des cotons-tiges stériles. Trois, après sédation des sujets de l’étude recueillir les sécrétions d’odeurs en frottant les glandes odorantes avec des cotons-tiges stériles, par des échantillons dans stérile 10 millilitres vis coiffé, flacons en verre clair et joint avec bouchons surmontés de vis incorporant P T F E secteur silicone.

Rangez immédiatement les flacons à moins 20 degrés Celsius. Notez qu’il est essentiel d’utiliser de l’équipement de protection individuelle propre, comme des gants en nitrile, pendant l’échantillonnage. Changer de gants évite fréquemment le contact direct avec la peau avec les échantillons et les flacons.

Il est préférable d’utiliser des flacons flambant neufs. Cependant, en cas de flacons usagés, il est essentiel de pré-nettoyer les flacons, puis d’utiliser le même protocole. Prenez des blancs environnementaux chaque fois que des marques d’odeur sont collectées.

Pour ce faire, exposez un papier filtre ou un coton-tige et des flacons inutilisés à l’environnement pendant que l’échantillonnage est effectué. Les échantillons sont préparés sur le terrain. Pour un papier filtre marqué parfumé couper un carré d’environ 10 millimètres du papier et placer dans un flacon d’espace de tête à vis de 10 millilitres.

Pour un écouvillon, coupez la tête de l’écouvillon à l’extrémité de l’arbre de l’écouvillon et placez-la dans un flacon d’espace de tête. Après que chaque échantillon a été préparé, éliminer ou nettoyer la lame, utiliser pour couper le support d’échantillonnage, avec une lingette antibactérienne appropriée et ou de l’alcool et sécher soigneusement. Conservez tous les échantillons à moins 20 degrés Celsius.

Notez que les échantillons doivent être conservés à moins 20 degrés Celsius, mais dans le magasin de terrain à la température la plus basse possible et transférés à moins 20 degrés Celsius à la première occasion. Avant l’analyse, retirer les échantillons du congélateur et laisser marcher naturellement jusqu’à la température ambiante pendant au moins une heure. Configurez les méthodes d’analyse sur le SMGC comme suit pour les conditions d’analyse spms suivez les instructions du fabricant pour conditionner les fibres SBME avant la première utilisation.

Il est essentiel que l’ensemble SBME soit correctement installé dans l’échantillonneur automatique et qu’il soit aligné sur l’unité de conditionnement de fibre des plateaux d’échantillonneur automatique et le port d’entrée GC. Un mauvais alignement pourrait entraîner des dommages ou la destruction de la fibre Sbme. Assurez-vous que l’alimentation en gaz de perche de l’unité de conditionnement de la fibre est activée.

Pour améliorer la cohérence entre le temps de rétention de l’échantillon, la méthode analytique est le temps de rétention verrouillé ajouter les flacons d’échantillons au plateau de l’échantillonneur automatique placer un flacon d’espace de tête vide pour agir comme un système vide dans la première position du plateau de l’échantillonneur automatique. Placez l’ébauche environnementale dans la deuxième position, puis placez tous les échantillons restants pour analyse dans les positions suivantes du plateau de l’échantillonneur automatique. Créez une séquence analytique pour analyser chaque échantillon dans le bac à échantillons.

Dans l’écran d’accueil du chasseur de masse, sélectionnez séquence pour la barre de menus, puis chargez la séquence dans le menu déroulant. Une table de séquences vierges sera affichée pour compléter la table de séquences pour tous les blancs et échantillons en insérant les informations appropriées enregistrer en tant que table de séquences terminée. Notez que les informations exactes pour le tableau de séquence dépendront de la mise en forme du tableau par les laboratoires.

Les informations minimales incluent normalement le nom de l’échantillon de type, l’emplacement du fichier et la méthode d’analyse des nombres, ainsi que l’emplacement du fichier de données et l’attribution du nom d’un fichier de données qui correspond au nom de l’échantillon qui a vieilli le traitement futur des données. Des échantillons supplémentaires peuvent être ajoutés à la séquence pendant l’analyse. Exécutez la séquence en sélectionnant la séquence dans la barre de menus, puis exécutez la séquence.

Après analyse, les échantillons ont été renvoyés au congélateur dès que possible. Notez qu’il peut être possible de réanalyser des échantillons. Mais il convient de noter que certains composants volatils peuvent avoir été totalement extraits lors de l’analyse initiale et que certains composés peuvent avoir subi une décomposition thermique et bactérienne à 40 degrés Celsius.

Ainsi, le résultat dans le chromatogramme peut ne pas être complètement représentatif du marquage olfactif d’origine. L’analyse initiale des données comprend l’intégration de chromatogrammes pour obtenir des données sur le temps de rétention et la surface de crête, ainsi que l’identification provisoire des pics à l’aide d’un logiciel de station cam et de bases de données spectrales de masse d’imbrication. L’analyse des données peut être effectuée manuellement ou par une méthode semi-automatisée.

Si la méthode semi-automatisée est utilisée, il est parfois avantageux d’entreprendre un certain degré d’analyse manuelle des données pour vérifier les identifications provisoires. Pour démarrer l’analyse des données, ouvrez le fichier de données en cliquant sur le fichier approprié dans la barre de navigation de gauche. Le chromatogramme ionique total TIC sera affiché dans la fenêtre supérieure de l’écran d’analyse de données.

Pour intégrer le TIC à l’aide de l’intégrateur RTE, sélectionnez d’abord le chromatogramme dans la barre de menus, puis sélectionnez intégrateur dans le menu déroulant, une fenêtre contextuelle s’ouvre et choisissez l’intégrateur RTE. Revenez au menu chromatogramme et sélectionnez maintenant Intégrer. Pour ajuster les paramètres d’intégration de sorte que les pics ou plus de trois fois le bruit de base soient intégrés, sélectionnez à nouveau le chromatogramme dans la barre de menus, puis les paramètres d’intégration de MS Signal dans le menu déroulant.

Dans la fenêtre contextuelle, ajustez la zone de crête minimale comme il convient 1.0 produit des résultats acceptables dans nos exemples. Pour identifier les pics et générer un rapport de synthèse, sélectionnez Exporter les rapports dans la barre de menus, puis les résultats de la recherche de la bibliothèque rapportent à XLS. Notez que les bibliothèques spectrales à rechercher ainsi que le nombre de correspondances de bibliothèque à afficher doivent être prédéfinies dans le logiciel avant qu’une recherche de bibliothèque puisse être entreprise.

Le rapport de feuille de calcul qui en résulte contient des données d’intégration pour chaque pic et une correspondance provisoire de la bibliothèque spectrale pour attribuer l’identité. En règle générale, la qualité de la bibliothèque ou la correspondance de bibliothèque doit être supérieure à 80 pour accepter l’identification provisoire. Enregistrez la feuille de calcul.

Pour identifier un pic directement à partir du TIC, choisissez le pic d’intérêt. Si le pic est un petit zoom avant en dessinant une zone autour du pic, en maintenant le bouton gauche de la souris enfoncé, étirez la zone sur le pic et relâchez le bouton de la souris. Placez la ligne du curseur de sorte qu’elle soit au point le plus élevé du pic ou juste après.

Double-cliquez, le bouton droit de la souris et le spectre de masse pour le pic apparaîtront dans la fenêtre basse de l’écran d’analyse de données. Pour rechercher une bibliothèque spectrale, déplacez le curseur n’importe où dans la fenêtre spectrale et double-cliquez sur le bouton droit de la souris, les résultats de la recherche de bibliothèque apparaîtront dans une nouvelle fenêtre. Pour supprimer d’abord le bruit de fond d’un spectre d’intérêt, double-cliquez sur le bouton droit de la souris sur le pic en question, puis cliquez sur le bouton droit de la souris dans une zone sans pics immédiatement devant le pic d’intérêt, cliquez sur le bouton soustraire dans le ruban de menu ou sélectionnez le chromatogramme pour la barre de menus, puis soustrayez les spectres du menu déroulant.

Le spectre soustrait s’affichera dans la fenêtre inférieure de l’écran d’analyse des données et affichera un tiret à côté des données de balayage dans l’en-tête de la fenêtre. Suite à ce protocole, nous avons provisoirement identifié un total de 32 composés chimiques volatils de l’analyse de 14 marques d’odeur génitales libérées spontanément sur le papier filtre par des lémuriens ébouriffés rouges et comparé les profils d’odeur avec les caractéristiques du signaleur composés volatils naturels tels que les hydrocarbures, les terpènes, les alcools de Turpin et les cétones étaient présents dans ces profils et incluaient les composés qui avaient été précédemment trouvés pour agir comme hormones sexuelles et indices de fitness chez d’autres espèces animales. Les composés qui ont été provisoirement identifiés sont énumérés dans le tableau un.

Les chromatogrammes représentatifs d’un contrôle et d’un indicateur olfléance de Lima sont illustrés à la figure un. Le nombre et l’abondance relative des composantes variaient d’un échantillon à l’autre selon les sujets de l’étude. Cependant, six composés marqués de A à F sur le chromatogramme étaient présents dans tous les échantillons.

Ces composés étaient respectivement des courbures à hauteur à E' isle de s un hexanal paracrystal six paramentha deux huit colorant un deux pinène quatre et pentodecane. Les résultats de cette étude ont suggéré que les lémuriens ébouriffés rouges utilisent le marquage envoyé pour transmettre des informations sur le sexe et l’âge féminin avec un marquage sans génitale jouant un rôle dans la communication socio-sexuelle. Un autre résultat représentatif suivant l’utilisation de ce protocole a été notre étude de la publicité de fertilité par les babouins olive femelles.

Nous avons identifié un total de 74 composés volatils de l’analyse de 395 échantillons vaginaux femelles d’odeur de babouin. Ceux-ci comprenaient une gamme de composés volatils odorants naturels tels que les cétones, les alcools, les aldéhydes, les terpènes, les acides gras volatils et les hydrocarbures. Les chromatogrammes typiques utilisés pour comparer les échantillons d’odeur vaginale de troll vierge et de babouin femelle provenant de périodes fertiles et non fertiles sont illustrés à la figure deux.

Nous examinons les relations entre les profils d’odeur vaginale et la réceptivité sexuelle des babouins femelles. Nos résultats ont montré que la quantité totale d’odeur vaginale diffère avec la fertilité, ce qui suggère que l’odeur pourrait jouer un rôle dans la signalisation de la fertilité des babouins femelles. Nous avons également constaté des différences dans les odeurs vaginales entre les types de groupes, mais nous n’avons pas pu distinguer les effets de la composition du groupe, de l’imparité de l’âge féminin.

Ce sont les avantages combinés de l’échantillonnage et de l’utilisation du SMGC. Ainsi, l’utilisation de la micro-extraction en phase solide de l’espace de tête permet d’analyser un large éventail d’échantillons différents à l’aide du SMGC. Nous sommes en mesure de séparer les composants de ces marquages complexes, puis d’identifier chacun de ces composants individuels à l’aide du spectromètre de masse.

Et puis, donc toute la technique combinée est très puissante et nous donne beaucoup d’informations sur ces marquages olfacteurs, qui dans le passé auraient été beaucoup d’extraction de préparation d’échantillons nécessaires pour pouvoir obtenir les résultats.