Name: Caractérisation de la différenciation in vitro des kératinocytes primaires humains par analyse ARN-Seq (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Découvrez la différenciation in vitro des kératinocytes primaires humains par inhibition de contact et son analyse par ARN-Seq. Cette méthode permet d'étudier la biologie épidermique et les profils d'expression génique.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Cette recherche a été soutenue par l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Bourse de l’Université Radboud (H.Z.); et subvention du Conseil chinois des bourses d’études 201406330059 (J.Q.).

<ol><li>Hardman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+equivalents+for+studying+the+secrets+of+skin%3A+from+development+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease.</a> British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).</li>
<li>Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+differentiation+of+in+vitro+keratinocytes+requires+multifactorial+external+control%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control.</a> PLoS One. 8 (10), 77507(2013).</li>
<li>Van Ruissen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+normal+and+psoriatic+phenotypes+in+submerged+keratinocyte+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Induction of normal and psoriatic phenotypes in submerged keratinocyte cultures.</a> Journal of Cellular Physiology. 168 (2), 442-452 (1996).</li>
<li>Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+in+Skin+Regeneration%2C+Wound+Healing%2C+and+Their+Clinical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).</li>
<li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+equivalents%3A+skin+from+reconstructions+as+models+to+study+skin+development+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases.</a> British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).</li>
<li>Luis, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+epidermal+stem+cell+proliferation+and+senescence+requires+polycomb-+dependent+and+-independent+functions+of+Cbx4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4.</a> Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).</li>
<li>Mulder, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+epigenetic+strategies+interact+to+control+epidermal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation.</a> Nature Cell Biology. 14 (7), 753-763 (2012).</li>
<li>Poumay, Y., Pittelkow, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+density+and+culture+factors+regulate+keratinocyte+commitment+to+differentiation+and+expression+of+suprabasal+K1%2FK10+keratins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Cell density and culture factors regulate keratinocyte commitment to differentiation and expression of suprabasal K1/K10 keratins.</a> Journal of Investigative Dermatology. 104 (2), 271-276 (1995).</li>
<li>Kouwenhoven, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+p63+bookmarks+and+regulates+dynamic+enhancers+during+epidermal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcription factor p63 bookmarks and regulates dynamic enhancers during epidermal differentiation.</a> EMBO Rep. 16 (7), 863-878 (2015).</li>
<li>Qu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+p63+Affects+Epidermal+Cell+Identity+through+Rewiring+the+Enhancer+Landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape.</a> Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).</li>
<li>Brunner, H. G., Hamel, B. C., Van Bokhoven, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p63+gene+in+EEC+and+other+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">The p63 gene in EEC and other syndromes.</a> Journal of Medical Genetics. 39 (6), 377-381 (2002).</li>
<li>Browne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+altered+stability+and+transcriptional+activity+of+DeltaNp63+mutants+in+distinct+ectodermal+dysplasias%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Differential altered stability and transcriptional activity of DeltaNp63 mutants in distinct ectodermal dysplasias.</a> Journal of Cell Science. 124, Pt 13 2200-2207 (2011).</li>
<li>KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit">https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit</a> (2019).</li>
<li>Doyle, K. aM. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDoyle%2C+KaM+%22Protocols+and+applications+guide%22">Protocols and applications guide</a>. , Promega Corporation. Madison. (1996).</li>
<li>Roche. Hyperprep Kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html">https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html</a> (2019).</li>
<li>Felix Krueger. TrimGalore. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore">https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore</a> (2019).</li>
<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Ryan, D. Convert chromosome names in a bigWig file. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721">https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721</a> (2019).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GOrilla%3A+a+tool+for+discovery+and+visualization+of+enriched+GO+terms+in+ranked+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists.</a> BMC Bioinformatics. 10, 48(2009).</li>
<li>Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((clusterProfiler%3A+an+R+package+for+comparing+biological+themes+among+gene+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Omics%22%5BJournal%5D)">clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters.</a> Omics. 16 (5), 284-287 (2012).</li>
<li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+somatic+tissue+differentiation+by+the+long+non-coding+RNA+TINCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR.</a> Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).</li>
<li>Mullegama, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+Acid+Extraction+from+Human+Biological+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).</li>
<li>Ma, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+between+whole+transcript+and+3%27+RNA+sequencing+methods+using+Kapa+and+Lexogen+library+preparation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comparison between whole transcript and 3' RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods.</a> BMC Genomics. 20 (1), 9(2019).</li>
<li>Chao, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).</li>
<li>Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-Generation+Sequencing+RNA-Seq+Library+Construction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21(2014).</li>
<li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75(2017).</li>
<li>Oyola, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Illumina+next-generation+sequencing+library+preparation+for+extremely+AT-biased+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes.</a> BMC Genomics. 13, 1(2012).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+enzymes+for+amplifying+sequencing+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries.</a> Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms%3A+comparison+of+Ion+Torrent%2C+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13, 341(2012).</li>
<li>Ross, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+measuring+bias+in+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterizing and measuring bias in sequence data.</a> Genome Biology. 14 (5), 51(2013).</li>
<li>Soneson, C. ARMOR. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/csoneson/ARMOR">https://github.com/csoneson/ARMOR</a> (2019).</li>
<li>Sande, S. F. snakemake-workflows. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows">https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows</a> (2019).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce travail décrit une méthode pour induire la différenciation humaine de kératinocyte et la caractérisation suivante utilisant des analyses d’ARN-seq. Dans la littérature actuelle, beaucoup d’études sur la différenciation humaine de kératinocyte emploient deux autres méthodes, avec une concentration élevée de calcium ou avec le sérum comme méthodes pour induire la différenciation2,3,23. Un rapport précédent a soigneusement compa...

Les kératinocytes primaires humains dérivés de la peau humaine sont souvent utilisés comme modèle cellulaire pour étudier la biologie de l’épiderme1,2,3,4. La stratification de l’épiderme peut être modélisée par différenciation des kératinocytes, soit d’une manière monocouche immergée en 2D, soit par le modèle organotypique 3D de levage d’air2,3,5,6,7. Bien que les modèles 3D soient devenus de plus en plus importants pour évaluer la structure et la fonction épidermiques, les modèles de différenciation 2D sont encore largement utilisés, en raison de leur commodité et de la possibilité de générer un grand nombre de cellules pour les analyses.
Diverses conditions ont été appliquées pour induire la différenciation des kératinocytes en 2D, y compris l’ajout de sérum, une forte concentration de calcium, une température plus basse et l’inhibition des récepteurs du facteur de croissance épidermique2,3. Chacune de ces méthodes a été validée par un certain nombre de gènes marqueurs de différenciation des kératinocytes et s’est montrée efficace dans l’évaluation de la différenciation des kératinocytes, y compris dans des conditions pathologiques. Cependant, ces conditions d’induction montrent également des différences dans leur efficacité de différenciation et cinétique lorsque des panneaux spécifiques de gènes marqueurssont examinés 2,3.
Une de ces méthodes implique l’inhibition de contact de kératinocyte et l’épuisement des facteurs de croissance dans le milieu de culture8. Il a été démontré que les kératinocytes peuvent se différencier spontanément lorsque les cellules atteignent leur pleine densité.  L’exclusion des facteurs de croissance dans le milieu culturel peut encore améliorer la différenciation. La méthode combinant l’inhibition de contact et les facteurs de croissance appauvrissants a été montrée pour générer des kératinocytes différenciés avec des modèles d’expression de gène semblables à l’épiderme stratifié normal en utilisant plusieurs marqueurs épidermiques3,suggérant que ce modèle est approprié pour étudier la différenciation normale de kératinocyte. Récemment, deux analyses complètes d’expression génétique de la différenciation des kératinocytes à l’aide dece modèle ont été rapportées 9,10. Les chercheurs ont validé ce modèle au niveau moléculaire et ont montré qu’il peut être utilisé pour étudier la différenciation normale et maladie des kératinocytes.
Ce protocole décrit la procédure pour la méthode de différenciation in vitro et l’analyse moléculaire des cellules différenciées utilisant l’ARN-seq. Il illustre également la caractérisation du transcriptome des cellules le jour de différenciation 0 (stade de prolifération), le jour 2, le jour 4 et le jour 7 (différenciation précoce, moyenne et tardive, respectivement). Il est démontré que les kératinocytes différenciés affichent des modèles d’expression génétique qui ressemblent en grande partie à des cellules pendant la stratification épidermique. Pour examiner si cette méthode peut être employée pour étudier la pathologie de peau, nous avons appliqué le même pipeline expérimental et d’analyse pour étudier des keratinocytes portant des mutations du facteur de transcription p63 qui sont dérivés des patients présentant ectrodactyly, displasie ectodermale et cleft lip/palate (EEC) syndrome11,12. Ce protocole se concentre sur la différenciation in vitro des kératinocytes ainsi que sur l’analyse bioinformatique subséquente de l’ARN-seq. D’autres étapes de la procédure complète, telles que l’extraction de l’ARN, la préparation de l’échantillon d’ARN-seq et la construction de bibliothèques, sont bien documentées et peuvent être facilement suivies, en particulier lors de l’utilisation de nombreux kits commerciaux couramment utilisés. Par conséquent, ces étapes ne sont décrites que brièvement dans le protocole. Les données montrent que ce pipeline est approprié pour étudier les événements moléculaires pendant la différenciation épidermique chez les kératinocytes sains et maladies.

<table><tbody><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent</td><td>G2929BA</td><td></td></tr><tr><td>Extrait hypophysaire bovin (BPE)</td><td>Lonza</td><td></td><td>Part of the bulletKit</td></tr><tr><td>CFX96 RealTime System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>qPCR machine</td></tr><tr><td>Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance épidermique (EGF)</td><td>Lonza</td><td></td><td>Part of the bulletKit</td></tr><tr><td>Éthanolamine >= 98 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>Puces à ADN haute sensibilité</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Lonza</td><td></td><td>Partie du bulletKit</td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Lonza</td><td></td><td>Fait partie du bulletKit</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Kit</td><td>BioRad</td><td>170-8886</td><td></td></tr><tr><td>Synthèse de l’ADNc iScript</td><td>Bio rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>KAPA Library Quant Kit Roche</td><td></td><td>07960255001</td><td>Low concentration</td></tr> measure <tr><td>kit KAPA RNA HyperPrep Kit avec RiboErase</td><td>Roche</td><td>KK8540</td><td>RNAseq kit</td></tr><tr><td>KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit</td><td>Lonza</td><td>192060</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>deNovix</td><td>DS-11 FX (modèle)</td><td>Nanodrop et Qbit pour les mesures d’ADN et d’ARN</td></tr><tr><td>Codes-barres ADN NEXTflex -24</td><td>Illumnia</td><td>NOVA-514103</td><td>6 pb amorces longues</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>ARN Pico Chip</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr></tbody></table>

caractérisation de la différenciation in vitro des kératinocytes primaires humains par analyse arn-seq

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Les kératinocytes primaires humains sont souvent utilisés comme modèles in vitro pour des études sur la différenciation épidermique et les maladies connexes. Des méthodes ont été rapportées pour la différenciation in vitro des kératinocytes cultivés dans les manières submergées bidimensionnelles (2D) utilisant diverses conditions d’induction. Décrit ici est une procédure pour la méthode de différenciation in vitro de kératinocyte 2D par inhibition de contact et caractérisation moléculaire suivante par ARN-seq. En bref, les kératinocytes sont cultivés dans le milieu défini de kératinocyte complété avec des facteurs de croissance jusqu’à ce qu’ils soient entièrement confluents. La différenciation est induite par des contacts étroits entre les kératinocytes et encore stimulée par l’exclusion des facteurs de croissance dans le milieu. À l’aide d’analyses ARN-seq, il est démontré que les deux 1) kératinocytes différenciés présentent des signatures moléculaires distinctes lors de la différenciation et 2) le modèle dynamique d’expression des gènes ressemble en grande partie aux cellules pendant la stratification épidermique. En ce qui concerne la comparaison à la différenciation normale des kératinocytes, les kératinocytes porteurs de mutations du facteur de transcription p63 présentent une morphologie altérée et des signatures moléculaires, compatibles avec leurs défauts de différenciation. En conclusion, ce protocole détaille les étapes de la différenciation in vitro des kératinocytes 2D et de sa caractérisation moléculaire, en mettant l’accent sur l’analyse bioinformatique des données arn-seq. Étant donné que l’extraction de l’ARN et les procédures ARN-seq ont été bien documentées, ce n’est pas l’objet de ce protocole. La procédure expérimentale de différenciation in vitro des kératinocytes et du pipeline d’analyse bioinformatique peut être utilisée pour étudier les événements moléculaires lors de la différenciation épidermique chez les kératinocytes sains et maladies.

Différenciation normale des kératinocytes et analyse ARN-seq Dans cette expérience, des lignées de kératinocytes dérivées de cinq individus ont été employées pour la différenciation et les analyses d’ARN-seq. La figure 1 résume la procédure expérimentale de différenciation et les résultats de l’analyse ARN-seq. La figure 1A illustre un aperçu des procédures de différenciation in vitro des kératinocytes normaux et des changements de morphologie cellulaire au cours <strong ...

Présenté ici est une procédure stepwise pour la différenciation in vitro des kératinocytes primaires humains par inhibition de contact suivie de la caractérisation au niveau moléculaire par l’analyse d’ARN-seq.

Caractérisation de la différenciation in vitro des kératinocytes primaires humains par analyse ARN-Seq

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...

Dans ce protocole, nous décrivons une procédure contenant deux parties. Tout d’abord, une méthode de différenciation monocouche de kératinocyte 2D in vitro par inhibition de contact. Deuxièmement, sa caractérisation moléculaire par ARN-seq.La méthode de différenciation in vitro 2D est simple et facile à exécuter. Il peut être utilisé pour étudier la différenciation épidermique, surtout quand un grand nombre de cellules sont nécessaires. Par exemple, dans l’analyse épigénomique.Le pipeline détaillé d’analyse ARN-seq est clair et transparent pour les chercheurs ayant des compétences bioinformatiques de base, et il peut être utilisé pour n’importe quelle analyse en vrac de l’ARN-seq. Lorsque vous effectuez le protocole de différenciation pour la première fois, gardez à l’esprit que la densité d’ensemencement peut être délicate. Essayez plusieurs densités d’ensemencement pour savoir lequel fonctionne le mieux avec votre lignée cellulaire.Commencez par préparer le milieu de croissance des kératinocytes ou KGM et 500 millilitres chacun de milieu de prolifération et de différenciation selon les directions manuscrites. Graines kératinocytes primaires à une densité de 5 à 20.000 cellules par centimètre au carré et ajouter suffisamment de milieu de prolifération pour couvrir les cellules. Deux jours après l’ensemencement, rafraîchir les cellules avec le milieu de prolifération.Vérifiez régulièrement les cellules au microscope et rafraîchissez-vous moyen tous les deux jours. Lorsque les cellules atteignent 90% de confluence, induire la différenciation en changeant le milieu au milieu de différenciation. Pour recueillir les cellules pour d’autres analyses d’ARN, lavez les cellules deux fois avec DPBS, puis ajoutez le tampon de lyse.Recueillir les cellules les jours de différenciation zéro, deux, quatre et sept. Après l’isolement de l’ARN, l’ADND à double brin sera convertie et les bibliothèques d’ARN-seq seront préparées pour le séquençage de prochaine génération. Après le séquençage, les lectures de la séquence seront téléchargées et cartographiées sur le génome humain.Après le téléchargement et l’installation de paquets R, générer la table de compte à partir de readspergene.out. ongletz les fichiers et écrivez un fichier de données d’échantillon contenant tous les noms de fichiers, le jour de la différenciation et d’autres données d’échantillons pertinentes. Référez-vous aux fichiers de codage supplémentaires pour un exemple.Utilisez ensuite la table de comptage et les données de l’échantillon pour générer un objet deseq2 contenant à la fois les données dénombrées et les données de l’échantillon. Pour la normalisation de l’expression des gènes, normalisez la table de comptage de l’objet deseq2 en utilisant soit la normalisation deseq2RLD, soit la normalisation VST. Bien que la normalisation rld soit préférable, la normalisation du TVV est beaucoup plus rapide.Utilisez la fonction dist en R pour tracer la distance de l’échantillon en fonction des intensités normalisées du nombre de lecture, puis effectuez le clustering hclust en fonction de la distance de l’échantillon. Ensuite, tracez la carte thermique à l’aide de la fonction pheatmap. Enfin, générer une analyse des composants principaux ou une parcelle PCA des intensités normalisées du nombre de lecture en utilisant la fonction plotPCA de deseq2.PcA sert d’outil dans l’analyse exploratoire des données et peut être utilisé pour visualiser la distance et la connexion entre les différents échantillons. Effectuez une analyse d’expression génétique très variable avec la fonction rowVars qui extrait les 500 gènes les plus variables en commander sur la variance entre les échantillons à partir de différents points de temps. Ces gènes ont l’écart type le plus élevé de leur intensité normalisée à travers les jours de différenciation.Effectuez le clustering k-means sur les gènes hautement variables pour les regrouper par différents modèles d’expression. Visualisez les gènes dans une carte thermique avec le paquet pheatmap. L’intensité tracée dans la carte thermique est l’intensité normalisée deseq2 avec la valeur médiane soustraite.Générer une liste de gènes de fond exprimés qui comprend tous les gènes avec plus de 10 dénombrements dans un seul échantillon et faire une liste avec des gènes de chaque cluster. Enfin, effectuer l’analyse de l’ontologie génétique à l’aide de GOrilla. Utilisez la liste des gènes d’arrière-plan comme ensemble d’arrière-plan et la liste des gènes hautement variables dans les clusters comme cible, puis cliquez sur les termes GO enrichis de recherche.Alternativement, les utilisateurs R plus avancés peuvent utiliser le clusterProfiler de paquet pour automatiser l’analyse d’enrichissement à terme GO. Des lignées de kératinocytes dérivées de cinq individus ont été employées pour la différenciation dans des analyses d’ARN-seq. L’analyse principale de composant a prouvé que les kératinocytes subissant la différenciation avaient relié mais distincts profils globaux d’expression de gène.Des gènes très variables ont été regroupés pour visualiser la dynamique et les modèles d’expression génétique pendant la différenciation. Chaque groupe de gènes était représenté par les gènes caractéristiques de différenciation des kératinocytes et l’annotation de gene ontologie a montré une nette différence dans les fonctions génétiques. Dans la deuxième expérience, la morphologie cellulaire et les différences d’expression des gènes ont été comparées entre les kératinocytes provenant de contrôles sains et les lignées cellulaires dérivées de patients porteurs de mutations P63.L’analyse principale de composant a prouvé que les lignes de cellules de contrôle ont clairement suivi un modèle de différenciation, mais le modèle d’expression de gène des cellules mutantes pendant la différenciation reste en grande partie semblable à celui des cellules proliférantes ou indifférenciées. Dans l’analyse de clustering, les gènes dans le groupe un ont été downregulated dans les cellules témoins et partiellement downregulated dans les cellules patientes portant des mutations de R204W et de R279H, mais sont restés élevés dans les cellules portant R304W. Ces gènes jouent probablement un rôle dans la prolifération cellulaire, comme le montre l’analyse de Gene Ontology.Les gènes de la grappe deux ont d’abord été introduits, puis régulés dans les cellules de contrôle. Ces gènes sont probablement impliqués dans la différenciation des kératinocytes car les fonctions épidermiques de différenciation et de kératinisation ont été fortement enrichies pour ce cluster. Les gènes du groupe trois n’ont été induits qu’à la fin de la différenciation dans les cellules de contrôle, ce qui indique qu’ils peuvent jouer un rôle dans la couche la plus externe de l’épiderme.Lors de l’analyse des données arn-seq, il est important de savoir à l’avance à quoi s’attendre. Cela vous aidera à la fois à interpréter le contrôle de la qualité et le tracé pca et à évaluer si vos résultats sont logiques. Nos méthodes peuvent être utilisées pour étudier la transcription des gènes à la fois en biologie épidermique ainsi que dans d’autres systèmes biologiques.

characterization-vitro-differentiation-human-primary-keratinocytes

Research

Recherche

JoVE Journal

Genetics

Génétique

Un seul dosage de l'expression du gène cellulaire est nécessaire pour la compréhension des hétérogénéités de cellules souches.

Profilage individuel embryonnaires humaines Cellules souches par RT-PCR quantitative

Le profil des souches d'origine humaine pluripotentes (iPS), l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dérivées de l'homme induit-souches pluripotentes (iPS) (iPS-RPE), et RPE fœtale microARN (miARN), ont été comparés.

Profils MicroRNA d&#39;expression de cellules iPS humaines, l&#39;épithélium pigmentaire rétinien Derived From iPS, et fœtale épithélium pigmentaire rétinien

Cette vidéo montre les étapes de base pour effectuer une analyse du transcriptome entier sur des échantillons de moelle épinière embryonnaire de poussin disséqués après transfection avec électroporation in ovo.

ARN-Seq analyse de l&#39;expression génique différentielle dans électroporation embryon de poulet de la moelle épinière

Analyses ARN de séquençage et de bioinformatique ont été utilisés pour identifier les facteurs de transcription de manière significative et exprimés de manière différentielle dans des sous-populations Lin-CD34 + et CD34 Lin-des EMLcells de souris. Ces facteurs de transcription peuvent jouer un rôle important dans la détermination de l'interrupteur entre les cellules Lin-CD34 auto-renouvellement Lin-CD34 + et partiellement différenciés.

Identification des facteurs clés de régulation auto-renouvellement et de différenciation dans les cellules hématopoïétiques précurseurs EML par l&#39;analyse de l&#39;ARN-séquençage

Ce manuscrit fournit une procédure étape par étape pour la dérivation et la maintenance des kératinocytes humains à partir de cheveux épilés et la génération ultérieure de cellules souches pluripotentes humaines induites par intégration (hiPSC) sans intégration par des vecteurs épisomiques.

Génération de l&#39;intégration sans anthropiques cellules souches pluripotentes utilisant des kératinocytes cheveux dérivés

Ici, nous présentons un protocole pour générer efficacement des cellules trophoblastiques humaines à partir de cellules souches pluripotentes humaines en utilisant la protéine morphogénique osseuse 4 et des inhibiteurs des voies Activin/Nodal. Cette méthode est adaptée à la différenciation efficace des cellules souches pluripotentes humaines et peut générer de grandes quantités de cellules pour la manipulation génétique.

In Vitro Différenciation des cellules souches pluripotentes humaines en cellules trophoblastiques

La peau agit comme une première ligne de défense contre l’environnement externe. Nous présentons une méthode pour isoler des kératinocytes humains primaires de peau adulte. Ces kératinocytes isolés sont utiles dans nombreuses configurations expérimentales et sont un modèle très approprié pour l’étude des mécanismes moléculaires de la biologie cutanée in vitro.

Génération et culture de kératinocytes humains primaires de peau adulte

Nous présentons ici un protocole pour isoler efficacement les kératinocytes humains primaires provenant de tissus de la peau adulte. Cette méthode simplifie la procédure conventionnelle en utilisant le Y-27632 inhibiteur ROCK dans le milieu de l’inoculation pour séparer spontanément les cellules épidermiques des cellules dermiques.

Une méthode simple et efficace d’isoler des kératinocytes humains primaires provenant de tissus de la peau adulte

L’identification des interactions physiques entre les gènes et les éléments de régulation est difficile, mais a été facilitée par les méthodes de capture de conformation du chromosome. Cette modification du protocole 4C-seq atténue la partialité de la PCR en réduisant au minimum l’amplification excessive des modèles PCR et maximise la mappability se lit en y incorporant une étape digest d’enzyme de restriction addition.

High-throughput Identification des séquences régulatrices du gène à l’aide de prochaine génération séquençage du Chromosome circulaire Conformation Capture (4C-seq)

Ce protocole montre comment purifier les microARN extracellulaires de milieux de culture cellulaire pour petite construction de bibliothèque de RNA et de séquençage de la génération suivant. Différents points de contrôle de contrôle de la qualité sont décrites pour permettre aux lecteurs de comprendre à quoi vous attendre lorsque vous travaillez avec des échantillons d’entrée faibles comme exRNAs.

Isoler, séquençage et l’analyse des microARN extracellulaires de cellules souches mésenchymateuses humaines

Nous décrivons ici un protocole pour la culture systématique de sphéroïdes épidermiques en culture en suspension 3D. Ce protocole a de nombreuses applications pour une utilisation dans une variété de types de tissus épithéliaux et pour la modélisation de plusieurs maladies et affections humaines.

Établir un système de culture de sphéroïdes épidermiques à haut débit pour modéliser la plasticité des cellules souches kératinocytes

Découvrez la différenciation in vitro des kératinocytes primaires humains par inhibition de contact et son analyse par ARN-Seq. Cette méthode permet d'étudier la biologie épidermique et les profils d'expression génique.

Caractérisation de la différenciation in vitro des kératinocytes primaires humains par analyse ARN-Seq

Explorer plus de vidéos