Génération d’Oligodendrocytes et de médium conditionné par oligodendrocyte s’est conditionné pour les expériences de co-culture

Nous décrivons une méthode efficace de purification et de culture oligodendroglial de cellules de lignée. Cela permet d’aborder les mécanismes moléculaires contrôlant la différenciation des oligodendrocytes et leurs interactions avec les neurones pendant le processus de myélinisation. Cette technique de secousse n’est pas coûteuse et est optimale pour obtenir une grande quantité d’oligodendrocytes.

De telles cultures permettent la production de moyennes et de co-cultures d’oligodendrocytes conditionnés par oligodendrocytes avec des neurones. La sclérose en plaques est une maladie causée par la dé myélinisation focale dans le système nerveux central, secondaire à la perte d’oligodendrocytes. La culture oligodendrocytes fournit un outil pour mieux comprendre comment promouvoir la re-myélinisation.

Seule la culture cellulaire oligodendroglial pourrait fournir un aperçu des mécanismes intrinsèques régulant les développements et la biologie des oligodendrocytes. Les co-cultures avec les neurones permettent d’avoir un aperçu de leurs impacts sur la physiologie neuronale. Pour commencer, utilisez des forceps incurvés pour maintenir la tête de l’animal au niveau des yeux.

Utilisez de petits ciseaux chirurgicaux pour faire une petite incision à la base du crâne et couper le crâne en suivant la ligne médiane du cerveau. Utilisez des forceps pour décoller doucement les deux parties du crâne de la ligne médiane. Utilisez une petite cuillère chirurgicale pour enlever le cerveau de la cavité de la tête.

Mettez le cerveau dans une boîte petri de 60 millimètres contenant du glucose PBS froid sur la glace. Visualisation au microscope stéréo, utilisez des forceps fins pour enlever le cervelet, le tronc cérébral et les bulbes olfactifs des hémisphères cérébraux. Utilisez des forceps fins pour séparer les deux hémisphères cérébraux.

Utilisez des forceps fins pour décoller les méninges. Mettez les cortices cérébraux dans une boîte de Pétri de 60 millimètres sur la glace. Dans une hotte d’écoulement laminaire, utilisez un scalpel pointu pour hacher finement les cortices cérébrales.

Transférer le tissu haché dans un tube de 50 millilitres contenant un milieu de digestion enzymatique. Incuber pendant 30 minutes dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone. Après cela, utilisez une pipette pour enlever doucement le milieu de digestion enzymatique tout en s’assurant que le tissu cortical reste au fond du tube.

Utilisez une micropipette P1000 pour ajouter un millilitre de sérum de veau fœtal DMEM à 10 % et triturer doucement le tissu. Utilisez un filtre de 70 microns et le piston d’une seringue d’un millilitre pour filtrer le tissu cortical dans un tube de 50 millilitres. Rincez le tissu résiduel sur la paroi du tube intérieur du tube de 50 millilitres à plusieurs reprises avec du sérum de veau fœtal DMEM à 10 %.

Remplissez le tube de 50 millilitres avec du sérum de veau fœtal DMEM à 10 %. Centrifugeuse à 423 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Retirez soigneusement le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire avec deux millilitres de sérum de veau Fœtal DMEM à 10 %.

Triturer délicatement la pastille cellulaire avec la micropipette P1000, puis, avec la micropipette P200. Diluer la suspension cellulaire avec le volume approprié de sérum de veau fœtal DMEM 10%. Plaque cinq millilitres de la suspension cellulaire sur un flacon T-150 à une densité d’une fois 10 à la cinquième cellule par centimètre carré.

Ajouter 20 millilitres de sérum chaud de veau fœtal DMEM 10% à chaque flacon T-150. Incuber dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone. Après avoir secoué l’échantillon pendant la nuit à 250 rpm et 37 degrés Celsius, récoltez le supernatant dans le flacon contenant principalement des cellules de lignée oligodendrocytes, mais aussi, certaines cellules microgliales, et plaquez-le sur des boîtes petri non enduites de 100 millimètres.

Incuber les boîtes de Pétri pendant 15 minutes dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Cela permet l’élimination des cellules microgliales par adhérence rapide différentielle sur la surface du plat. Entre-temps, remplissez chaque flacon T-150 de 25 millilitres de milieu de culture chaud et fraîchement préparé et incubez dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à la deuxième secousse.

Ensuite, transférez le supernatant des boîtes de Petri dans de nouvelles boîtes petri non enrobées de 100 millimètres pour permettre l’adhérence des cellules microgliales résiduelles. Incuber les boîtes de Pétri pendant 15 minutes dans un incubateur humidifié à 37 Degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone. Retirez le supernatant de toutes les deux boîtes de Petri, qui contiennent des cellules de lignée oligodendrocytes non adhérentes, et transférez-le dans un tube de 50 millilitres.

Jeter les boîtes de Pétri plaquées avec des microglies. Centrifuger les tubes pendant cinq minutes à 423 fois g. Retirez soigneusement le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire avec un millilitre de milieu Bottenstein-Sato.

Mettre en commun toutes les granulés dans un tube commun de 50 millilitres et ajuster le volume à 20 ou 30 millilitres selon la densité cellulaire avec bottenstein-sato moyen. Plaque deux ou trois boîtes de Pétri précoated de 100 millimètres avec 10 millilitres de la suspension cellulaire. Incuber dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone.

Deux heures plus tard, déblayer les débris des boîtes de Pétri en rafraichissant tout le milieu Bottenstein-Sato. Incuber pendant deux jours dans le milieu dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone. Après deux jours, examiner la culture au microscope.

Dans un capot d’écoulement laminaire, dans des conditions stériles, renouveler le milieu de culture avec 10 millilitres de chaud MPB-27 faible milieu. Incuber pendant deux jours dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone. Pour récolter l’OCM, recueillir le supernatant contenant des oligodendrocytes sécrété des facteurs.

Filtrez stériliser l’OCM à l’aide d’un filtre de 0,22 micron. Dans ce protocole, les cellules de lignée d’oligodendrocyte ont été purifiées des cultures gliales en secouant outre des astrocytes et des microglies. L’analyse de l’expression de différents marqueurs a indiqué que les cultures d’oligodendrocytes étaient principalement des cellules positives pré-oligodendrocytes avec 90 plus ou moins 4% des cellules positives d’O4, 85 cellules positives plus ou moins 7%NG2, et 4.7 plus ou moins 2.1%des cellules positives de PLP, alors que 7.2 plus ou moins 2.5% des cellules étaient des astrocytes positifs de GFAP.

OCM produit à partir de telles cultures ont été ajoutés à trois jours in vitro pour les cultures purifiées de neurones hippocampaux. Ce traitement favorise le regroupement des protéines notales. La myélinisation des neurones hippocampaux a été étudiée par l’ajout d’oligodendroctyes à 14 jours in vitro.

De 20 à 24 jours in vitro, la coloration immuno des marqueurs de myéline, comme la protéine de base de la myéline, a permis la visualisation des segments de myéline et des nœuds de Ranvier. PBS de base est important pour l’enlèvement des méninges. La clairière rapide est essentielle pour la viabilité des oligodendroctyes et la réalisation des forces du flux appliqué avec la pipette.

Le milieu oligodendrocyte-conditionné peut être ajouté aux cultures neuronales pour obtenir l’aperçu de l’impact des oligodendroctyes facteurs sécrétés sur la physiologie neuronale. Des co-cultures d’oligodendroctyes avec des neurones peuvent également être exécutées pour étudier le processus de myélinisation.