Une méthode de dépistage pour l’identification des médicaments favorisant l’hétérochromatine à l’aide de Drosophila
12 mars 2020
Drosophila est un modèle expérimental largement utilisé adapté aux médicaments de dépistage avec des applications potentielles pour la thérapie contre le cancer. Ici, nous décrivons l’utilisation des phénotypes variés de couleur d’oeil de Drosophila comme méthode pour le criblage des composés de petites molécules qui favorisent la formation d’hétérochromatine.
Actuellement, il n’existe aucun médicaments qui sont bien établis dans la promotion de la formation hétérochromatine. Ici, nous présentons une méthode simple et efficace pour identifier les composés de petites molécules qui favorisent ce processus. Notre protocole de dépistage fournit un système in vivo simple, peu coûteux et facile à suivre pour l’identification des médicaments favorisant l’hétérochromatine.
L’identification des composés qui favorisent la formation d’hétérochromatine peut mener à la découverte des mécanismes du cancer qui résédent et de la thérapie de cancer. Ce rapport coût-efficacité a été mesuré pour identifier les composés de promotion de l’hétérochromatine dans Drosophila pourrait également être utilisé pour compter les coups de forme car il s’agit d’une mesure préventive à un plus grand bassin cellulaire de dépistage cellulaire. Notre protocole de criblage pourrait également être utile pour les écrans pilotes rapides car ce système Drosophila TranSheet produit un phénotype de couleur des yeux panaché qui est inversement corrélé à la quantité d’hétérochromatine présente à la mouche.
Kenny Dao, un étudiant de premier cycle de notre laboratoire, aidera à démontrer la procédure. Après avoir identifié et préparé une bibliothèque de médicaments pour un dépistage à l’aide d’un solvant approprié, et la concentration désirée, traverser trois mouches mâles avec trois mouches femelles vierges ou plus dans un flacon alimentaire de 25 par 95 millimètres. Avec neuf millimètres de milieu alimentaire standard de Drosophila.
Configurer trois flacons réplique pour chaque médicament. Ajoutez un flacon de commande pour l’écran. Et permettre aux mouches de pondre des œufs pendant deux jours à température ambiante.
Le deuxième jour de la croix, anesthésier les mouches avec une courte rafale de dioxyde de carbone. Et jeter les mouches parent dans une bouteille contenant 70% d’éthanol. Ensuite, diluer chaque composé médicamenteuse du stock initial pour assister à la concentration finale de micro molaire dans 33%DMSO dans l’eau.
Et ajouter 60 microlitres de la drogue, ou le contrôle 33%DMSO seul, sur le dessus de la nourriture à la mouche. Ensuite, confirmez qu’aucune mouche parente n’est présente dans les flacons. Et ajouter la solution médicamentine aux flacons appropriés.
Deux jours après l’émergence des mouches F1, transférer les mouches anesthésiées d’un flacon à la fois sur une plaque poreuse de dissectation avec du dioxyde de carbone filtrant à travers sous le papier filtre. Sous un microscope disséquant, examinez chaque mouche entière, identifiant tous les mâles hétérozygotes par leur absence du phénotype bouclé d’aile bouclée o-dominante. Marquer la couleur des yeux de chaque mâle hétérozygotes sur une échelle de un à cinq.
Avec un score d’un étant attribué à une surface totale dispersée inférieure à 5%rouge. Ajouter un score de deux aux mouches avec une surface totale de 6 à 25% des yeux rouges. A trois à voler avec une surface totale de 26 à 50% d’oeil de tache rouge.
A quatre à voler avec une surface totale de 51 à 75% d’oeil de tache rouge. Et un cinq mouches avec une surface totale de l’œil tache plus de 75% rouge. Calculez ensuite l’indice de couleur moyen de tous les mâles de chaque flacon marqué en triplicate.
Pour confirmer que les composés favorisent en effet la formation d’hétérochromatine, une technique de validation différente, telle que le ballonnement occidental, peut être exécutée. Dans cette expérience représentative, une petite bibliothèque de médicaments à molécule, l’oncologie set 3, qui est composé de 97 médicaments d’oncologie autorisés par la FDA, a été examinée à l’aide de la souche DX1 de Drosophila Melanogaster. Selon l’analyse de dépistage, le méthotrexate, codé comme E7 dans la bibliothèque, a causé la plus grande variation au sein de la souche Dx1.
Suggérant que le méthotrexate pourrait être le médicament le plus prometteur de promotion de l’hétérochromatine pour la thérapie ciblée contre le cancer futur. Pour confirmer davantage que ce composé favorise la transformation hétérochromatine, des données occidentales de tache ont été exécutées. Démontrer la régulation vers le haut de la protéine associée à l’hétérochromatine formatine, la triméthylation H3K9, et la validation des résultats de dépistage.
L’étape critique consiste à marquer la couleur des yeux de chacun des blancs 11-18 DX1 hétérozygotes mouches mâles sur une échelle de un à cinq selon un itinéraire d’étude prédéterminé. Nous pouvons utiliser des taches occidentales ou immunostaining pour confirmer les coups. La découverte de composés soupçonnés de favoriser la formation d’hétérochromatine peut également mener à la découverte du mécanisme génétique IV du développement du cancer et des essais cliniques chez les patients humains.
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Aperçu
Cette étude présente une méthode de criblage de composés de petite taille qui favorisent la formation d'hétérochromatine en utilisant Drosophila. L'approche exploite les phénotypes de couleur d'œil variegée comme indicateur des niveaux d'hétérochromatine, offrant ainsi un système simple et efficace in vivo pour l'identification de médicaments.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Écran de médicaments
- Génétique
Contexte
- L'hétérochromatine joue un rôle crucial dans la régulation des gènes et la fonction cellulaire.
- Les méthodes actuelles visant à favoriser la formation de l'hétérochromatine sont limitées.
- Drosophila constitue un organisme modèle efficace pour les études génétiques.
- Les phénotypes de couleur d'œil variegée peuvent indiquer les niveaux d'hétérochromatine in vivo.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode rentable pour identifier des composés favorisant la formation d'hétérochromatine.
- Utiliser Drosophila comme modèle pour le criblage de médicaments potentiels en thérapie anticancéreuse.
- Mettre en place un protocole facile à suivre et peu coûteux.
Méthodes utilisées
- Test de composés de faible masse moléculaire chez Drosophila.
- Évaluation des phénotypes de couleur des yeux comme indicateur de la présence d'hétérochromatine.
- Mise en œuvre d'un protocole de criblage in vivo simple.
- Analyse de la corrélation entre la couleur des yeux et les niveaux d'hétérochromatine.
Résultats principaux
- Le protocole de criblage a permis d'identifier avec succès des composés favorisant la formation d'hétérochromatine.
- Les phénotypes de couleur des yeux variegés étaient corrélés à la quantité d'hétérochromatine.
- La méthode s'est révélée efficace et rentable pour l'identification de médicaments.
- Les implications potentielles pour la thérapie anticancéreuse ont été discutées.
Conclusions
- Cette étude propose une nouvelle approche pour le criblage de médicaments en recherche sur le cancer.
- Drosophila peut être utilisé efficacement pour identifier des composés favorisant l'hétérochromatine.
- Les résultats pourraient contribuer à la compréhension des mécanismes et des thérapies du cancer.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Cette méthode fournit un système in vivo rentable permettant d'identifier des composés favorisant l'hétérochromatine, comblant ainsi une lacune dans la découverte de médicaments épigénétiques pour le traitement du cancer. En exploitant la varégation oculaire de Drosophila comme lecture quantitative, elle permet une validation précoce des cibles et une réduction des risques mécanistiques liés aux mécanismes épigénétiques. Cette approche renforce la confiance prédictive dans l'identification de candidats prometteurs et le tri de portefeuilles pour les programmes de découverte axés sur l'oncologie.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet d'interroger des hypothèses thérapeutiques liées à la formation de l'hétérochromatine et à la régulation épigénétique dans le cancer.
- Valeur opérationnelle : Fournit un système simple et peu coûteux in vivo pour la validation fonctionnelle de cibles d'effecteurs épigénétiques.
- Valeur prédictive : Contribue à l'atténuation des risques biologiques en reliant les effets des composés à des modifications des protéines associées à l'hétérochromatine, telles que la triméthylation de H3K9.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des scores quantitatifs de couleur oculaire (1–5) corrélés aux niveaux d'hétérochromatine pour la priorisation de composés.
- Valeur opérationnelle : Propose un protocole standardisé et reproductible utilisant l'évaluation en triple exemplaire de flacons et le calcul de l'indice moyen de couleur.
- Préparation du test : Permet une évaluation fiable des composés dans un système pertinent pour la maladie avec une infrastructure minimale.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur translationnelle : Relie les découvertes chez Drosophila aux mécanismes du cancer humain par le biais de voies épigénétiques conservées.
- Continuité préclinique : Soutient les décisions d'orientation fondées sur le risque en validant les résultats positifs par des méthodes orthogonales telles que le western blot.
- Réduction du risque mécanistique : Permet d'élucider les mécanismes épigénétiques du développement du cancer grâce à des composés promoteurs de l'hétérochromatine identifiés.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans les étapes précoces de découverte jusqu'à l'identification de candidats, en fournissant des données de criblage épigénétique qui orientent la progression du « hit » au « lead » dans les programmes en oncologie.
- Découverte en biologie : Soutient la vérification d'hypothèses sur des cibles épigénétiques et la clarification des voies grâce à des lectures de formation d'hétérochromatine.
- Écrans de sélection : Fournit des systèmes biologiques prêts à l'emploi produisant des résultats quantitatifs et évolutifs pour l'évaluation de bibliothèques de composés.
- Analyse : Permet des comparaisons fondées sur les données au moyen de l'indice de couleur moyen et de l'analyse statistique des résultats provenant de trois réplicats de flacons.
- Recherche translationnelle : S'intègre à la validation préclinique en confirmant les résultats positifs à l'aide de biomarqueurs protéiques de l'hétérochromatine.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme de criblage épigénétique réutilisable pour plusieurs classes de cibles en oncologie.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique liée à la régulation épigénétique.
- Valeur opérationnelle : Assure la standardisation, la reproductibilité et l'évolutivité grâce à un scoring simple in vivo et à des tests répétés.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'orientation (go/no-go), l'efficacité du capital et réduit les risques biologiques en phase avancée dans la découverte de médicaments épigénétiques.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation et une avancée ajustées au risque des composés selon leur activité favorisant l'hétérochromatine.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en génétique de Drosophila et en manipulation de composés pour la préparation de la bibliothèque.
- Requiert un microscope de dissection standard et des outils d'analyse pour le phénotypage de la couleur des yeux.
- Exige une standardisation entre équipes pour une mise en place uniforme des flacons, un analyse cohérent et une interprétation constante des données.
- Implique des considérations d'adaptation lors de l'extension à d'autres systèmes modèles ou classes de composés.
- Comprend des limites pratiques telles que la subjectivité de l'analyse et la nécessité d'une validation orthogonale des résultats positifs.
