Name: Analyse des malformations cardiaques congénitales chez les embryons de souris à l’aide de méthodes histologiques qualitatives et quantitatives (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Découvrez des techniques d'analyse tissulaire standardisées pour étudier les malformations cardiaques congénitales chez la souris. Ces méthodes qualitatives et quantitatives améliorent le diagnostic cardiaque.

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Le laboratoire Aguirre est soutenu par le National Heart, Lung, and Blood Institute des National Institutes of Health sous le numéro d’attribution K01HL135464 et par l’American Heart Association sous le numéro de prix 19IPLOI34660342.

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Les auteurs n’ont aucune divulgation à signaler.

Ce protocole explore les techniques impliquées dans l’analyse du développement cardiaque dans les cœurs embryonnaires. Certaines limites de cette méthode sont la dextérité physique requise pour les techniques préparatoires, qui peuvent nécessiter la pratique, et la compétence avec l’imagerie au microscope. Si les tranches obtenues au cryostat sont désordonnées, la coloration de l’hématoxyline et de l’éosine ne sera pas claire, ou si les images prises au microscope ont un mauvais éclairage, alors la méthode utilisée avec ...

Les CHD sont le type de malformation congénitale le plus courant chez l’homme et sont la principale cause de décès liés aux malformations congénitales1,2,3,4,5,6. Bien qu’environ 90 % des nouveau-nés survivent à la coronaropathie, il est souvent associé à une morbidité et à des interventions médicales importantes au fil des ans, imposant un lourd fardeau à la vie des patients et au système de santé7,8,9,10. En dehors des facteurs purement génétiques, les causes de la coronaropathie sont malcomprises 4. Les causes non identifiées représentent 56-66% de tous les cas de CORONA selon l’American Heart Association et d’autres sources2,3,4,11. Les facteurs bien connus comprennent les mutations génétiques, les VNC, les variantes de nucléotide unique de novo et l’aneuploidy. On soupçonne que les facteurs environnementaux et diététiques sont également des sources importantes contribuant à la CORONA, comme le suggèrent des études épidémiologiques liant le mode de vie maternel2,12, la privation économique, et la race13, et par la recherche sur des facteurs alimentaires tels que l’acide folique11,14 et l’acide rétinoïque des lipides bioactifs15,16. Il est important d’étudier les mécanismes et les causes de la coronaropathie et d’autres défauts cardiovasculaires pour élaborer des stratégies préventives et de nouvelles options thérapeutiques1,4,17,18,19.
La souris en développement est un modèle de pierre angulaire pour l’étude du CHD chez les mammifères. Cependant, certaines des méthodes et des analyses utilisées, telles que les dissections préservant la morphologie cardiaque, l’analyse des stades de développement et l’identification des défauts associés au CHD, peuvent être intimidantes pour les scientifiques qui sont nouveaux à l’analyse des cœurs murins. L’objectif des méthodes décrites dans ce protocole est d’offrir des lignes directrices qualitatives et quantitatives pour ces processus. Ainsi, dans ce protocole, nous expliquons comment effectuer des accouplements chronométrés pour produire des embryons du stade gestationnel désiré, disséquent les femelles enceintes pour le rétablissement intact du cœur (y compris les tissus associés tels que le tractus), la fixation du cœur et la préparation pour section cryostat, méthodes d’histologie de base, analyses quantitatives des défauts cardiaques communs, et analyse qualitative du compaction de muscle cardiaque, un phénotype précurseur commun à certains types de CHD.

<table><tbody><tr><td>15 mL Tube(s) conique(s)</td><td>Fisher Scientific</td><td># 1495970C</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Souris</td><td>Jackson Labs</td><td>C57BL/6J - stock 000664</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Staining Jars (x6)</td><td>VWR Scientific</td><td># 25457-006</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles 24X50MM #1.5</td><td>VWR Scientific</td><td># 48393-241</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat - Leica CM3050S</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Plat(s) de dissectionFisher</td> <td>Scientific</td><td># 50930381</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - Pinces fines (x2)</td><td>Outils de sciences fines</td><td># 11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y Solution</td><td>Millipore Sigma</td><td># HT110116-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Alcool éthylique (pur, 200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td># BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>Millipore Sigma</td><td># E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Millipore Sigma</td><td># 03989-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux fins</td><td>Outils scientifiques fins</td><td># 14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope fluorescent Leica M165 FC</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Millipore Sigma</td><td># 410225-250G</td><td></td></tr><tr><td>Graefe</td><td>Forceps Outils scientifiques fins</td><td># 11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism 8 Software</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td># 06666A</td><td></td></tr><tr><td>Mayer’s hematoxylin solution</td><td>Millipore Sigma</td><td># MHS16-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Pointe(s) de micropipette - p200</td><td>Fisher Scientific</td><td># 02707448</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel Software</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>VWR Scientific</td><td># 102094-106</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Olympus CkX53</td> Pinceaux <td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(au moins 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>VWR Scientific</td><td># 0215014601</td><td>Transformer en solution à 4 % (dissoute dans PBS)</td></tr><tr><td>Pipette(s) PasteurFisher</td> <td>Scientific</td><td># 13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td># 15140122</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td># 70011044</td><td>Diluer de 10x à 1x avant d’utiliser</td></tr><tr><td>Scale</td><td>Mettler Toledo</td><td># MS1602TS</td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Mettler Toledo</td><td># MS105</td><td></td></tr><tr><td>Manche de scalpel #3</td><td>VWR Scientific</td><td># 10161-918</td><td></td></tr><tr><td>Lames de scalpel</td><td>VWR Scientific</td><td># 21909-612</td><td></td></tr><tr><td>Moule carré</td><td>VWR Scientific</td><td># 100500-224</td><td>Pour moules OCT</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Millipore Sigma</td><td># S9378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Lames</td><td>Fisher Scientific</td><td># 1255015</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux</td><td>Outils scientifiques fins</td><td># 14002-14</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Accu-Edge Lames de microtome jetables</td><td>VWR Scientific</td><td># 25608-964</td><td></td></tr><tr><td>Balance de voyage</td><td>Acculab</td><td>VIC 5101</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Millipore Sigma</td><td>214736-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse des malformations cardiaques congénitales chez les embryons de souris à l’aide de méthodes histologiques qualitatives et quantitatives

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

Les malformations cardiaques congénitales (CHD) sont le type de malformation congénitale le plus courant chez l’homme, affectant jusqu’à 1 % de toutes les naissances vivantes. Cependant, les causes sous-jacentes de la coronaropathie sont encore mal comprises. La souris en développement constitue un modèle précieux pour l’étude de la coronaropathie, parce que les programmes de développement cardiaque entre les souris et les humains sont fortement conservés. Le protocole décrit en détail comment produire des embryons de souris du stade gestationnel souhaité, méthodes d’isolement et de préservation du cœur pour le traitement en aval, méthodes quantitatives pour identifier les types courants de CORONA par histologie (p. ex., septale ventriculaire défauts, défauts septaux auriculaires, brevets ductus arteriosus), et méthodes quantitatives d’histomorphométrie pour mesurer les phénotypes musculaires communs de compaction. Ces méthodes articulent toutes les étapes impliquées dans la préparation, la collecte et l’analyse de l’échantillon, permettant aux scientifiques de mesurer correctement et de façon reproductible la coronaropathie.

L’indice de compactage musculaire a été comparé entre les cœurs se développant sous deux environnements différents, un contrôle et un groupe expérimental. Ces protocoles ont été utilisés pour analyser le compactage du tissu musculaire quantitativement, ce qui a permis l’analyse statistique. Le compactage de muscle s’est avéré sensiblement réduit dans les coeurs expérimentaux par rapport aux embryons qui se sont développés dans des conditions non expérimentales.
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Dans ce protocole, nous décrivons des procédures pour analyser qualitativement et quantitativement des phénotypes développementaux chez les souris associées aux défauts congénitaux de coeur.

Analyse des malformations cardiaques congénitales chez les embryons de souris à l’aide de méthodes histologiques qualitatives et quantitatives

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...

Ce protocole normalise de nouvelles techniques d’analyse tissulaire afin qu’elles puissent être plus largement utilisées par d’autres groupes qui étudient également les malformations cardiaques congénitales. Comme les techniques d’analyse qualitative et quantitative ont leurs avantages et leurs inconvénients, cette méthodologie utilise les deux pour répondre à la plus large gamme de questions expérimentales. Ces techniques peuvent avoir un impact positif sur les méthodes de diagnostic cardiologie.Par exemple, les pathologistes pourraient appliquer nos techniques microscopiques d’analyse des tissus cardiaques pour diagnostiquer les maladies cardiaques humaines à partir d’échantillons de biopsie. Ce protocole peut être utilisé pour la cardiologie développementale ou la recherche en cardiologie générale. Cependant, ces méthodes fournissent également diverses techniques utiles qui peuvent être appliquées à n’importe quelle analyse tissulaire.Pour recueillir le jour embryonnaire 15 à 15.5 coeurs, fixez les membres d’une mère enceinte et commençant autour de l’urètre jusqu’au sternum, faites soigneusement une incision en forme de I le long du torse. À l’aide de forceps dans un mouvement de scooping, soulevez doucement l’utérus hors de la cavité abdominale saisissant les tissus superficiels de l’utérus si nécessaire avec des forceps fins pour aider à l’extraction. Utilisez des ciseaux pour libérer l’utérus de l’abdomen.Après avoir trempé l’utérus dans du PBS glacé, épinglez l’organe dans un plat de dissection. À l’aide de ciseaux, couper l’utérus en sections individuelles contenant chacune un embryon distinct. À l’aide de deux paires de forceps fins, peler délicatement les embryons du tissu utérin et les placer dans une nouvelle boîte de Pétri contenant quatre degrés Celsius PBS-EDTA.Pour recueillir les cœurs, placez le plat sous un microscope disséquant et utilisez deux paires de forceps fins pour positionner l’embryon dans la position de supination. Après avoir stabilisé l’accès à la poitrine, utilisez le point pointu d’une deuxième paire de forceps fins pour faire une incision le long du sternum de l’embryon s’étendant entre les clavicules jusqu’au nombril. Faire des incisions très fines et superficielles tout en travaillant progressivement vers l’intérieur de la cavité thoracique, ouvrir l’abdomen de l’embryon.Lorsque le cœur devient visible, utilisez une paire de forceps pour presser le torse légèrement dorloté à la cage thoracique pour peler les côtes ouvertes. À l’aide des côtés d’une paire de forceps, saisir délicatement les vaisseaux sanguins pulmonaires sans séparer le tissu et sortir le cœur de la cavité. Nettoyez le cœur en PBS-EDTA frais pendant une à deux minutes avant de fixer le tissu en 4%Paraformaldéhyde pendant 45 à 60 minutes.Ensuite, laver le cœur trois fois pendant 5 à 10 minutes par lavage en PBS complété par de la glycine. Avant de stocker les cœurs en PBS à quatre degrés Celsius. Pour préparer le cœur à la cryosection, placez les échantillons dans un tube de 30% saccharose et PBS à quatre degrés Celsius pendant 24 à 40 heures.Lorsque les cœurs ont coulé au fond du tube, utilisez une pipette Pasteur avec une pointe modifiée pour transférer soigneusement chaque cœur à un morceau d’essuie-glace sans peluche. Après un bref séchage à l’air, placez chaque échantillon dans des moules de température de coupe optimaux individuels dans les orientations souhaitées pour la section. Submergez les tissus dans un milieu de température de coupe optimal sans bulles.Ensuite, conservez les moules à 20 degrés Celsius jusqu’à quelques jours avant de congeler les tissus à 80 degrés Celsius pendant au moins 24 heures avant la cryosection. Pour obtenir des sections cryostat des échantillons, utilisez un milieu de coupe de température optimal frais pour fixer le bloc d’intérêt tissulaire au mandrin du cryostat et permettre au milieu de geler jusqu’à ce qu’il soit blanc opaque. Insérez une nouvelle lame et ajustez la distance entre le bloc tissulaire et la lame pour permettre d’obtenir des sections.Couper le bloc en tranches de 10 micromètres jusqu’à ce que le point d’intérêt soit atteint. Lorsque le tissu peut être observé, utilisez un petit pinceau plat pour tirer doucement la tranche contre le support dans un mouvement continu de coupe. Une fois que le tissu a été complètement coupé à travers, utilisez la brosse de détail pour tapoter la tranche à plat contre la scène.Maintenez la section en place pendant environ 20 à 30 secondes avant d’enlever la brosse détaillée et de terminer la tranche. Utilisez les deux pinceaux pour aplatir doucement la tranche contre la scène empêchant tout roulement et maintenez la section tissulaire contre la scène. Après 20 à 30 secondes, retournez la section et aplatissez-la à nouveau contre la scène avant de placer une glissière chargée électrostatiquement suffisamment près pour que la tranche soit attirée et adhèrez à la glissade sans avoir à toucher la glissade jusqu’à la scène.Pour évaluer les sections des tissus cardiaques pour la présence de malformations cardiaques courantes, à l’aide d’un microscope équipé d’une caméra, obtenir des images à 5 à 10X et 40X grossissements. Pour l’analyse du compactage musculaire cardiaque, ouvrez un tissu d’intérêt dans un logiciel approprié d’analyse d’image et réglez l’image en 8 bits. Pour définir le seuil de l’image, cliquez sur Image, Ajustez et Seuilz et déplacez la barre supérieure pour ajuster le seuil jusqu’à ce que seuls les pixels de l’arrière-plan soient sélectionnés.Ensuite, utilisez l’outil de sélection des polygones pour dessiner une région d’intérêt autour du tissu, puis cliquez sur Analyser, définir les mesures, la zone et limiter au seuil. Cliquez sur Analyser et mesurer pour mesurer la zone des pixels surligné pour obtenir la valeur de la zone de l’espace négatif. Pour mesurer la zone de toute la région d’intérêt, cliquez sur Analyser, définir les mesures et désélectionner la limite au seuil.Ensuite, sélectionnez Analyser et mesurer pour mesurer l’ensemble de la zone d’intérêt sélectionnée. Pour calculer la zone du tissu musculaire, soustrayez la zone de l’espace négatif de la zone de la région d’intérêt. Ensuite, diviser la zone du tissu musculaire par la zone de la région d’intérêt pour calculer le compactage musculaire et X.The coloration des tranches de tissu à partir de cœurs embryonnaires récoltés, fournit suffisamment de contraste pour faire les bords des tissus, mais n’est pas si sombre que de rendre les caractéristiques cellulaires indiscernables.Dans cette analyse représentative, le compactage musculaire a été observé pour être sensiblement réduit dans les coeurs expérimentaux par rapport aux embryons qui se sont développés dans des conditions non expérimentales. Ces échantillons sont précieux et nécessitent beaucoup de temps pour créer. Pendant les autopsies et la section cryostat en particulier, assurez-vous d’être intentionnel sur chaque action que vous effectuez.La préservation des tissus en paraformaldéhyde maintient l’activité antigène permettant aux échantillons d’être utilisés pour des tests comme la coloration d’aminofluorescéine qui aident à identifier les causes pathologiques trouvées au cours de l’évaluation morphologique. Dans notre laboratoire, nous avons obtenu une représentation quantitative des traitements expérimentaux qui peut nous aider à identifier dans quelle mesure différents traitements affectent nos échantillons. Le paraformaldéhyde peut fixer n’importe quel tissu qu’il touche.Prenez soin de toujours porter des gants pour minimiser la peau exposée et de travailler dans une hotte de film chaque fois que vous travaillez avec ce produit chimique.

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Developmental Biology

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Mort foetale et périnatale est une caractéristique commune lors de l'étude des altérations génétiques qui affectent le développement cardiaque. L'imagerie ultrasonore haute fréquence a permis d'améliorer la résolution 2-D et peut fournir d'excellents renseignements sur le développement cardiaque précoce et est une méthode idéale pour détecter l'impact sur la structure et la fonction cardiaques avant son décès.

Murin échocardiographie fœtale

Ultra-haute ultrasons de fréquence est un outil d'imagerie en temps réel puissant pour examiner les anomalies cardiaques chez les petits animaux. Son caractère non invasif permet de maintenir l'état physiologique de l'embryon. Ici, nous montrons l'utilisation du mode M ultrasons pour mesurer les taux d'embryons de coeur à -18,5 in utero.

In utero mesure de la fréquence cardiaque chez la souris par M mode non invasive échocardiographie

Les mutations qui conduisent à des malformations cardiaques congénitales bénéficient de l’investigation in vivo de la structure cardiaque au cours du développement, mais les études structurelles à haute résolution dans le cœur embryonnaire de souris sont techniquement difficiles. Nous présentons ici une méthode robuste d’immunofluorescence et d’analyse d’images pour évaluer les structures spécifiques aux cardiomyocytes dans le cœur de souris en développement.

Analyse du développement des cardiomyocytes par immunofluorescence dans le Coeur embryonnaires de souris

L’examen échocardiographique est fréquemment utilisée chez les souris. Appareils à ultrasons à haute résolution coûteux ont été développés à cet effet. Ce protocole décrit une procédure échocardiographique abordable combinée avec histologique morphométrique des analyses pour déterminer la morphologie cardiaque.

Examen échocardiographique et histologique de morphologie cardiaque chez la souris

Nous décrivons ici un protocole pour toute monture immunofluorescence et imageur l’analyse quantitative volumétrique des embryons de souris stade précoce. Nous présentons cette technique comme une approche puissante pour qualitativement et quantitativement évaluer les structures cardiaques au cours du développement et proposer qu’il peut être largement adaptable à d’autres systèmes d’organe.

Analyse quantitative Immunofluorescence entier-montent des Populations de progéniteurs cardiaques chez des embryons de souris

Échographie haute fréquence de la souris fœtale s’est améliorée d’imagerie de résolution et peut fournir une caractérisation non invasive précise du développement cardiaque et vices de construction. Le protocole décrit dans les présentes est conçu pour effectuer en temps réel de souris foetales échocardiographie in vivo.

Souris foetale Cardiovascular Imaging à l’aide d’un système à ultrasons de haute fréquence (30 / 45MHZ)

Nous présentons les protocoles afin d’examiner le développement de coeur de souris au microscope de toute monture épifluorescente sur des embryons de souris disséqués de ventriculaire spécifiques MLC-2v-tdTomato journaliste souris knock-in. Cette méthode nous permet de directement visualiser chaque étape de la formation ventriculaire au cours du développement de coeur de souris sans fastidieuses méthodes histochimiques.

Analyse du développement de la chambre cardiaque durant l’embryogenèse de souris à l’aide de toute monture épifluorescence

Cet article détaille les méthodes de diagnostic des cardiopathies congénitales (CHD) murines utilisant l’échocardiographie fœtale, la nécropsie et la capture d’images de fluorescence épiscopique (EFIC) à l’aide de la microscopie confocale épiscopique (ECM) suivie d’une reconstruction tridimensionnelle (3D).

Un pipeline pour caractériser les malformations cardiaques structurelles chez la souris fœtale

Ici nous rapportons le double étiquetage des cellules neurales de crête et des vaisseaux sanguins utilisant la greffe intraspecies de tube neuralde poussin GFP combinée avec l’injection intra-vasculaire de DiI. Cette technique expérimentale nous permet de visualiser et d’étudier simultanément le développement du système nerveux (entérique) dérivé de la CCN et du système vasculaire, au cours de l’organogenèse.

Double étiquetage des cellules de la crête neurale et des vaisseaux sanguins dans des embryons de poulet à l’aide de la greffe de tube neuralChick GFP et de l’injection de diI de colorant de carbocyanine

Ici, nous présentons un protocole d'injecter des agents de contraste ultrasonores de microbulles dans la vie, isolés en fin de gestation embryons murins de la scène. Cette méthode permet l'étude des paramètres de perfusion et de marqueurs moléculaires vasculaires au sein de l'embryon en utilisant à haute fréquence échographie de contraste amélioré.

Imagerie de contraste dans les embryons de souris utilisant à haute fréquence à ultrasons

Découvrez des techniques d'analyse tissulaire standardisées pour étudier les malformations cardiaques congénitales chez la souris. Ces méthodes qualitatives et quantitatives améliorent le diagnostic cardiaque.

Analyse des malformations cardiaques congénitales chez les embryons de souris à l’aide de méthodes histologiques qualitatives et quantitatives (Vidéo) | JoVE Journal

Analyse des malformations cardiaques congénitales chez les embryons de souris à l’aide de méthodes histologiques qualitatives et quantitatives

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