Name: Imagerie cellulaire en direct du cytosquelette microtubule et manipulation micromécanique de l’Arabidopsis Shoot Apical Meristem (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Découvrez l'imagerie en direct du cytosquelette microtubulaire dans le méristème caulinaire d'Arabidopsis et la manipulation micromécanique pour étudier les réponses mécaniques cellulaires.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Croissance des plantes
<ol><li>Semer les graines d’Arabidopsis exprimant le domaine de liaison microtubule fusionné avec la protéine fluorescente verte (MBD-GFP)10 sur le sol et se maintenir en longue journée (16 h jour /8 h nuit), 20 °C/6 °C conditions pendant 1 semaine pour la germination.</li>
	<li>Après la germination, transférer les semis vers de nouveaux pots avec suffisamment d’espace de croissance pour permettre une croissance végétative robuste. Gardez les plantes en court jour (8 h jour /16 h nuit), 20 °C/16 °C pendant 3-5 semaines.</li>
	<li>Transférer les plantes à une longue journée (16 h le jour /8 h la nuit), 20 °C/16 °C et conserver jusqu’à ce que les plantes boulon (2-3 semaines). Laissez l’inflorescence grandir jusqu’à 2-5 cm de long.</li>
</ol>2. Préparation moyenne
<ol><li>Préparer les plats disséquants en remplissant de petites boîtes de Pétri (environ 5,5 cm de large, 1,5 cm de profondeur) à environ la moitié de leur profondeur avec 2% d’agarose. Les plats disséquants pourraient également être utilisés pour l’imagerie par point unique.</li>
	<li>Préparer le milieu de croissance.<ol>
<li>Préparez 50 mL d’une solution de stock vitaminique de 1 000 x avec 5 g de myo-inositol, 0,05 g d’acide nicotinique, 0,05 g d’hydrochlorure de pyridoxine, 0,5 g d’hydrochlorure de thiamine et 0,1 g de glycine.</li>
		<li>Préparer le milieu de croissance, composé de 1/2 Murashige et Skoog moyen, 1% saccharose, 1,6% agar, 1x vitamines, pH = 5,8. Autoclave et laissez-le refroidir.</li>
		<li>Sur un banc stérile et propre, stériliser les boîtes en plastique articulé (environ 5,2 cm x 5,2 cm x 3 cm) en immergeant dans 70 % d’éthanol pendant 15 min.</li>
		<li>Sur un banc stérile et propre, une fois que le milieu est à la chaleur supportable, ajouter N6-benzyladenine à une concentration finale de 200 nM, et 1/1000 PPM (mélange conservateur végétal) et bien mélanger. Remplissez les boîtes stériles à environ la moitié de leur profondeur avec le milieu.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Dissection du SAM
<ol><li>Couper l’inflorescence et enlever les bourgeons floraux plus âgés avec des forceps pointus en éplucher les fleurs à la base des péduncles jusqu’à ce qu’il soit difficile de les voir à l’œil nu.</li>
	<li>Créer une fente dans l’agarose dans le plat disséquant avec des forceps et planter la base d’inflorescence dans l’agar épais. Cela donne un bon soutien solide pour la dissection fine supplémentaire des fleurs plus jeunes pour exposer le SAM.</li>
	<li>Retirez les bourgeons floraux restants en les poussant vers le bas avec les forceps commençant par les plus anciens et progressant séquentiellement aux stades plus jeunes sous un microscope disséquant jusqu’à ce que le SAM soit visible. Le SAM est habituellement exposé lorsque les fleurs plus anciennes jusqu’au stade 6 à 7 sont enlevées. Une fois le SAM exposé, évitez la déshydratation de l’échantillon en passant rapidement à l’étape suivante.</li>
</ol>4. Transfert et croissance des SAM cultivés
<ol><li>Plantez l’échantillon fraîchement disséqué tel que détaillé dans la section 1 dans le milieu de croissance dans la boîte de culture articulée en plastique rectangulaire avec le SAM juste exposé au-dessus de la surface moyenne. Ajouter quelques gouttes d’eau déionisée stérile sur les bords des boîtes de culture et fermer le couvercle pour maintenir l’humidité à l’intérieur de la boîte. Assurez-vous que l’eau ajoutée ne couvre pas le SAM.</li>
	<li>Fermez le couvercle et enveloppez la boîte avec du ruban micropore. Placez la boîte de croissance dans des conditions de longue journée ou de jour continu à 22 °C et cultivez pendant 12-24 h pour permettre au SAM de se remettre de la procédure de dissection et de s’adapter aux conditions de culture.</li>
</ol>5. Imagerie du SAM
<ol><li>Remplissez la boîte de culture contenant le SAM d’eau déionisée stérile pour couvrir l’échantillon. Vérifiez sous le microscope disséquant et enlevez toutes les bulles d’air en pulvérisant avec force de l’eau dirigée vers l’échantillon à l’aide d’une pipette de 1 mL.</li>
	<li>Placez la boîte de culture sur une scène de microscope confocal droit. Faites en sorte que la boîte de culture ne communique pas avec les objectifs du microscope. Utilisez une lentille de trempage d’eau 40x ou 60x longue distance de l’ouverture numérique 0,8-1 qui est optimale pour l’imagerie sans verre de couverture.</li>
	<li>Abaissez l’objectif dans l’eau et vérifiez s’il y a des bulles d’air formées sur la lentille avant de l’objectif. Enlevez les bulles en abaissant le stade et en essuyant doucement la lentille avec un tissu optique et en ajoutant une petite quantité d’eau à la lentille avant de l’objectif avec une pipette Pasteur avant la réinimmersion dans l’eau.</li>
	<li>À l’aide du filtre GFP et du module d’épi-illumination du microscope confocal, réglez le contrôleur XY pour localiser l’échantillon. En ajustant la position des oculaires, placez le SAM directement sous la source lumineuse et concentrez-vous le long de l’axe Z jusqu’à ce que l’apex soit localisé. REMARQUE : Ne regardez pas directement la lumière ultraviolette.</li>
	<li>Une fois l’échantillon trouvé, illuminez-le à l’aide d’un laser capable de gfp passionnant (c.-à-d., une source laser de 488 nm ou 496 nm). Ajustez le zoom optique du microscope de sorte que l’ensemble sam et l’étape 1 primordia florale sont dans le champ de vision. Ajustez davantage la puissance de la sortie laser et gagnez des réglages pour assurer un rapport signal-bruit optimal. REMARQUE : La haute intensité du laser entraînera un blanchiment photo de l’échantillon. La palette de sous-exposition et de surexposition aide à assurer un meilleur ajustement de ces paramètres.</li>
	<li>Laisser l’échantillon se déposer pendant 2-5 min. Acquérir des piles de Z confoccales de l’échantillon à des intervalles de tranches de Z de 0,25 μm-0,5 μm À une résolution d’environ 0,3 μm de pixel. Assurez-vous que le temps total d’imagerie requis pour l’acquisition des piles Z pour un échantillon ne dépasse pas 10 minutes à partir du moment où l’échantillon est immergé dans l’eau jusqu’à la fin de l’acquisition.</li>
	<li>Retirez immédiatement l’eau et transférez la boîte de culture à la chambre de croissance. Le maintien des échantillons longtemps sous l’eau influencera l’état osmotique des cellules.</li>
</ol>6. Perturbation micromécanique du SAM
<ol><li>Configurer les conditions d’imagerie décrites dans la section 5 et acquérir des piles d’images de préablation de l’organisation corticale des microtubules.</li>
	<li>Décanter l’eau dans le plat de culture. Effectuer l’ablation à l’aide d’une aiguille de seringue propre (0,4 mm x 20 mm).<ol>
<li>À l’aide d’un microscope disséquant, maintenez soigneusement l’aiguille et approchez lentement du SAM. REMARQUE : Retenir le souffle et manipuler l’aiguille avec une poignée détendue permet d’éviter de trembler.</li>
		<li>Communiquez brièvement avec le dôme SAM avec la pointe de l’aiguille pour confirmer que l’ablation est terminée. Effectuer de préférence l’ablation à la périphérie du SAM, ce qui permet la visualisation du comportement et la transition des microtubules corticals non organisés dans la région centrale du dôme.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remplir le plat de culture d’eau déionisée stérile et ajouter l’idodide propidium (10 μg/mL). En plus de surveiller le signal cortical de microtubule de GFP, visualiser l’iodure de propidium à l’aide d’un canal distinct peut clairement marquer les régions des cellules ablées. Propidium iodure est éclairé à l’aide de la 561 nm ou tout autre laser approprié avec émission enregistrée entre 600-650 nm.</li>
	<li>Acquérir des piles d’images juste après l’ablation (voir la section 6) et répéter le processus d’acquisition toutes les 2 h pour une période de 6 h. Retourner le plat de culture avec l’échantillon dans la chambre d’incubation après chaque point de temps. Assurez-vous qu’il reste un peu d’eau sur les supports culturels et enveloppez le plat de culture avec du ruban micropore pour empêcher la dessication.</li>
</ol>7. Visualisation et quantification des données
<ol><li>Générer des projections de surface à l’aide de logiciels disponibles gratuitement tels que MORPHOGRAPHX11, FIJI12, ou macro SurfCut13.</li>
	<li>Effectuer l’extraction de l’anisotropie microtubule corticale à l’aide de FibrilTool14 macro aux FIDJI. REMARQUE : Des protocoles détaillés pour l’utilisation du logiciel peuvent être obtenus à partir des citations respectives.</li>
</ol>

<ol><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-constructing+our+models+of+cellulose+and+primary+cell+wall+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly.</a> Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).</li>
<li>McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+cellulose+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of cellulose synthesis.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 65, 69-94 (2014).</li>
<li>Burgert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+micromechanical+design+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Exploring the micromechanical design of plant cell walls.</a> American Journal of Botany. 93 (10), 1391-1401 (2006).</li>
<li>Paredez, A. R., Somerville, C. R., Ehrhardt, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cellulose+synthase+demonstrates+functional+association+with+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of cellulose synthase demonstrates functional association with microtubules.</a> Science. 312 (5779), 1491-1495 (2006).</li>
<li>Barbier de Reuille, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MorphoGraphX%3A+A+platform+for+quantifying+morphogenesis+in+4D%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D.</a> Elife. 4, 05864(2015).</li>
<li>Kierzkowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+domains+regulate+growth+and+organogenesis+in+the+plant+shoot+apical+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Elastic domains regulate growth and organogenesis in the plant shoot apical meristem.</a> Science. 335 (6072), 1096-1099 (2012).</li>
<li>Heisler, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alignment+between+PIN1+polarity+and+microtubule+orientation+in+the+shoot+apical+meristem+reveals+a+tight+coupling+between+morphogenesis+and+auxin+transport%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Alignment between PIN1 polarity and microtubule orientation in the shoot apical meristem reveals a tight coupling between morphogenesis and auxin transport.</a> PLoS Biology. 8 (10), e1000516(2010).</li>
<li>Louveaux, M., Rochette, S., Beauzamy, L., Boudaoud, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+mechanical+compression+on+cortical+microtubules+in+Arabidopsis%3A+a+quantitative+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The impact of mechanical compression on cortical microtubules in Arabidopsis: a quantitative pipeline.</a> Plant Journal. 88 (2), 328-342 (2016).</li>
<li>Nakayama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+auxin-mediated+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of auxin-mediated growth.</a> Current Biology. 22 (16), 1468-1476 (2012).</li>
<li>Marc, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+GFP-MAP4+reporter+gene+for+visualizing+cortical+microtubule+rearrangements+in+living+epidermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A GFP-MAP4 reporter gene for visualizing cortical microtubule rearrangements in living epidermal cells.</a> Plant Cell. 10 (11), 1927-1940 (1998).</li>
<li>Strauss, S., Sapala, A., Kierzkowski, D., Smith, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Plant+Growth+and+Cell+Proliferation+with+MorphoGraphX%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying Plant Growth and Cell Proliferation with MorphoGraphX.</a> Methods in Molecular Biology. 1992, 269-290 (2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Erguvan, O., Louveaux, M., Hamant, O., Verger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+SurfCut%3A+a+user-friendly+pipeline+for+high-throughput+extraction+of+cell+contours+from+3D+image+stacks%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">ImageJ SurfCut: a user-friendly pipeline for high-throughput extraction of cell contours from 3D image stacks.</a> BMC Biology. 17 (1), 38(2019).</li>
<li>Boudaoud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FibrilTool%2C+an+ImageJ+plug-in+to+quantify+fibrillar+structures+in+raw+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images.</a> Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).</li>
<li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+wall+cellulose+synthase+regulates+shoot+apical+meristem+mechanics+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth.</a> Development. 146 (10), (2019).</li>
<li>Hervieux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mechanical+Feedback+Restricts+Sepal+Growth+and+Shape+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A Mechanical Feedback Restricts Sepal Growth and Shape in Arabidopsis.</a> Current Biology. 6 (8), P1019-P1028 (2016).</li>
<li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+and+supracellular+mechanical+stress+prescribes+cytoskeleton+behavior+in+Arabidopsis+cotyledon+pavement+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Subcellular and supracellular mechanical stress prescribes cytoskeleton behavior in Arabidopsis cotyledon pavement cells.</a> Elife. 3, e01967(2014).</li>
<li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+wall+cellulose+synthase+regulates+shoot+apical+meristem+mechanics+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth.</a> Development. 146 (10), dev179036(2019).</li>
<li>Uyttewaal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+acts+via+katanin+to+amplify+differences+in+growth+rate+between+adjacent+cells+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress acts via katanin to amplify differences in growth rate between adjacent cells in Arabidopsis.</a> Cell. 149 (2), 439-451 (2012).</li>
<li>Hamant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+patterning+by+mechanical+signals+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Developmental patterning by mechanical signals in Arabidopsis.</a> Science. 322 (5908), 1650-1655 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’évaluation des événements de transduction du signal mécanique est cruciale pour identifier les régulateurs moléculaires impliqués dans les voies de mécano-perception et de transduction. Le protocole décrit ici fournit une vue quantitative de tels événements en utilisant la réponse corticale de microtubule comme lecture pour un tel processus dans arabidopsis SAMs. La procédure décrite ici est couramment utilisée dans plusieurs études dans divers types de tissus16,<sup class="x...

Les cellules végétales sont entourées d’une matrice extracellulaire de polysaccharides et de glycoprotéines qui ressemble mécaniquement à un matériau composite renforcé de fibre capable de modifier dynamiquement ses propriétésmécaniques 1. La croissance des cellules végétales est entraînée par l’absorption d’eau dans la cellule, ce qui entraîne une accumulation concomitante de forces tensiles sur la paroi cellulaire. En réponse à ces forces, les modifications apportées à l’état physique de la paroi cellulaire permettent l’expansion cellulaire. Les cellules dont les parois primaires sont capables de subir une croissance rapide par rapport à la paroi cellulaire secondaire contenant des cellules principalement en raison de différences dans la composition chimique des polysaccharides à l’intérieur. Les cellules murales primaires sont composées de cellulose, d’hémicellulose et de pectine en plus des glycoprotéines, et manquent de lignine, un composant présent dans la paroi cellulairesecondaire 2. La cellulose, un polymère de glucose relié par β-1,4 liaisons, est la composante principale des parois cellulaires. Il est organisé en structures fibrilles capables de résister aux fortes forces tensiles rencontrées lors de la croissance cellulaire3. En plus de résister aux forces tensiles, le renforcement mécanique le long d’une direction préférentielle entraîne une expansion entraînée par turgor le long d’un axe perpendiculaire à l’orientation nette du microfibrille cellulose. L’organisation des microfibrilles de cellulose est influencée par le cytosquelette cortical de microtubule, car ils guident le mouvement directionnel des complexes cellulose-synthétisant situés à la membraneplasmatique 4. Par conséquent, la surveillance de l’organisation corticale des microtubules à l’aide d’une protéine ou d’une tubuline associée aux microtubules fusionnée avec une molécule fluorescente sert de substitut à l’observation des modèles de cellulose dans les cellules végétales.
Le modelage du cytosquelette cortical de microtubule est sous le contrôle des forces mécaniques dérivées de la morphologie cellulaire et tissulaire. L’organisation corticale de microtubule n’a aucune organisation préférentielle au fil du temps dans les cellules situées à l’apex du SAM, tandis que les cellules dans la périphérie et la frontière entre le SAM et l’organe émergent ont un tableau supracellulaire stable et fortement organisé des microtubulescorticals 5. Plusieurs approches ont été développées pour perturbant physiquement l’état mécanique des cellules. Les changements au statut osmotique, aussi bien que le traitement avec les composés pharmacologiques et enzymatiques qui influencent la rigidité de la paroi cellulaire peuvent avoir comme conséquence des changements suivants dans les forces tensiles éprouvées parla cellule 6,7. L’utilisation d’engins qui permettent l’augmentation progressive des forces compressives éprouvées par les tissus est une autre alternative8. Il a également été démontré que l’application de forces centrifuges influence les forces mécaniques sans aucun contact physique avec lescellules 9. Cependant, les moyens les plus largement utilisés de changer les forces directionnelles dans un groupe de cellules profitent du fait que toutes les cellules épidermiques sont sous tension et l’ablation physique des cellules éliminera la pression turgor localement ainsi que perturber l’adhérence cellule à cellule, modifiant ainsi les forces tensiles rencontrées par les cellules voisines. Ceci est effectué soit en ciblant un laser ultraviolet pulsé de grande puissance ou au moyen d’une aiguille fine.
Ici nous élaborons sur le processus de formation image et évaluant le comportement cortical de microtubule pour la perturbation mécanique au SAM.

<table><tbody><tr><td>FibrilTool</td><td></td><td></td><td>Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014</td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td>Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012</td></tr><tr><td>glycine</td><td>Merck</td><td>1.04201.1000</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 microscope confocal</td><td>Leica</td><td>DM6000 CS</td><td></td></tr><tr><td>MAP4-GFP</td><td></td><td></td><td>Marc, J. et al., Plant Cell 1998</td></tr> bande <tr><td>microporeuse</td><td>Leukopor</td><td>02482-00</td><td></td></tr><tr><td>MorphographX</td><td></td><td></td><td>Strauss, S. et al., Méthodes Mol Biol. 2019</td></tr><tr><td>myo-inositol</td><td>Sigma</td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>N6-benzyladénine</td><td>Sigma</td><td>B3408</td><td></td></tr><tr><td>acide nicotinique</td><td>Sigma</td><td>N4126</td><td></td></tr><tr><td>boîte à charnière en plastique</td><td>Microscopie électronique</td><td>sciences 64312</td><td></td></tr><tr><td>PPM (Plant Preservation Mixture)</td><td>Plant Cell Technology</td><td>PPM</td><td></td></tr><tr><td>Iodure de propidium</td><td>Sigma</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>chlorhydrate de pyridoxine</td><td>Sigma</td><td>P9755</td><td></td></tr><tr><td>SURFCUT</td><td></td><td></td><td>Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019</td></tr><tr><td>chlorhydrate de thiamine</td><td>Sigma</td><td>T4625</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie cellulaire en direct du cytosquelette microtubule et manipulation micromécanique de l’arabidopsis shoot apical meristem

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

La compréhension de la régulation de la croissance et de la morphogenèse au niveau des cellules et des tissus est à l’avant-garde de la recherche biologique depuis de nombreuses décennies. Les progrès des technologies moléculaires et d’imagerie nous ont permis d’avoir un aperçu de la façon dont les signaux biochimiques influencent les événements morphogenétiques. Cependant, il est de plus en plus évident qu’en dehors des signaux biochimiques, les signaux mécaniques ont également un impact sur plusieurs aspects de la croissance cellulaire et tissulaire. L’Arabidopsis shoot apical meristem (SAM) est une structure en forme de dôme responsable de la génération de tous les organes en surface. L’organisation du cytosquelette cortical de microtubule qui médie le dépôt apoplastique de cellulose dans les cellules végétales est spatialement distincte. La visualisation et l’évaluation quantitative des modèles des microtubules corticals sont nécessaires pour comprendre la nature biophysique des cellules au SAM, car la cellulose est la composante la plus rigide de la paroi cellulaire végétale. La forme stéréotypée de l’organisation corticale de microtubule est également une conséquence des forces physiques tissulaires existant au SAM. La perturbation de ces forces physiques et la surveillance subséquente de l’organisation corticale de microtubule permettent l’identification des protéines candidates impliquées dans la médiation de la méchano-perception et de la transduction. Ici, nous décrivons un protocole qui aide à étudier de tels processus.

La figure 1 montre des images de projection typiques obtenues à partir de lignes MBD-GFP avec des cellules au centre du dôme contenant des microtubules corticals désorganisés, et des cellules à la périphérie ayant une distribution circonférentielle (figure 1A,B), tandis que les cellules du domaine limite contiennent des microtubules corticals alignés parallèlement au long axe de la cellule. Ces observations montr...

Ici nous décrivons un protocole pour l’imagerie cellulaire vivante du cytosquelette cortical de microtubule au meristem apical de pousse et surveillant sa réponse aux changements des forces physiques.

Imagerie cellulaire en direct du cytosquelette microtubule et manipulation micromécanique de l’Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

Ce protocole nous aide à comprendre comment le comportement microtubule cytosquelette se produit dans les plantes. En même temps, il nous aide également à comprendre comment ces composants structurels qui influencent la forme des cellules et des organes, réagissent aux changements des forces mécaniques. Bien que cette méthode exige peu de sophistication, elle fournit robuste, quantitative lecture après, les différences de réponse mécanique entre les différents génotypes et conditions.Commencez par cultiver des graines d’arabidopsis exprimant des domaines de liaison microtubule fusionnés avec des protéines fluorescentes vertes dans le sol, à 20 et 6 degrés Celsius dans de longues conditions de jour pendant une semaine. Après la germination, transférer les semis dans de nouveaux pots avec suffisamment d’espace de croissance pour permettre une croissance végétative robuste, et placer les plantes à 20 et 16 degrés Celsius dans de courtes conditions de jour. Après trois à cinq semaines, remettre les plantes à de longues conditions de jour à la même température jusqu’à ce que les plantes boulon, permettant à l’inflorescence de croître jusqu’à deux à cinq centimètres de long.Pour tirer apical meristem dissection, putt l’inflorescence, et utiliser des forceps pointus pour peler les fleurs à la base des péduncles, jusqu’à ce qu’il soit difficile de voir les péduncles à l’œil nu pour enlever les bourgeons floraux plus âgés. Utilisez les forceps pour créer une fente dans les agros dans un plat disséquant, et plantez la base d’inflorescence dans l’épais Augure. Placer le plat sous un microscope disséquant.En commençant par le plus vieux bourgeon de fleur, poussez avec les forceps pour enlever le bourgeon de fleur de la plante. Le meristem apical de pousse est habituellement exposé quand les fleurs plus anciennes jusqu’au stade six à sept sont enlevées. Et utilisez les forceps pour pousser chaque bourgeon de fleur vers le bas jusqu’à ce que le meristem apical de pousse soit visible.Dès que le meristem apical de pousse est exposé, laissez l’échantillon fraîchement disséqué dans le milieu de croissance dans une boîte rectangulaire rectangulaire de culture articulée en plastique éthanol-stérilisée avec le meristem apical de pousse juste exposé au-dessus de la surface moyenne. Ajouter quelques gouttes d’eau déionisée stérile sur les bords de la boîte de culture et fermer le couvercle pour maintenir l’humidité à l’intérieur de la boîte. Enveloppez la boîte avec du ruban micropore et placez la boîte de croissance dans des conditions de jour longues ou continues à 22 degrés Celsius pendant 12 à 24 heures.Lorsque la plante s’est remise de la procédure de dissection, recouvrez l’échantillon d’eau déionisée stérile et vérifiez s’il y a des bulles d’air sous le microscope à disséquer. Transférez la boîte de culture à un stade de microscope confocal droit, et sélectionnez l’objectif de trempage d’eau 40 ou 60X. Abaissez l’objectif dans l’eau et vérifiez s’il y a des bulles d’air sur la lentille avant de l’objet.Pour enlever les bulles, abaissez le stade et essuyez doucement la lentille avec un tissu optique. Ensuite, utilisez une pipette Pasteur pour ajouter un petit volume d’eau à la lentille avant de l’objectif avant de re-immerser la lentille dans l’eau. Ensuite, utilisez le filtre GFP et le module d’épi-illumination du microscope confocal pour régler le contrôleur XY pour localiser l’échantillon.Ajuster la position des oculaires, positionner le meristem apical de tir directement sous la source lumineuse, et se concentrer le long de l’axe Z jusqu’à ce que l’apex soit localisé. Utilisez un laser capable de gfp passionnant pour éclairer l’échantillon, et ajuster le zoom optique du microscope, de sorte que l’ensemble de la pousse meristem apical et la première étape primordia florale sont dans le champ de vision. Ensuite, ajustez la puissance de la sortie laser et les paramètres de gain pour obtenir un rapport signal/bruit optimal.Après avoir permis à l’échantillon de se contenter de deux à cinq minutes, acquérir des piles de Z confoccales de l’échantillon à des intervalles de 0,25 à 0,5 micromètres de tranche Z, ajoutant une résolution de taille de pixel d’environ 0,3 micromètre. À la fin de l’acquisition, retirez immédiatement l’eau et transférez la boîte de culture à la chambre de croissance. Pour Micromechanical Shoot Apical Meristem Perturbation, acquérir des piles d’images de pré-ablation de l’organisation corticale microtubule comme nous venons de le démontrer, et décaféiné l’eau de la boîte de culture dans un plat de culture.Transférer le meristem apical de pousse sous un microscope disséquant, et lentement approché le meristem apical de pousse avec une aiguille propre de seringue de 0,4 par 20 millimètres. Contactez brièvement la périphérie du dôme du meristem apical de pousse avec la pointe d’aiguille pour confirmer que l’ablation a été accomplie. Et remplissez le plat de culture avec de l’eau déionisée stérile.Ajoutez ensuite 10 microgrammes par millilitre d’iodure de propidium au plat et acquérez immédiatement des piles d’images comme démontré toutes les deux heures pendant six heures, renvoyant le plat de culture à l’incubation entre chaque point de temps. Pour l’analyse des données, générer des projections de surface des piles d’images à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image approprié, et effectuer l’extraction de l’anisotropie corticale microtubule à l’aide de la Macro Outil Fibril aux Fidji. Ici, des images de projection typiques obtenues à partir de lignes GFP de liaison de microtubule avec des cellules au centre du dôme contenant des microtubules corticals désorganisés, des cellules à la périphérie, ayant une distribution circonférentielle et des cellules de domaine de limite contenant des microtubules corticals alignés parallèlement au long axe de la cellule peuvent être observées.L’imagerie time-lapse, montre l’alignement cortical de microtubule changeant d’un tableau fortement désordonné à un tableau plus organisé dans les six heures suivant l’ablation. Tensors pourrait être superposé sur les images corticales de microtubule, et l’information extraite pourrait être représentée en traçant l’anisotropie moyenne au fil du temps. Lors de l’ajustement de la puissance de sortie laser et des paramètres de gain, nous devrions nous assurer qu’il observation claire des filaments et essayer d’éviter la surexposition, comme les signaux saturés plus pourrait biaiser la direction tendue dans l’analyse ultérieure.La microscopie de la force atomique peut également être effectuée pour évaluer comment les changements dans les forces mécaniques affectent réellement l’état physique de la paroi cellulaire.

live-cell-imaging-microtubule-cytoskeleton-micromechanical

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Nous décrivons un protocole utilisant des lames de chambre et des médias pour immobiliser cotylédons des plantes pour l'imagerie confocale de l'épiderme pendant plusieurs jours de développement, la documentation différenciation des stomates. Protéines fluorophore-marqués peuvent être suivis de manière dynamique par l'expression et la localisation subcellulaire, accroître la compréhension de leurs rôles possibles lors de la division cellulaire et la différenciation de type.

À long terme, à haute résolution d&#39;imagerie confocal Time Lapse d&#39;<em&gt; Cotylédon Arabidopsis</emEpiderme&gt; cours de germination

Ca la signalisation régule divers processus biologiques dans les plantes. Ici, nous présentons des approches pour le suivi du stress abiotique induit Ca 2 + spatiale et temporelle des signaux dans les cellules et les tissus en utilisant les codés génétiquement Ca2 + indicateurs Aequorin ou cas12 Arabidopsis.

Mesure spatiale et temporelle Ca 2 + Signaux de plantes d'Arabidopsis

imagerie confocale en direct fournit aux biologistes un outil puissant pour étudier le développement. Nous présentons ici un protocole détaillé pour l'imagerie confocale en direct de développer des fleurs Arabidopsis.

Vivre imagerie confocale de développement Arabidopsis Fleurs

Cet article montre comment la culture de semis de Arabidopsis thaliana en une plate-forme microfluidique de deux couches qui confine la racine principale et les poils absorbants pour un seul plan optique. Cette plate-forme peut être utilisée pour l’imagerie optique en temps réel de la morphologie de racines fines aussi bien en ce qui concerne l’imagerie haute résolution par d’autres moyens.

La morphologie de poils absorbants d’Arabidopsis semis dans une bicouche Microfluidic plateforme d’imagerie

Nous présentons une méthode simple et souple pour l’exécution de vivre-imagerie fluorescente de Arabidopsis thaliana feuilles sur une longue période de temps. Nous utilisons une plante Arabidopsis transgénique exprimant un gène rapporteur fluorescent sous le contrôle d’un promoteur liées à l’immunité à titre d’exemple pour comprendre spatio-temporelle des réactions immunitaires des plantes.

Une méthode polyvalente pour le montage de Arabidopsis quitte pour l’imagerie Intravitale time-lapse

Ce protocole présente comment vivre image et analyser les méristèmes apicaux de différentes espèces de plantes à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser.

Imagerie confocale direct des méristèmes apicaux de différentes espèces de plantes

Ici, nous décrivons la génération et l’application d’un ensemble de transgéniques Arabidopsis thaliana lignes habilitante expression inductible, tissu-spécifique dans les trois méristèmes principaux, le méristème apical, le méristème apical racinaire et le cambium.

Inductible, Expression spécifique au Type cellulaire chez Arabidopsis thaliana médiation par le biais de LhGR Trans-Activation

Ici, nous décrivons une amélioration de la méthode semi-in vitro (SIV) pour observer le guidage et la réception du tube pollinique chez Arabidopsis thaliana, ce qui augmente la réceptivité des ovules. La méthode SIV cum septum à haut débit peut être couplée à des lignées marqueurs gamétophytes et à des biocapteurs génétiquement codés pour surveiller le processus dynamique de fécondation.

Imagerie en direct de la réception du tube pollinique d’Arabidopsis et de la double fécondation à l’aide de la méthode semi-in vitro cum septum

Plusieurs méthodes couramment utilisées sont présentées ici pour étudier les événements de trafic membranaire d’une kinase du récepteur de la membrane plasmique. Ce manuscrit décrit les protocoles détaillés, y compris la préparation du matériel végétal, le traitement pharmacologique et la configuration de l’imagerie confocale.

Méthodes basées sur l’image pour étudier les événements de trafic membranaire dans les cellules de la lignée stomatique

Le mouvement des chromosomes au cours de la prophase méiotique est un phénomène mal compris qui est fondamental pour la formation des spores. Ce protocole décrit une méthode pour acquérir, analyser et quantifier les mouvements du centromère au cours de la prophase méiotique chez les méiocytes mâles d’Arabidopsis thaliana .

Caractérisation par imagerie en direct des mouvements du centromère au cours de la prophase méiotique mâle chez Arabidopsis thaliana

Ce procédé utilise la microscopie confocale en conjonction avec un noyau et une lignée de marqueurs de chromatine marqués fluorescentement dans Arabidopsis thaliana pour enregistrer simultanément la dynamique du noyau et de la chromatine dans les racines d’Arabidopsis et étudier les changements de ces dynamiques en réponse aux signaux développementaux et environnementaux.

Imagerie quantitative des cellules vivantes de la forme nucléaire et de la dynamique de la chromatine pendant le développement et le stress environnemental dans la racine d’Arabidopsis thaliana

Découvrez l'imagerie en direct du cytosquelette microtubulaire dans le méristème caulinaire d'Arabidopsis et la manipulation micromécanique pour étudier les réponses mécaniques cellulaires.

Imagerie cellulaire en direct du cytosquelette microtubule et manipulation micromécanique de l’Arabidopsis Shoot Apical Meristem (Vidéo) | JoVE Journal

Imagerie cellulaire en direct du cytosquelette microtubule et manipulation micromécanique de l’Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Explorer plus de vidéos