Name: Isolement des cardiomyocytes des coeurs fixes pour l’immunocytochimie et l’analyse de ploy (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Découvrez une méthode d'isolement des cardiomyocytes à partir de tissu cardiaque fixé pour analyser la ploïdie et la nucléation. Cette technique offre des rendements cellulaires cohérents et une vérification visuelle directe.

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<li>Woo, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+phenotypic+assay+for+proliferation+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+identifies+L-type+calcium+channels+as+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">High-content phenotypic assay for proliferation of human iPSC-derived cardiomyocytes identifies L-type calcium channels as targets.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 127, 204-214 (2018).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Étant donné que les cardiomyocytes ne peuvent pas être maintenus en culture, il est important d’isoler les cardiomyocytes primaires pour pouvoir étudier leur architecture et leur fonction11. Par conséquent, les techniques d’isolement cardiomyocyte ont été largement utilisées dans le domaine cardiaque. Si l’objectif est de déterminer les aspects fonctionnels des cardiomyocytes, il est important d’isoler les cardiomyocytes viables. Ces cardiomyocytes vivants peuvent également être utilisés pour effectuer l’immunostaining sur les cardiomyocytes isolés. Cependant, l’optimisation de la technique d’isolement des cardiomyocytes vivants est techniquement difficile, et même les meilleures techniques ne donnent généralement que 60-65% de cardiomyocytes vivants en forme de tige, et les cardiomyocytes restants sont tous balled up et mourir ou mort11,12. Ici, nous avons développé une technique qui permettra aux chercheurs de fixer d’abord le cœur, puis d’isoler efficacement les cardiomyocytes. Ce nouveau protocole permet des rendements beaucoup plus élevés de cardiomyocytes en forme de tige par rapport aux protocoles publiés précédemment. En outre, nous avons développé une plate-forme d’analyse d’imagerie pour catégoriser les cardiomyocytes automatiquement en fonction de la nucléation et du stratagème. Avec ces nouvelles méthodologies, les groupes peuvent tacher les cardiomyocytes pour différentes protéines, et étudier le ployage cardiomyocyte et le statut de nucléation comme substituts pour le potentiel régénératif du cœur.
Le protocole décrit ici est relativement simple et peut être exécuté sans équipement avancé. La quantité de collagènease et le temps d’incubation pour la digestion peut varier en fonction du lot de collagène, et la société de le fournir. Nous avons utilisé la collagène de type 2, car c’est le plus largement utilisé pour digérer le cœur pour obtenir des cardiomyocytes vivants. Sur la base de nos observations, nous avons déterminé que l’incubation de nuit avec 60 mg/mL collagènease type 2 est optimale pour presque tous les cœurs de souris indépendamment du niveau de fibrose. Nous n’avons jamais eu un problème de surdiggestion que les protéines intracellulaires sont fixes et pas aussi accessibles que le collagène extracellulaire. Cependant, si le cœur n’est pas digéré correctement, une trituration plus vigoureuse pourrait être nécessaire, ce qui provoque la fragmentation cellulaire due au stress de cisaillement. Ainsi, il est crucial de s’assurer que le cœur est digéré correctement avant de passer à la trituration. La rigidité du cœur peut être testée en serrant avec des forceps pour évaluer le degré de digestion. Après l’incubation avec la collagène, les cœurs doivent être moins raides et faciles à déchirer. D’autres types de collagène peuvent également être utilisés. Un rapport précédent a utilisé une combinaison de collagèneases B et D14.
En outre, nous croyons que ce protocole peut être utilisé pour évaluer le nombre global de cardiomyocytes dans le cœur15. Cependant, si l’objectif est d’obtenir et de quantifier tous les cardiomyocytes du cœur, il est important d’incuber les cœurs pendant de longues périodes de temps dans la solution de collagène (par exemple, 3-7 jours), où la solution de collagène devrait être réapprovisionnée une fois par jour. Cela permettra de minimiser les incohérences dans l’efficacité de l’isolement en éliminant l’impact du degré de trituration sur le rendement des cardiomyocytes.
L’utilisation du contenu de l’ADN pour mesurer le stratagème n’est pas nouvelle, et a été utilisée dans la cytométrie de flux pendant des décennies. Récemment, il a été démontré que la microscopie peut également être utilisée pour estimer la teneur en ADN par noyau16. Ici, nous avons mis en œuvre cette stratégie pour mesurer le stratagème des noyaux de cardiomyocytes, comme substitut pour les cardiomyocytes nouvellement formés. Le dogme dans le domaine de la régénération cardiaque est que seuls les cardiomyocytes diploïdes mononucléés peuvent subir une cytokinesis et donner naissance à de nouveaux cardiomyocytes. Puisqu’il est très difficile de mesurer la nouvelle formation de cardiomyocyte in vivo, isolant les cardiomyocytes qui ont été poursuivis après l’administration d’un analogue de nucléotid d’ADN et déterminant le niveau des cardiomyocytes de diploïde mononucléés a été employé comme approximation de la capacité du coeur pour produire de nouveaux cardiomyocytes17. Ici, nous fournissons une macro pour ImageJ qui permet la quantification facile du stratagème de cardiomyocyte. Au minimum, 500 noyaux doivent être mesurés pour obtenir une estimation précise de l’emplacement du pic G1. Si l’on veille à ce que les conditions de coloration et d’imagerie soient uniformes dans chaque puits de la plaque d’image, seuls 500 noyaux sur l’ensemble de l’échantillon doivent être photographiés, sinon, il doit y avoir 500 noyaux par groupe d’images18,19. Les limites de la mesure basée sur l’imagerie de la nucléation et du stratagème incluent la difficulté à distinguer les noyaux des cellules adhérentes des noyaux cardiomyocytés réels, lors de l’utilisation d’images bidimensionnelles. De telles cellules adhérentes pourraient entraîner une surestimation de la quantité de cellules multinucléées et diminuer la précision des mesures de la population du noyau de cardiomyocyte tétraploïde. Une stratégie possible pour résoudre ce problème serait d’utiliser le marqueur nucléaire cardiomyocyte PCM16,20. Cependant, nous avons eu des difficultés à obtenir des taches PCM1 fiables sur des cellules ou des tissus correctement fixes.
Une autre limitation potentielle est que certaines images de taches nucléaires pourraient avoir des taches cytoplasmiques de fond significatives, empêchant le seuil approprié utilisant les Fidji construit dans les méthodes sans prétraitement étendu. En outre, la contribution irrégulière de cette fluorescence de fond dans les estimations de stratagème réduit leur précision. En outre, si les cellules ne sont pas laissées dans la solution de coloration de l’ADN pendant suffisamment de temps, le colorant fluorescent ne se liera pas à la saturation dans les noyaux et l’hypothèse d’une relation linéaire entre l’intensité intégrée nucléaire et la teneur en ADN ne sera plus exacte.
Il convient de noter que le logiciel ne peut pas segmenter les grappes de cardiomyocytes et les supprime plutôt de l’analyse. Par conséquent, il est d’une importance cruciale de semer des cardiomyocytes à une densité relativement faible (p. ex., 1000 cellules/cm2). De plus, le logiciel ne peut pas faire la distinction entre deux cardiomyocytes alignés de bout en bout et de longs cardiomyocytes singuliers. Ces types de grappes pourraient gonfler par erreur les estimations multinucléaires.
Bien que la méthode décrite ne permet pas d’obtenir des cardiomyocytes viables et ne peut donc pas être utilisé pour mesurer les processus cellulaires dynamiques, si l’objectif est d’effectuer l’immunostaining, nous croyons que la méthode décrite est supérieure aux protocoles existants avec des rendements plus élevés de cardiomyocytes et une meilleure qualité en termes de morphologie et de localisation des protéines. Enfin, la méthode décrite pourrait être utilisée pour isoler les cardiomyocytes des échantillons cliniques14,21. Nous croyons que la méthodologie décrite peut aider différents chercheurs à obtenir des cardiomyocytes de haute qualité et mesurer la nucléation et le stratagème comme substituts pour la formation de nouveaux cardiomyocytes.

Les maladies cardiaques ont été la principale cause de décès dans la majorité des pays occidentaux depuis de nombreuses décennies1,2. Bien que de nombreuses améliorations dans le traitement des maladies cardiovasculaires ont amélioré la survie, il n’existe actuellement aucun traitement qui peut remplacer les cardiomyocytes perdus. Par conséquent, les études liées à la fonction cardiomyocyte, la prolifération, l’apoptose et l’hypertrophie ont été et continuent d’être un foyer majeur de la communauté scientifique. Étant donné que le cœur des mammifères adultes a une capacité régénératrice très limitée, avec un taux de renouvellement des cardiomyocytes estimé à moins de 1 % par an, il est crucial d’identifier de manière fiable les événements prolifératifs de cardiomyocyte3,4. La plupart des stratégies qui mesurent les événements prolifératifs reposent soit sur la coloration pour les analogues incorporés de nucléotides d’ADN pour évaluer la prolifération précédente ou actuelle, ou la tache pour les marqueurs nucléaires de prolifération active5. Il est particulièrement important d’identifier de manière fiable les événements prolifératifs cardiomyocytes puisque le nombre global de cardiomyocytes prolifératifs est si faible3,,6. Par exemple, sur la base d’un taux de renouvellement de 1% de cardiomyocytes endogènes par an, on peut s’attendre à trouver entre 25 et 50 cardiomyocytes à proliférer à un moment donné dans le cœur de souris adulte7,8. Toute inexactitude dans l’identification des noyaux de cardiomyocyte pourrait mener à de faux résultats positifs. Par conséquent, il est essentiel d’identifier de manière fiable les noyaux de cardiomyocytes, qui se sont avérés difficiles et peu fiables à partir des sections histologiques9. L’identification des cardiomyocytes est beaucoup plus précise à partir des cellules individuelles que des sections de tissu car il pourrait être difficile de distinguer les cardiomyocytes d’autres types de cellules, même lorsque vous utilisez des marqueurs tels que α-actinine, bien que PCM1 pourrait être un marqueur fiable de noyaux cardiomyocytés dans les sections histologiques10.
Les protocoles actuels reposent sur l’isolement des cardiomyocytes vivants avant la fixation, qui est connu pour causer la mort d’au moins 30% des cardiomyocytes, et pourrait conduire à la sélection par inadvertance de populations spécifiques de cardiomyocytes11. En outre, ces protocoles sont notoirement difficiles à optimiser pour fournir des résultats reproductibles. Même les techniques d’isolation optimisées ne peuvent généralement pas produire plus de 65% de cardiomyocytes vivants en forme de tige avec des rendements variables12.
Pour surmonter ces problèmes, nous avons développé un protocole qui permet aux chercheurs d’isoler les cardiomyocytes fixes. Puisque les échantillons sont fixés avant l’isolement, le rendement est maximisé, et la morphologie in vivo est bien préservée. En outre, avec ce protocole, il est possible d’isoler les cardiomyocytes des échantillons cliniques, qui sont généralement fixés immédiatement après l’approvisionnement. En outre, pour identifier les cardiomyocytes nouvellement générés, il est important de mesurer le statut de nucléation et de stratagème des cardiomyocytes individuels, puisque seuls les cardiomyocytes diploïdes sont généralement supposés être nouvellement formés. La cytométrie de flux ne peut pas distinguer la multinucléation du polyploïdage et est un protocole relativement exigeant en temps et en ressources. La description manuelle et la mesure des noyaux dans les images sont très faibles et sujettes aux biais humains. La quantification automatisée des images de cardiomyocytes fixes et isolés tachés de DAPI résout ces deux problèmes. La détermination basée sur l’imagerie des distributions de nucléation et de stratagème peut être obtenue avec un minimum de temps et de réactifs à l’aide d’équipement de base.

<table><tbody><tr><td>Plaque à 96 puits pour l’imagerie</td><td>Corning</td><td>3340</td><td>Nous utilisons ces plaques car elles conviennent à l’imagerie, bien que les plaques à fond en verre seraient meilleures pour l’imagerie confocale</td></tr><tr><td>Alpha actinine</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-32462</td><td>Cet anticorps est utilisé comme marqueur des sarcomères cardiomyocytes</td></tr><tr><td>Ciseaux émoussés</td><td>Outils à ciseaux fins</td><td>14072-10</td><td>Nous préférons les ciseaux émoussés car la possibilité de déchirer le tissu cardiaque est plus faible lors de l’exposition du cœur</td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>664</td><td>Utilisé pour l’imagerie, l’évaluation de la ploïdie et de la nucléation dans la population de cardiomyocytes</td></tr><tr><td>Souris CD-1 Charles</td><td>river</td><td>22</td><td>Utilisé pour l’imagerie, l’évaluation de la ploïdie et de la nucléation dans la population de cardiomyocytes</td></tr><tr><td>Collagénase 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td>Aux fins de ce protocole, les différences entre les lots sont minimes et n’affectent pas le rendement global et la qualité de l’isolement</td></tr><tr><td>Sulfate de cuivre (II) pentahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203165-10G</td><td>Pour la coloration edu</td></tr><tr><td>Cy5 Picolyl Azide</td><td>Click Chemistry Tools</td><td>1177-25</td><td>Azoture utilisé pour la coloration edu</td></tr><tr><td>Cytation3</td><td>BioTek-Utilisé</td><td></td> <td>pour l’imagerie automatisée pour l’analyse de l’ADN</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td>DAPI utilisé pour la coloration de l’ADN. Les stocks ont été dissous dans de l’eau distillée.</td></tr><tr><td>âne anti-souris IgG-Alexa568</td><td>Life Technologies</td><td>A10037</td><td>Anticorps secondaire utilisé pour détecter la coloration de l’alpha-actinine dans les cardiomyocytes</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5137</td><td>Nous utilisons ces pinces incurvées et émoussées, bien que des pinces droites puissent également être utilisées</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144212</td><td>Pour régler le pH du tampon Tris-HCl à pH 8.5</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td><a href="https://imagej.net/Fiji/Downloads">imagej.net/Fiji/Downloads</a></td><td>-</td><td>Utilisé pour l’analyse d’images</td></tr><tr><td>Acide L-ascorbique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255564-100G</td><td>Pour la coloration edu</td></tr><tr><td>Aiguille pour perfusion</td><td>TERUMO</td><td>SV*23BLK</td><td>Nous utilisons des kits de perfusion à ailettes tout au long du protocole car il est facile de manipuler la position de l’aiguille avec ces kits pendant l’injection</td></tr><tr><td>Nikon A1R HD25</td><td></td> <td>Nikon-Utilisé</td> <td>pour prendre des images confocales de coloration à l’alpha actinine</td></tr><tr><td>Maille de nylon 200 microns</td><td>Filtrage Elko</td><td>03-200/54</td><td>Maille utilisée pour filtrer les cardiomyocytes réguliers (non hypertrophiés)</td></tr><tr><td>Maille de nylon 400 microns</td><td>Filtrage Elko</td><td>06-400/38</td><td>Maille utilisée pour filtrer les cardiomyocytes adultes hypertrophiés</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (1X)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>Celui-ci peut également être préparé en laboratoire. Bien que la stérilité soit importante dans cette expérience, nous pensons qu’elle est suffisante pour préparer le PBS et le filtrer</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium,</td><td>Mallinckrodt</td><td>granulaire 6858</td><td>Le chlorure de potassium granulaire a été préféré par nous car il forme moins d’agrégats lorsqu’il est stocké à température ambiante</td></tr><tr><td>R</td><td><a href="http://www.r-project.org/">r-project.org</a></td><td>-</td><td>Utilisé pour l’analyse des données des mesures obtenues à partir des images</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td>Utilisé pour tamponner la réaction de coloration EdU</td></tr></tbody></table>

isolement des cardiomyocytes des coeurs fixes pour l’immunocytochimie et l’analyse de ploy

Isolation of Cardiomyocytes from Fixed Hearts for Immunocytochemistry and Ploidy Analysis

Le cœur des mammifères adultes est composé de différents types de cellules, y compris les cardiomyocytes, les cellules endothéliales et les fibroblastes. Puisqu’il est difficile d’identifier de manière fiable les noyaux de cardiomyocytes sur les sections histologiques, beaucoup de groupes comptent sur l’isolement des cardiomyocytes viables avant la fixation pour effectuer l’immunostaining. Cependant, ces techniques d’isolation des cardiomyocytes vivants nécessitent une optimisation pour maximiser le rendement, la viabilité et la qualité des échantillons, avec des fluctuations inhérentes d’échantillon à échantillon malgré une optimisation maximale. Ici, nous rapportons un protocole reproductible, impliquant la fixation avant la digestion enzymatique du coeur, qui conduit au rendement maximum tout en préservant la morphologie in vivo des cardiomyocytes individuels. Nous avons développé une plate-forme d’analyse automatisée pour déterminer le nombre de noyaux et de contenu d’ADN par noyau pour les cardiomyocytes individuels. Après avoir exposé la cavité thoracique, le cœur a été arrêté dans le diastole par perfusion avec 60 mM KCl dans PBS. Ensuite, le cœur a été fixé dans 4% de solution de paraformaldéhyde (PFA), puis digéré avec 60 mg/mL solution de collagènease. Après digestions, les cellules ont été singularisées par trituration, et la fraction de cardiomyocyte a été enrichie par la centrifugation différentielle. Des cardiomyocytes isolés ont été tachés pour troponin T et α-actinine pour évaluer la pureté de la population obtenue. En outre, nous avons développé une plate-forme d’analyse d’image pour déterminer la nucléation de cardiomyocyte et le statut de ploidy suivant la coloration de DAPI. Les évaluations de stratagèmes basées sur l’image ont mené à des résultats cohérents et reproductibles. Ainsi, avec ce protocole, il est possible de préserver la morphologie indigène des cardiomyocytes individuels pour permettre l’immunocytochemie et l’analyse de la teneur en ADN tout en obtenant un rendement maximal.

Les cardiomyocytes ont été isolés selon le protocole décrit ci-dessus. En utilisant cette méthode, nous obtenons généralement des cardiomyocytes uniformément singuliers qui sont relativement purs sans contaminer les cellules non cardiomyocytes (Figure 1A). Les cardiomyocytes sont facilement identifiables sous la microscopie lumineuse de champ en raison de leur taille caractéristique et de la birefringence. Cette technique est facile à mettre en œuvre et fournit des résultats cohérents de différents isolements avec des rendements et une qualité de cardiomyocytes comparables (Figure 1B). Les cardiomyocytes isolés peuvent être stockés à 4 °C pendant plusieurs semaines avant d’être utilisés davantage.
Les cardiomyocytes qui ont été isolés selon le protocole ci-dessus peuvent être utilisés pour diverses applications en aval, telles que la taille de cardiomyocyte, le stratagème de cardiomyocyte et l’immunocytochimie. En conséquence représentative, nous montrons que les cardiomyocytes isolés selon ce protocole peuvent être tachés à l’aide d’anticorps et d’azides fluorochromes conjugués pour la chimie des clics afin de détecter la localisation de protéines spécifiques ou de détecter la réplication de l’ADN cardiomyocyte, respectivement. Par exemple, nous avons taché des cardiomyocytes avec des anticorps reconnaissant α-actinine pour montrer le modèle caractéristique de coloration en ligne z des sarcomeres (Figure 2A). Dans une expérience distincte, nous avons administré l’analogue de thymidine 5-Ethynyl-2'-désoxyuridine (Edu) aux souris avant d’isoler les cardiomyocytes fixes. Après l’isolement cardiomyocyte, nous avons taché pour incorporé EdU utilisant les protocoles standard13, et avons été en mesure de détecter les cardiomyocytes qui avaient subi la phase S dans les cardiomyocytes mononucléés, binucléated et trinucléés (Figure 2B).
Pour étendre davantage l’utilité de la méthode d’isolement, nous avons développé un pipeline qui permet la quantification du stratagème de cardiomyocyte basé sur la coloration intégrée de l’ADN. Pour pouvoir mesurer l’état de stratagème des cellules ou des noyaux, nous avons eu besoin de segmenter les noyaux et les cardiomyocytes. La figure 3 montre une représentation de la stratégie que nous avons utilisée pour identifier les noyaux individuels. Tout d’abord, l’image originale tachéed’ADN( figure 3A) est seuil basée surl’intensité( Figure 3B). Ici, nous avons utilisé DAPI pour tacher pour l’ADN, mais tout autre colorant nucléaire qui montre une corrélation linéaire avec la teneur en ADN fonctionnerait. Le programme permet de choisir l’une des méthodes de seuil d’intensité des Fidji, mais dans cet exemple, la méthode d’Otsu a été utilisée. Les masques nucléaires qui touchent le bord de l’image ou qui sont plus petits que le seuil de zone minimale de pixel spécifié sont exclus. Ensuite, les ellipses sont adaptées aux masques nucléaires, segmentant les noyaux individuels. La figure 3C montre ces ellipses superposées sur l’image d’origine. Ensuite, les trous sont remplis dans les masques, et les pixels de l’image sont ensuite divisés en territoires basés sur laquelle ellipse ils sont les plus proximaux à (Figure 3D). Les frontières de ces territoires sont ensuite utilisées pour tracer des lignes à travers les grappes nucléaires, en terminant le processus de segmentation nucléaire (Figure 3E).
L’étape suivante consiste à détecter les cardiomyocytes. Pour les images cardiomyocytes obtenues à partir de cellules tachées fluorescentes (Figure 4A),le processus est très similaire à celui des noyaux. L’image est seuilnée en fonction d’une valeur d’intensité calculée par la méthode de seuil sélectionnée, dans ce cas la méthode triangle. Les masques cardiomyocytes identifiés qui touchent la limite de l’image ou qui sont en dessous d’une certaine taille sont exclus et des trous sont remplis dans les masques pour fournir des cardiomyocytes correctement segmentés (figure 4B). Parce que les cardiomyocytes ont une forme plus irrégulière que les noyaux, aucune tentative n’est faite pour segmenter les grappes de cardiomyocytes. Au lieu de cela, ces grappes sont exclues en fonction de leur diamètre minimum élevé feret au cours de l’étape d’analyse. La segmentation des images de champ lumineux se fait légèrement différemment. Tout d’abord, l’image de champ lumineuxd’origine( Figure 4C) est traitée avec un filtre de bord Sobel. Ce filtre calcule la valeur absolue du dégradé de chaque pixel dans l’image. Les pixels dans les régions avec des changements rapides reçoivent des valeurs élevées et les pixels dans les régions lisses de l’image reçoivent des valeurs faibles. Cette image filtrée par bord est ensuite seuil par intensité, à l’aide de la méthode Triangle, résultant en cardiomyocytes masqués (Figure 4D). Ces masques très irréguliers sont ensuite lissés et reliés entre eux par fermeture morphologique à l’aide d’un cercle d’un rayon de 2 pixels, qui remplit toutes les régions blanches de l’image où le cercle ne peut s’adapter sans superposer une région noire (Figure 4E). Enfin, les trous dans les masques sont remplis, les régions touchant la frontière sont exclues, et de petites particules sont enlevées, ce qui termine le processus de segmentation des cardiomyocytes (Figure 4F).
À l’aide de la stratégie de segmentation décrite, nous pouvons alors déterminer l’état de nucléation des cardiomyocytes individuels. En utilisant cette approche, nous avons déterminé l’état de nucléation des cardiomyocytes isolés des coeurs des souris de CD-1 outbred aux temps postnatal tôt. Les cœurs de souris nouveau-nées (premier jour de la vie) ont montré que la majorité des cardiomyocytes à ce moment-là sont mononucléés (figure 5: néonatal). Cette fréquence élevée de cardiomyocytes mononucléés est beaucoup plus faible chez les souris juvéniles (2 semaines), où les cardiomyocytes mononucléés représentent environ 25 % de la population totale de cardiomyocytes(figure 5: juvénile). Enfin, nous pouvons mesurer le statut de stratagème des noyaux individuels dans les cardiomyocytes, et déterminer s’ils sont diploïdes ou tétraploïdes. Ces résultats montrent une fréquence plus élevée des noyaux tétraploïdes chez les souris adolescentes (figure 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60938/60938fig1.jpg"> Figure 1 : Efficacité de l’isolement de cardiomyocyte après fixation. (A) Image représentative des cardiomyocytes isolés tachés de DAPI pour montrer des noyaux. (DAPI (bleu), Brightfield (gris)) (B) Rendement des cardiomyocytes isolés de différentes souris à l’âge de 3 mois. Barres d’échelle = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/60938fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60938/60938fig2.jpg"> Figure 2 : Immunocytochimie des cardiomyocytes isolés. (A) Image représentative des cardiomyocytes tachés pour α-actinine (α-actinine (rouge) et DAPI (bleu)). (B) Cardiomyocytes tachés pour incorporé EdU (rouge) et DAPI (bleu). Des cardiomyocytes représentatifs qui sont mononucléés (à gauche), binucléisés (au milieu) et trinucléés (à droite) et edu positifs sont montrés. Barres d’échelle = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/60938fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60938/60938fig3.jpg"> Figure 3 : Stratégie de segmentation nucléaire. (A) Image originale du canal DAPI. (B) Image à seuil (dans cet exemple, la méthode d’Otsu a été utilisée). (C) Masques identifiés à partir des images à seuil superposées sur l’image tachée originale du DAPI. (D) Tessellation voronoi basée sur des masques nucléaires. (E) Derniers noyaux segmentés, avec des grappes fractionnées mises en surbrillance. Barres d’échelle = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/60938fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60938/60938fig4.jpg"> Figure 4 : Stratégie de segmentation des cardiomyocytes. (A) Original fluorescent Troponin J’ai taché image cardiomyocyte. (B) Image à seuil triangle, après avoir rempli les trous et à l’exclusion des petits objets et de ceux qui touchent la bordure. (C) Image cardiomyocyte de champ lumineux originale (D) Image cardiomyocyte de bord-filtrée et triangle-seuiled (E) Image morphologique de bord après fermeture morphologique avec un rayon de deux pixels (F) Même image après avoir rempli des trous et à l’exclusion des petits objets et ceux touchant la frontière. Barres d’échelle = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/60938fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60938/60938fig5.jpg"> Figure 5 : Classification des cardiomyocytes en fonction du nombre de noyaux. Les cœurs néonatals (1 jour) contiennent plus de cardiomyocytes mononucléés que les cœurs juvéniles (14 jours). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/60938fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60938/60938fig6.jpg"> Figure 6 : Distribution de la teneur en ADN de cardiomyocyte par noyau. Chez les nouveau-nés (à gauche), 13,5 % des noyaux CM mononucléés sont tétraploïdes et 11,9 % des noyaux cm binucléated sont tétraploïdes. Chez les juvéniles (à droite), 33,9 % des noyaux CM mononucléés sont tétraploïdes et 31,2 % des noyaux cm binucléisés sont tétraploïdes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/60938fig6large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Fichier supplémentaire 1 : Captures d’écran logicielles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/SoftwareScreenshots.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir ce fichier (cliquez avec le bouton droit pour télécharger).</a>
Dossier supplémentaire 2 : AnalyzeNucleation.py. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/AnalyzeNucleation.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir ce fichier (cliquez avec le bouton droit pour télécharger).</a>
Fichier supplémentaire 3 : AnalyzeMultinucleatedServer.R. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/AnalyzeMultinucleatedServer.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir ce fichier (cliquez avec le bouton droit pour télécharger).</a>

Le but de ce travail est de développer une méthode pour isoler de façon reproductiblement les cardiomyocytes du cœur adulte et mesurer la teneur en ADN et la nucléation.

Isolement des cardiomyocytes des coeurs fixes pour l’immunocytochimie et l’analyse de ploy

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably ...

Ce protocole fournit une méthode pour isoler les cardiomyocytes en forme de tige de n’importe quel tissu cardiaque, qui peut alors être employé pour mesurer le ploidy et l’état de nucléation de ces cardiomyocytes sans analyse manuelle. Comparé à d’autres techniques, notre protocole fournit des rendements cellulaires plus cohérents et la morphologie cellulaire, et par opposition à la cytométrie de flux, nous sommes en mesure de vérifier visuellement la nucléation et l’état de stratagème des cardiomyocytes. La démonstration visuelle de cette méthode est importante parce que la division et l’association de tissu cardiaque sont plus faciles à apprécier.Commencez par placer la souris euthanasiée dans une position supine, et en tapant vers le bas les membres étendus. Utilisez des ciseaux à tête émoussée pour couper à travers la poitrine pour exposer le cœur. Ensuite, coupez l’aorte descendante et le cava vena inférence.Utilisez une pompe périssaltique fixée à une infusion avec une aiguille papillon de calibre 23 pour parcourir le cœur en injectant trois millilitres de chlorure de potassium solution PBS à travers le ventricule gauche. Assurez-vous de ne pas percer à travers le septum. Injectez ensuite 10 millilitres de solution PFA à 4% pendant 10 minutes à raison d’un millilitre par minute.Utilisez des ciseaux pour enlever tout le cœur. Et si désiré, isoler une région spécifique. Placez le tissu dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre contenant une millilitre de solution PFA à 4 %.Incubez-le sur un rocker pendant une heure. Placez le cœur dans une boîte de Pétri avec la solution PBS. Pressez-le pour vous débarrasser de tout PFA restant dans les ventricules et lavez-le dans PBS.Mettez le cœur fixe dans un nouveau tube de 1,5 millilitre contenant de la solution de collagène. Puis incuber le cœur sur un rocker à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, mettez le cœur dans une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant de la solution de collagène, et dissociez-le en morceaux d’un millimètre avec des forceps ou des ciseaux.Ensuite, utilisez une pipette de transfert pour triturer davantage le tissu dissocié pendant deux minutes. Si les particules de tissu demeurent, utilisez une pipette avec une pointe plus étroite et continuez la trituration jusqu’à ce que la majorité du tissu soit décomposé. Placer un maillage en nylon de 200 à 600 micromètres sur un tube de centrifugeuse de 15 millimètres.Ajouter cinq millilitres de PBS aux cellules dissociées et les filtrer à travers le maillage en nylon. Lavez le maillage en nylon en passant quatre millilitres supplémentaires de PBS. Puis centrifugez la solution filtrée à 10 à 100 fois G pendant une minute.Jetez le supernatant et resuspendez la pastille en 10 millilitres de PBS avant de les colorer. Après avoir téléchargé la distribution fidjienne de l’image J, ouvrez Fidji et cliquez sur l’aide, mettez à jour et gérez les sites de mise à jour. Vérifiez les plugins biomed group et IFPB.Pour télécharger les plugins dépendances, ellipse split et morpho lib J.Then cliquez sur fermer et appliquer des modifications. Ensuite, téléchargez RStudio et ouvrez-le. Copiez le code du manuscrit du texte dans la ligne de commande de RConsole et appuyez sur entrez.puis tapez Y en réponse à toutes les invites à installer toutes nos dépendances. Pour effectuer la quantification de l’image, ouvrez Fidji et faites glisser l’analysenucléation. py dans la barre d’état.Lorsque la fenêtre d’édition du script s’ouvre, cliquez sur exécuter dans le coin inférieur gauche. Une boîte de dialogue apparaîtra demandant l’emplacement de l’annuaire des données de sortie. Sélectionnez le dossier où toutes les données d’analyse, les chiffres et autres données utilisés par le logiciel seront stockés.Dans les paramètres d’analyse, sélectionnez l’emplacement des images à analyser et entrez le format de nom du fichier d’image à l’aide d’expressions régulières. Après avoir sélectionné les paramètres souhaités, cliquez sur OK. Au fur et à mesure que des images provenant de différentes étapes du pipeline d’analyse apparaissent à l’écran, inspectez-les pour vous assurer que le seuil et la segmentation se produisent correctement. Analysemultinucleatedserver ouvert.r en Rstudio. Ensuite, à la variable nommée nom du dossier, tapez le chemin de fichier vers le dossier de données de sortie sélectionné dans la dernière étape sans la barre oblique finale. Cliquez sur exécuter l’application dans le coin supérieur gauche de la fenêtre d’édition du script.Utilisez les curseurs pour fixer des seuils pour le seuil minimum valide d’intensité moyenne nucléaire, le seuil minimum valide de la zone nucléaire et le diamètre minimum maximum valide des furets pour les cardiomyocytes. Faites défiler vers le bas et cliquez sur appliquer des seuils sélectionnés, puis cliquez sur la distribution de l’intensité de l’intrigue, ce qui rendra une parcelle de la distribution de l’intensité du noyau de l’échantillon entier ainsi que des sous-intrigues distinctes pour chaque variable de regroupement. Pour tenir compte de la variation intra-échantillon, faites défiler vers le bas et vérifiez normaliser séparément par groupe, puis cliquez sur calculer le stratagème et tracer la répartition estimée du stratagème.Une fois que le graphique normalisé de l’échantillon entier apparaît, les deux modèles de pointe doivent être visibles. Utilisez les curseurs et sélectionnez les seuils pour isoler les pics diploïdes et tétraploïdes les uns des autres et les valeurs aberrantes. Puis faites défiler vers le bas et cliquez sur calculer le stratagème et la nucléation.Enfin, cliquez sur l’intrigue du bouton et enregistrer dans le dossier de résultats. Cette méthode peut être utilisée pour isoler des cardiomyocytes uniformément singularisés qui sont relativement purs sans contaminer les cellules. Il est facile à mettre en œuvre et fournit des rendements cardiomyocytes cohérents et la qualité de différents isolements.Les cardiomyocytes isolés avec ce protocole peuvent être tachés à l’aide d’anticorps et d’azides conjugués fluorochrome. Pour montrer le modèle caractéristique de coloration de ligne de Z des sarcomeres, les cellules ont été souillées avec des anticorps reconnaissant l’actinine d’alpha. Dans une expérience distincte, EdU a été administré à des souris avant d’isoler les cardiomyocytes fixes.Après isolement, les cardiomyocytes mononucléated, binucleated, et trinucleated qui avaient subi la phase de S ont été détectés. Pour identifier les noyaux individuels, l’image tachée d’ADN d’origine a été seuil en fonction de l’intensité. Les ellipses étaient adaptées aux masques nucléaires, segmentant les noyaux individuels.Ensuite, les pixels de l’image ont été divisés en territoires basés sur l’ellipse à laquelle ils sont les plus proximaux, et les frontières de ces territoires ont été utilisées pour tracer des lignes à travers les grappes nucléaires. Un processus similaire de segmentation a été utilisé pour détecter les cardiomyocytes. Cette stratégie de segmentation a montré que la majorité des cardiomyocytes de souris nouveau-nées sont mononucléés.La fréquence des cardiomyocytes mononucléés est beaucoup plus faible chez les souris âgées de deux semaines, où elles composent environ 25 % de la population totale de cardiomyocytes. Quand le statut de stratagème des noyaux individuels dans les cardiomyocytes a été mesuré, une fréquence plus élevée des noyaux tétraploïdes a été détectée chez les souris juvéniles. Lors de l’isolement des cardiomyocytes, il est important de vérifier que toutes les touffes cellulaires se sont rompues de leur trituration.

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