Isolement des cardiomyocytes des coeurs fixes pour l’immunocytochimie et l’analyse de ploy

Ce protocole fournit une méthode pour isoler les cardiomyocytes en forme de tige de n’importe quel tissu cardiaque, qui peut alors être employé pour mesurer le ploidy et l’état de nucléation de ces cardiomyocytes sans analyse manuelle. Comparé à d’autres techniques, notre protocole fournit des rendements cellulaires plus cohérents et la morphologie cellulaire, et par opposition à la cytométrie de flux, nous sommes en mesure de vérifier visuellement la nucléation et l’état de stratagème des cardiomyocytes. La démonstration visuelle de cette méthode est importante parce que la division et l’association de tissu cardiaque sont plus faciles à apprécier.

Commencez par placer la souris euthanasiée dans une position supine, et en tapant vers le bas les membres étendus. Utilisez des ciseaux à tête émoussée pour couper à travers la poitrine pour exposer le cœur. Ensuite, coupez l’aorte descendante et le cava vena inférence.

Utilisez une pompe périssaltique fixée à une infusion avec une aiguille papillon de calibre 23 pour parcourir le cœur en injectant trois millilitres de chlorure de potassium solution PBS à travers le ventricule gauche. Assurez-vous de ne pas percer à travers le septum. Injectez ensuite 10 millilitres de solution PFA à 4% pendant 10 minutes à raison d’un millilitre par minute.

Utilisez des ciseaux pour enlever tout le cœur. Et si désiré, isoler une région spécifique. Placez le tissu dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre contenant une millilitre de solution PFA à 4 %.

Incubez-le sur un rocker pendant une heure. Placez le cœur dans une boîte de Pétri avec la solution PBS. Pressez-le pour vous débarrasser de tout PFA restant dans les ventricules et lavez-le dans PBS.

Mettez le cœur fixe dans un nouveau tube de 1,5 millilitre contenant de la solution de collagène. Puis incuber le cœur sur un rocker à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, mettez le cœur dans une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant de la solution de collagène, et dissociez-le en morceaux d’un millimètre avec des forceps ou des ciseaux.

Ensuite, utilisez une pipette de transfert pour triturer davantage le tissu dissocié pendant deux minutes. Si les particules de tissu demeurent, utilisez une pipette avec une pointe plus étroite et continuez la trituration jusqu’à ce que la majorité du tissu soit décomposé. Placer un maillage en nylon de 200 à 600 micromètres sur un tube de centrifugeuse de 15 millimètres.

Ajouter cinq millilitres de PBS aux cellules dissociées et les filtrer à travers le maillage en nylon. Lavez le maillage en nylon en passant quatre millilitres supplémentaires de PBS. Puis centrifugez la solution filtrée à 10 à 100 fois G pendant une minute.

Jetez le supernatant et resuspendez la pastille en 10 millilitres de PBS avant de les colorer. Après avoir téléchargé la distribution fidjienne de l’image J, ouvrez Fidji et cliquez sur l’aide, mettez à jour et gérez les sites de mise à jour. Vérifiez les plugins biomed group et IFPB.

Pour télécharger les plugins dépendances, ellipse split et morpho lib J.Then cliquez sur fermer et appliquer des modifications. Ensuite, téléchargez RStudio et ouvrez-le. Copiez le code du manuscrit du texte dans la ligne de commande de RConsole et appuyez sur entrez.

puis tapez Y en réponse à toutes les invites à installer toutes nos dépendances. Pour effectuer la quantification de l’image, ouvrez Fidji et faites glisser l’analysenucléation. py dans la barre d’état.

Lorsque la fenêtre d’édition du script s’ouvre, cliquez sur exécuter dans le coin inférieur gauche. Une boîte de dialogue apparaîtra demandant l’emplacement de l’annuaire des données de sortie. Sélectionnez le dossier où toutes les données d’analyse, les chiffres et autres données utilisés par le logiciel seront stockés.

Dans les paramètres d’analyse, sélectionnez l’emplacement des images à analyser et entrez le format de nom du fichier d’image à l’aide d’expressions régulières. Après avoir sélectionné les paramètres souhaités, cliquez sur OK. Au fur et à mesure que des images provenant de différentes étapes du pipeline d’analyse apparaissent à l’écran, inspectez-les pour vous assurer que le seuil et la segmentation se produisent correctement. Analysemultinucleatedserver ouvert.

r en Rstudio. Ensuite, à la variable nommée nom du dossier, tapez le chemin de fichier vers le dossier de données de sortie sélectionné dans la dernière étape sans la barre oblique finale. Cliquez sur exécuter l’application dans le coin supérieur gauche de la fenêtre d’édition du script.

Utilisez les curseurs pour fixer des seuils pour le seuil minimum valide d’intensité moyenne nucléaire, le seuil minimum valide de la zone nucléaire et le diamètre minimum maximum valide des furets pour les cardiomyocytes. Faites défiler vers le bas et cliquez sur appliquer des seuils sélectionnés, puis cliquez sur la distribution de l’intensité de l’intrigue, ce qui rendra une parcelle de la distribution de l’intensité du noyau de l’échantillon entier ainsi que des sous-intrigues distinctes pour chaque variable de regroupement. Pour tenir compte de la variation intra-échantillon, faites défiler vers le bas et vérifiez normaliser séparément par groupe, puis cliquez sur calculer le stratagème et tracer la répartition estimée du stratagème.

Une fois que le graphique normalisé de l’échantillon entier apparaît, les deux modèles de pointe doivent être visibles. Utilisez les curseurs et sélectionnez les seuils pour isoler les pics diploïdes et tétraploïdes les uns des autres et les valeurs aberrantes. Puis faites défiler vers le bas et cliquez sur calculer le stratagème et la nucléation.

Enfin, cliquez sur l’intrigue du bouton et enregistrer dans le dossier de résultats. Cette méthode peut être utilisée pour isoler des cardiomyocytes uniformément singularisés qui sont relativement purs sans contaminer les cellules. Il est facile à mettre en œuvre et fournit des rendements cardiomyocytes cohérents et la qualité de différents isolements.

Les cardiomyocytes isolés avec ce protocole peuvent être tachés à l’aide d’anticorps et d’azides conjugués fluorochrome. Pour montrer le modèle caractéristique de coloration de ligne de Z des sarcomeres, les cellules ont été souillées avec des anticorps reconnaissant l’actinine d’alpha. Dans une expérience distincte, EdU a été administré à des souris avant d’isoler les cardiomyocytes fixes.

Après isolement, les cardiomyocytes mononucléated, binucleated, et trinucleated qui avaient subi la phase de S ont été détectés. Pour identifier les noyaux individuels, l’image tachée d’ADN d’origine a été seuil en fonction de l’intensité. Les ellipses étaient adaptées aux masques nucléaires, segmentant les noyaux individuels.

Ensuite, les pixels de l’image ont été divisés en territoires basés sur l’ellipse à laquelle ils sont les plus proximaux, et les frontières de ces territoires ont été utilisées pour tracer des lignes à travers les grappes nucléaires. Un processus similaire de segmentation a été utilisé pour détecter les cardiomyocytes. Cette stratégie de segmentation a montré que la majorité des cardiomyocytes de souris nouveau-nées sont mononucléés.

La fréquence des cardiomyocytes mononucléés est beaucoup plus faible chez les souris âgées de deux semaines, où elles composent environ 25 % de la population totale de cardiomyocytes. Quand le statut de stratagème des noyaux individuels dans les cardiomyocytes a été mesuré, une fréquence plus élevée des noyaux tétraploïdes a été détectée chez les souris juvéniles. Lors de l’isolement des cardiomyocytes, il est important de vérifier que toutes les touffes cellulaires se sont rompues de leur trituration.