Identification sur le terrain de Matricaria chamomilla à l’aide d’un système qPCR portable

La pratique de l’utilisation de plantes pour améliorer la santé remonte à des milliers d’années. Récemment, l’augmentation de la demande, conjuguée à des pratiques de récolte non durables et au changement climatique, a mis l’accent sur la chaîne d’approvisionnement. Pour cette raison, l’adultère botanique devient une préoccupation croissante, faisant de l’identification botanique une partie de plus en plus essentielle du contrôle de la qualité.

Idéalement, l’identification est effectuée le plus près possible de la source, de sorte que les ressources peuvent être affectées efficacement au matériel d’identité correcte. Il existe un certain nombre d’approches pour l’identification botanique. Traditionnellement, l’identification botanique est effectuée au moyen d’évaluations morphologiques et de méthodes d’analyse chimique.

L’identification morphologique est basée sur des différences dans les caractéristiques macroscopiques et microscopiques des matériaux végétaux. Cependant, il nécessite un botaniste bien formé et son application aux matériaux botaniques en poudre est limitée. Les méthodes d’analyse chimique sont largement utilisées dans les pharmacopées et les laboratoires, mais ne sont pas idéales pour les essais sur le terrain en raison de la taille des instruments et des exigences environnementales.

Récemment, les méthodes génomiques sont apparues comme une technique alternative pour l’identification des espèces botaniques en raison de la haute fidélité et de la spécificité de l’information génomique dans les matériaux végétaux. Avec des outils de diagnostic moléculaire maintenant disponibles sous forme d’appareils portables, cette approche devient possible pour l’application sur le terrain. L’objectif de ce protocole est d’introduire une méthode d’identification botanique dans les situations où l’accès à l’équipement et à l’expertise de laboratoire est limité, comme la ferme fournissant le matériel botanique, à l’aide d’un système qPCR portatif.

Matricaria chamomilla, communément connu sous le nom de camomille allemande, a été utilisé comme un médicament à base de plantes pour promouvoir la santé pendant des siècles. Pour démontrer la spécificité de la méthode actuelle, la différenciation de la camomille allemande d’une autre fleur de camomille couramment utilisée, connue sous le nom de camomille romaine, est incluse à titre de comparaison. La procédure d’identification sur le terrain est démontrée au milieu d’une ferme allemande de camomille.

Installez une zone d’essai sur le terrain avec une surface plane et horizontale. Identifier une plante représentative qui reflète les caractéristiques de la majorité des plantes dans le champ de fleurs de camomille. Choisissez une tête de fleur de la plante représentative à l’aide de gants stériles.

Placez l’échantillon dans un tube de collecte de 2,0 millilitres. Répéter et recueillir un dépliant d’environ 0,5 à 0,7 centimètre de long de la même plante. Préchauffer l’incubateur de bain sec à 95 degrés Celsius.

À chaque tube de collecte, ajouter 100 microlitres de la solution d’extraction de la trousse d’extraction d’ADN de la plante. Pour une meilleure efficacité d’extraction de l’ADN, moudre l’échantillon à l’aide d’un pilon tissulaire. Fermez le tube.

Assurez-vous que le tissu botanique est couvert par la solution d’extraction tout au long du processus d’extraction. Placer les tubes de collecte dans un incubateur de bain sec préchauffé, et incuber les tubes de collecte à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes Après 10 minutes, sortir les tubes de l’incubateur de bain sec. Ajouter 100 microlitres de la solution de dilution de la trousse d’extraction d’ADN et mélanger la solution en pipetage de haut en bas à plusieurs reprises.

Répétez la même étape pour l’extraction des folioles. Agiter pour mélanger la solution plus loin. La question de la plante ne semble généralement pas dégradée après ce traitement.

La couleur liquide peut changer et devenir trouble. Configurer les conditions de thermocyclisme de l’instrument qPCR selon le tableau 1, qui commence par une étape de température constante pour la dénaturation initiale, suivie de 25 cycles d’amplification et se termine par une montée en puissance de la température pour obtenir une courbe de fusion à haute résolution. Décongeler le mélange principal qPCR et les amorces énumérés dans le tableau deux à température ambiante avant utilisation.

Planifiez la réaction qui sera chargée dans chaque puits. Puits contenant des contrôles positifs avec les espèces cibles, des contrôles positifs avec des espèces non cibles, des échantillons et des contrôles négatifs. Dans cet exemple, 10 puits sont utilisés, cinq pour le test allemand d’identification de la camomille et cinq autres pour le test d’identification de la camomille romaine.

Pour chaque type de test d’identification des espèces, un puits contient un contrôle positif avec de l’ADN extrait du matériau de référence ciblé de l’espèce, un puits contient un contrôle positif avec de l’ADN extrait du matériel de référence d’espèces non ciblé, deux puits sont remplis d’échantillons d’ADN de fleurs et de feuilles extraits du champ, et un puits est attribué pour un contrôle négatif. Le tableau trois décrit chaque type de puits. Préparez un mélange maître de réaction selon le tableau quatre pour chaque test d’identification des espèces botaniques.

Un mélange typique de maître de réaction contient le mélange principal universel de qPCR, deux fois, les amorces spécifiques d’espèces avant et inverses, et l’eau nucléase-libre. Bien mélangé le mélange maître de réaction par pipetting avant utilisation. Placez la cartouche de réaction PCR face vers le haut sur une surface plane et stable.

Chargez 18 microlitres du mélange maître de réaction configuré dans l’étape précédente dans les puits de cartouche selon les puits définis ici. Pour cette démonstration, ajoutez le mélange allemand de maître de réaction d’identification de camomille dans les puits étiquetés pour l’essai de GC, GCT dans les puits un, trois, cinq, sept, neuf, et le mélange romain de maître de réaction d’identification de camomille dans les puits étiquetés pour l’essai de RC, RCT dans les puits deux, quatre, six, huit, 10. Transférer deux microlitres d’ADN d’échantillon du surnatant des tubes d’extraction d’ADN et des contrôles positifs pré-extraits d’ADN dans des puits de cartouche préchargés avec le mélange principal de qPCR.

Après avoir ajouté chaque modèle d’ADN au mélange principal qPCR, mélangez doucement la solution par pipetting. Sceller soigneusement la cartouche avec du film adhésif. Chargez la cartouche sur la chambre thermocyclique et fermez-la.

Réglez l’instrument qPCR à exécuter. Dans le protocole actuel, le colorant intercalaire est utilisé pour mesurer l’amplification des fragments cibles en temps réel. La valeur Ct est définie comme le nombre de cycles requis pour que le signal fluorescent franchit le seuil prédéfini.

Une valeur Ct inférieure à 25 cycles a été considérée comme une amplification positive. Dans ce chiffre, le contrôle positif romain n’a été amplifié que dans le test d’identification de la camomille romaine, mais pas dans le test d’identification de la camomille allemande. Le contrôle positif de camomille allemande et les échantillons de champ ont été amplifiés seulement dans le test allemand d’identification de camomille, mais pas dans le test romain d’identification de camomille.

Le contrôle négatif n’a pas été amplifié dans l’un ou l’autre test. Pour confirmer davantage l’amplification spécifique dans les contrôles et les échantillons positifs, des fractions de PCR et de produits de chaque puits ont été exécutés sur le gel d’agarose de 2% dans le laboratoire. Tous les puits d’une valeur Ct inférieure à 25 ont donné des amplicons à leur taille prévue, qui diffèrent entre la camomille allemande et la camomille romaine.

Le reste des voies n’a montré aucun produit d’amplification spécifique, en accord avec l’absence de signal fluorescent pour ces puits comme on l’a observé lors des essais sur le terrain. Après amplification pcr, une analyse de la courbe de fusion a été effectuée à l’aide du même logiciel qui a été utilisé pour surveiller le signal fluorescent. Avec l’augmentation de la température, les amplicons à double brin commencent à se dissocier, ce qui entraîne une diminution de l’intensité de la fluorescence.

Les changements d’intensité de fluorescence ont été convertis en courbes de pic de fusion pour une plus grande différenciation de la camomille allemande par rapport à la camomille romaine par leurs pics de fusion caractéristiques. Dans ce chiffre, le pic de fonte de la camomille allemande contrôle positif est de 85,6 degrés Celsius et il est distinct du pic de fusion de la camomille romaine contrôle positif. Les amplicons PCR provenant d’échantillons sur le terrain produisent des pics de fusion proches du contrôle positif de la camomille allemande.

L’identité de l’échantillon sur le terrain est déterminée en fonction de l’amplification spécifique et de la température de fusion caractéristique qui correspond aux commandes. Dans cet exemple, les fleurs et les feuilles recueillies dans le champ sont identifiées comme matricaria chamomilla, camomille allemande. Les résultats des tests de camomille romaine pour ces deux échantillons sont négatifs.

Le protocole démontre l’identification de la camomille allemande sur le terrain à l’aide d’un système qPCR portable. Des méthodes similaires peuvent-nous développer pour élargir le portefeuille de plantes qui peuvent être testées. Nous espérons que cette vidéo fournira du matériel de formation précieux pour les scientifiques, même les non-experts pour effectuer l’identification botanique sur le terrain ou dans un environnement avec un équipement de laboratoire limité.

Les tests d’identification sur le terrain basés sur l’ADN produisent non seulement des résultats très précis qui correspondent à l’analyse de laboratoire, mais réduisent également le temps et les coûts associés aux méthodes traditionnelles effectuées en laboratoire.