Purification des fibroblastes et des cellules de Schwann des nerfs sensoriels et moteurs in vitro

Ce protocole peut être utilisé pour obtenir un grand nombre de capteurs et les cellules du moteur fibroblaste et Schwann rapidement. Les cellules obtenues grâce à ce message peuvent être utilisées dans l’étude de la régénération nerveuse et des maladies du système nerveux. Nous montrons que la démonstration peut représenter l’expérimental pour mieux contrôler le temps de l’étape digestive différentielle et rendre les étapes expérimentales plus faciles à comprendre.

Pour éclater utiliser des ciseaux pour faire une incision de trois centimètres, dans la peau du dos. Retirer la colonne vertébrale. Ouvrez soigneusement le canal vertébral pour exposer la moelle épinière.

Dentelle de la moelle épinière dans une boîte de Pétri de 60 millimètres, avec trois à quatre millilitres de glace froide D Hanks solution de sel équilibré sous un microscope disséquant, exciser la racine ventrale et la racine dorsale. Placez-les dans la solution de sel équilibré D Hanks glacée. Après avoir enlevé le HBSS, couper les nerfs en morceaux de trois à cinq millimètres, avec des ciseaux.

Ajouter un millilitre de trypsine de 0,25 % et transférer les morceaux nerveux dans cinq tubes de centrifugeuse millilitres. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 18 à 20 minutes. Ensuite, pour arrêter la digestion, ajouter à trois à quatre millilitres de DMEM contenant 10% de sérum bovin fœtal.

Pipette le mélange de haut en bas doucement environ 10 fois. Centrifugeuse à 800 fois G pendant cinq minutes. Après centrifugation jeter le supernatant.

Et re-suspendre le précipité en deux à trois millilitres de DMEM complété par 10%FBS. Filtrer la suspension cellulaire à travers un filtre à mailles de 400, puis utiliser la suspension pour inoculer une boîte petri de 60 millimètres. Incuber les boîtes de Pétri pendant quatre à cinq jours à 37 degrés Celsius, en présence de 5% de dioxyde de carbone.

Lorsque la culture a atteint 90% de confluence, laver les cellules une fois à l’aide de 1XPBS. Ensuite, pour digérer les cellules de Schwann, ajouter un millilitre de trypsine de 0,25% à 37 degrés Celsius par plat de 60 millimètres. Après huit à 10 secondes à température ambiante, arrêter la digestion, en ajoutant trois millilitres de DMEM complété par 10%FBS.

Pour détacher les cellules de Schwann, soufflez doucement sur la cellule avec une pipette. Vérifiez au microscope que les cellules sont détachées. Puis recueillir le milieu, qui contient les cellules Swan, et centrifugeuse à 800 fois G pendant cinq minutes.

Jetez le supernatant et suspendez le précipité en trois millilitres de milieu. Utilisez cette suspension pour inoculer des boîtes de Pétri non cirés de 60 millimètres et incuber les plats à 37 degrés Celsius pendant 30 à 45 minutes. Marques pour le milieu, qui contiendra les cellules de Schwann à un plat moyen enduit de poly L lysine, et incuber le plat à 37 degrés Celsius pendant deux jours.

Après avoir enlevé le milieu contenant les cellules de Schwann laver les fibroblastes, adhérant à la vaisselle Petri avec 1XPBS. Pour digérer les fibroblastes, ajouter un millilitre de trypsine de 0,25% à 37 degrés Celsius. Après avoir suivi la digestion pour procéder pendant deux minutes à 37 degrés Celsius, mettre fin à la digestion en ajoutant DMEM complété par 10%FBS.

Pour détacher les fibroblastes, utilisez une pipette pour souffler sur le fond du plat. Recueillir le milieu, y compris les fibroblastes, et le transférer dans des tubes de centrifugeuse. Centrifuger les tubes à 800 fois G pendant cinq minutes.

Jetez le supernatant, et resuspendez le précipité avec deux millilitres de DMEM contenant 10%FBS. Inoculer les cellules dans des boîtes de Pétri non codées de 60 millimètres et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 à 45 minutes. Isoler les fibroblastes qui adhéreront aux boîtes de Pétri, en enlevant et en jetant le milieu de croissance.

Ajouter trois millilitres de DMEM complétés par 10%FBS. Incuber à 37 degrés Celsius pendant deux jours jusqu’à ce que le passage d’une cellule atteigne 90% confluent. Répétez la digestion différentielle et l’adhérence.

Après avoir culture le passage aux fibroblastes et aux cellules de Schwann pendant deux jours, digérer les cellules, les recueillir et les compter. Inoculate PLL diapositives enduites à une concentration d’une fois 10 de ces cellules par puits pour la coloration ICC. La microscopie contrastée de Bay montre la morphologie des cellules et des fibroblastes cultivés de Schwann tout au long du processus d’isolement.

Après un temps de culture prolongé, les cellules de Schwann ont été regroupées entre les fibroblastes ou situées à la surface des fibroblastes. Après digestion pendant 10 secondes, les cellules de Schwann, indiquées par les flèches rouges, étaient rondes tandis que les fibroblastes restaient à plat et étaient fixées au fond du plat. Après isolement par digestion différentielle et l’adhérence différentielle les morphologies cellulaires typiques ont été observées pour les quatre types de cellules.

Fibroblastes moteurs, fibroblastes sensoriels, cellules schwann motrices et cellules sensorielles de Schwann. Les fibroblastes sensoriels et moteurs ont été visualisés à l’aide d’un microscope à balayage laser focal cône. Les fibroblastes ont été tachés d’anticorps contre le colorant CD 90 X33342 a été utilisé pour étiqueter les noyaux cellulaires.

Les images fusionnées de l’immunostaining de fibroblastes et de la coloration nucléaire, ont indiqué que 92,51% et 92,64% de CD 90 et de cellules co-étiquetées hexed, étaient présentes dans les fibroblastes moteurs et sensoriels respectivement. Les cellules sensorielles et motrices de Schwann ont été visualisées à l’aide d’un microscope à balayage laser confocal. Les cellules de Schwann ont été tachées d’anticorps contre le colorant S100 X33342 a été utilisé pour étiqueter les noyaux cellulaires.

Les images de fusion de l’immunostaining de cellules swan et de la coloration nucléaire ont indiqué la présence de 91,61% et 93,56% de cellules co-étiquetées S100 et hexed dans les cellules motrices et sensorielles de Schwann, respectivement. La pureté cellulaire a également été analysée à l’aide de la cytométrie du débit. Dans les cultures de fibroblaste, approximativement 90% des cellules étaient des fibroblastes, indiqués par M2 dans les graphiques de FCA tandis que les cellules restantes étaient des cellules de Schwann.

Dans les cultures cellulaires de Schwann, plus de 92% des cellules étaient des cellules de Schwann, toujours indiquées par M2 dans les graphiques fca, tandis que les cellules restantes étaient des fibroblastes. Ce protocole est rarement utile pour commencer le mécanisme de régénération de neurosensorisation et de nerf moteur des fibroblastes, et la transplantation de cellules de Schwann, pour favoriser la régénération nerveuse.