Name: Purification des fibroblastes et des cellules de Schwann des nerfs sensoriels et moteurs in vitro (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Apprenez à purifier des fibroblastes et des cellules de Schwann à partir de nerfs sensitifs et moteurs in vitro. Cette méthode permet d'obtenir des cultures cellulaires de haute pureté pour étudier la régénération nerveuse.

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Cette étude a été soutenue par le National Key Research and Development Program of China (Grant No. 2017YFA0104703), la National Natural Foundation of China (Grant No. 31500927).

Cette étude a été réalisée conformément aux Lignes directrices institutionnelles sur les soins aux animaux de l’Université de Nantong. Toutes les procédures, y compris les sujets animaux, ont été approuvées de manière éthique par le Comité d’administration des animaux expérimentaux, province du Jiangsu, Chine.
1. Isolement et culture des fibroblastes et des SC des nerfs moteurs et sensoriels
<ol><li>Utilisez des rats Sprague-Dawley (SD) vieux de sept jours (n=4) fournis par le Experimental Animal Center de l’Université de Nantong en Chine. Placer les rats dans un réservoir contenant 5% d’isoflurane pendant 2-3 minutes, laisser les animaux respirer lentement et n’avoir aucune activité indépendante, puis désinfecter à l’aide de 75% d’éthanol avant la décapitation.</li>
	<li>Utilisez des ciseaux pour couper la peau arrière pendant environ 3 cm et enlever la colonne vertébrale. Ouvrez soigneusement le canal vertébral pour exposer la moelle épinière.</li>
	<li>Maintenir la moelle épinière dans une boîte de Pétri de 60 mm avec 2-3 mL de solution de sel équilibrée (HBSS) de D-Hanks glacée.</li>
	<li>Basé sur la structure anatomique, exciser la racine ventrale (nerf moteur) puis la racine dorsale (nerf sensoriel) sous un microscope de dissection. Ensuite, placez-les dans une solution de sel équilibrée (HBSS) glacée de D-Hanks.</li>
	<li>Après avoir enlevé le HBSS, couper les nerfs en morceaux de 3-5 mm avec des ciseaux et digérer avec 1 mL de 0,25% (w/v) trypsin à 37 °C pendant 18-20 min. Ensuite, compléter avec 3-4 mL de DMEM contenant 10% de sérum bovin foetal (FBS) pour arrêter la digestion.</li>
	<li>Pipette le mélange de haut en bas doucement environ 10 fois et la centrifugeuse à 800 x g pendant 5 min. Après cela, jeter le supernatant et suspendre le précipité en 2-3 mL de DMEM complété par 10% FBS.</li>
	<li>Filtrer la suspension cellulaire à l’aide d’un filtre à mailles de 400, puis inoculer les cellules dans une boîte et une culture Petri de 60 mm à 37 °C en présence de 5 % de CO2. Après 4-5 jours de culture, isoler le passage 0 (p0) fibroblastes et SC après avoir atteint 90% confluence.</li>
	<li>Isolement et culture des SC (Figure 1)<ol>
<li>Laver les cellules une fois à l’aide de 1x PBS. Ajouter 1 mL de 0,25% (w/v) de trypsie (37 °C) par boîte de Pétri de 60 mm pour digérer les cellules de 8 à 10 s à température ambiante. Après cela, ajouter 3 mL de DMEM complété avec 10% FBS pour arrêter la digestion.</li>
		<li>Souffler doucement le mélange pour détacher les SC avec une pipette. Ensuite, recueillir et centrifuger les SC à 800 x g pendant 5 min.</li>
		<li>Jetez le supernatant et suspendez le précipité dans 3 ml de DMEM avec 10% FBS, 1% de pénicilline/streptomycine, 2 μM de forskolin et 10 ng/mL HRG, puis inoculer les cellules dans une boîte de 60 mm petri non enduite. Après avoir cuté à 37 °C pendant 30-45 min, les fibroblastes (un certain nombre de fibroblastes sont digérés avec des SC) s’attachent au fond du plat.</li>
		<li>Transférer le supernatant (y compris les SC) dans un autre plat et une culture mi-couchés poly-L-lysine (PLL) à 37 °C pendant 2 jours.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolement et culture des fibroblastes (Figure 1)<ol>
<li>Après avoir enlevé les SC (comme indiqué à l’étape 1.8), laver les fibroblastes restants dans la vaisselle avec 1x PBS, puis ajouter 1 mL de 0,25% (w/v) trypsin pour digérer les fibroblastes pendant 2 min à 37 °C.</li>
		<li>Ajouter DMEM complété avec 10% FBS pour mettre fin à la digestion. Soufflez les fibroblastes à l’aide d’une pipette, puis collectez-les et centrifugez à 800 x g pendant 5 min.</li>
		<li>Jetez le supernatant, suspendez le précipité avec 2 mL de DMEM contenant 10% de FBS, puis inoculez les cellules dans une boîte de Pétri non garnie de 60 mm. Les fibroblastes après la culture pendant 30-45 min à 37 °C s’attachent au fond du plat. Jetez le supernatant (y compris quelques nombres de SC). Ajouter ensuite 3 mL de DMEM complétés par 10% de FBS dans le plat et la culture des fibroblastes à 37 °C pendant 2 jours.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Passer les cellules p1 jusqu’à ce qu’elles atteignent 90% confluence. Ensuite, purifier par la digestion différentielle et l’adhérence différentielle à nouveau comme décrit dans les sections 1.8 et 1.9.</li>
	<li>Digestez les fibroblastes p2 et les SC après la culture pendant 2 jours, puis recueillir les cellules, compter et inoculer en 1 x 105 nombres/bien sur des diapositives enduites de PLL pour l’immunocytochimie (ICC).</li>
</ol>2. ICC pour l’identification de la pureté cellulaire
<ol><li>Culturez les cellules pendant 24 h à 37 °C et effectuez la coloration icc après la digestion différentielle et l’adhérence différentielle des fibroblastes et des SC moteurs et sensoriels.</li>
	<li>Laver les fibroblastes et les SC moteurs et sensoriels avec 1x PBS et les fixer en 200 μL/puits de paraformaldéhyde à 4 % (pH 7,4) pendant 18 min à température ambiante.</li>
	<li>Bloquer l’échantillon de SC avec un tampon de blocage (0,1 % de Triton X-100 dans 0,01 M de SÉRUM CONTENANT 5 % de sérum de chèvre) et bloquer les fibroblastes d’échantillon avec un tampon de blocage (0,01 M pbs contenant 5 % de sérum de chèvre) pendant 45 min à 37 °C après les avoir lavés avec trois fois de PBS.</li>
	<li>Retirez la mémoire tampon de blocage et incuber avec les anticorps primaires suivants : anticorps anti-CD90 monoclonal souris (marqueur spécifique pour les fibroblastes) (1:1000) pour les fibroblastes et les anticorps anti-S100 de souris (marqueur spécifique pour les SC) (1:400) pour les SC à 4 °C pendant la nuit.</li>
	<li>Jetez les anticorps primaires, lavez-les trois fois avec pbs et incuber avec les anticorps secondaires suivants : Alexa Fluor 594 goatoile igG (1:400) pour les fibroblastes et IgG anti-souris de chèvre conjuguée à 488 (1:400) pour les SC à température ambiante pendant 1,5 h.</li>
	<li>Laver les échantillons trois fois avec pbs, et tacher les noyaux avec 5 μg/mL Hoechst 33342 colorant pendant 10 min à température ambiante. Laver l’échantillon avec 1x PBS trois fois et les monter à l’aide du support de montage (20 μL/slide) sur la glissière en verre.</li>
	<li>Prenez les photographies cellulaires par microscope à balayage laser confocal dans trois champs aléatoires pour chaque puits. Évaluez le nombre total de cellules positives cd90, de cellules S100 positives, puis calculez le pourcentage de cellules CD90 positives et de cellules S100 positives, respectivement. Effectuer la coloration en triple.</li>
</ol>3. Analyse de cytométrie de flux (FCA) pour l’identification de la pureté cellulaire
<ol><li>Évaluer la pureté des fibroblastes et des SC moteurs et sensoriels tels que décrits précédemment par FCA16. En bref, digérer les fibroblastes et les SC moteurs et sensoriels p2 avec une trypsie de 0,25 % (w/v), réutilir les granulés cellulaires et les incuber en milieu de fixation à température ambiante pendant 15 min.</li>
	<li>Incuber les cellules avec un milieu de perméabilisation et une sonde à l’aide d’anticorps anti-CD90 monoclonal souris (0,1 μg/106 cellules, 200 μL) pour les fibroblastes et les anticorps anti-S100 de souris (1:400, 200 μL) pour les SC à température ambiante pendant 30 min, respectivement.</li>
	<li>Incuber les cellules avec igG igG anti-souris de chèvre conjuguée à 488 pendant 30 min. Utilisez le calibre FACS pour effectuer la cytométrie de flux et analysez les données à l’aide du logiciel Cell Quest.</li>
	<li>Incuber les cellules uniquement avec 488-conjugués chèvre anti-souris IgG (fibroblastes Group) et la souris IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Contrôle de l’isotype (groupe SC), qui sert de contrôle négatif.</li>
</ol>4. Analyse statistique
<ol><li>Présenter toutes les données comme moyens ± SEM. Évaluer les différences statistiques dans les données par t-testnon apparié à l’aide de GraphPad Prism 6.0. Définissez la signification statistique à p<0.05. Effectuez tous les tests en triple.</li>
</ol>

<ol><li>Stierli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+the+homeostasis+and+regeneration+of+peripheral+nerve+is+distinct+from+the+CNS+and+independent+of+a+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28The+Company+of+Biologists%29%22%5BJournal%5D)">The regulation of the homeostasis and regeneration of peripheral nerve is distinct from the CNS and independent of a stem cell population.</a> Development (The Company of Biologists). , (2018).</li>
<li>Schubert, T., Friede, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endoneurial+fibroblasts+in+myelin+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">The role of endoneurial fibroblasts in myelin degradation.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 40 (2), 134-154 (1981).</li>
<li>Dreesmann, L., Mittnacht, U., Lietz, M., Schlosshauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+fibroblast+impact+on+Schwann+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nerve fibroblast impact on Schwann cell behavior.</a> European Journal of Cell Biology. 88 (5), 285-300 (2009).</li>
<li>Lavdas, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+engineered+to+express+the+cell+adhesion+molecule+L1+accelerate+myelination+and+motor+recovery+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Schwann cells engineered to express the cell adhesion molecule L1 accelerate myelination and motor recovery after spinal cord injury.</a> Experimental Neurology. 221 (1), 206-216 (2010).</li>
<li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphB+signaling+directs+peripheral+nerve+regeneration+through+Sox2-dependent+Schwann+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting.</a> Cell. 143 (1), 145-155 (2010).</li>
<li>Benito, C., Davis, C. M., Gomez-Sanchez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+Controls+the+Long-Term+Survival+and+Phenotype+of+Repair+Schwann+Cells+during+Nerve+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">STAT3 Controls the Long-Term Survival and Phenotype of Repair Schwann Cells during Nerve Regeneration.</a> Journal of Neuroscience Research. 37 (16), 4255-4269 (2017).</li>
<li>Zhang, Z. J., Jiang, B. C., Gao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+in+neuron-glial+cell+interaction+and+pathogenesis+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Chemokines in neuron-glial cell interaction and pathogenesis of neuropathic pain.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (18), 3275-3291 (2017).</li>
<li>Hoke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+express+motor+and+sensory+phenotypes+that+regulate+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Schwann cells express motor and sensory phenotypes that regulate axon regeneration.</a> Journal of Neuroscience. 26 (38), 9646-9655 (2006).</li>
<li>Brushart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+phenotype+is+regulated+by+axon+modality+and+central-peripheral+location%2C+and+persists+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experiment+Neurology%22%5BJournal%5D)">Schwann cell phenotype is regulated by axon modality and central-peripheral location, and persists in vitro.</a> Experiment Neurology. 247, 272-281 (2013).</li>
<li>He, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Gene+Expression+in+Primary+Cultured+Sensory+and+Motor+Nerve+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential Gene Expression in Primary Cultured Sensory and Motor Nerve Fibroblasts.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 1016(2018).</li>
<li>Weinstein, D. E., Wu, R. Chapter 3, Unit 17: Isolation and purification of primary Schwann cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeinstein%2C+DE+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22">Current Protocols in Neuroscience</a>. , (2001).</li>
<li>Palomo Irigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Purification+of+Primary+Rodent+Schwann+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Purification of Primary Rodent Schwann Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1791, 81-93 (2018).</li>
<li>Cheng, L., Khan, M., Mudge, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcitonin+gene-related+peptide+promotes+Schwann+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcitonin gene-related peptide promotes Schwann cell proliferation.</a> Journal of Cell Biology. 129 (3), 789-796 (1995).</li>
<li>Pannunzio, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+of+selecting+Schwann+cells+from+adult+mouse+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A new method of selecting Schwann cells from adult mouse sciatic nerve.</a> Journal of Neuroscience Methods. 149 (1), 74-81 (2005).</li>
<li>Shen, M., Tang, W., Cao, Z., Cao, X., Ding, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rat+Schwann+cells+based+on+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of rat Schwann cells based on cell sorting.</a> Molecular Medicine Reports. 16 (2), 1747-1752 (2017).</li>
<li>He, Q., Man, L., Ji, Y., Ding, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+in+the+biological+characteristics+between+primary+cultured+sensory+and+motor+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Comparison in the biological characteristics between primary cultured sensory and motor Schwann cells.</a> Neuroscience Letters. 521 (1), 57-61 (2012).</li>
<li>Weiss, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+and+transcriptomics+of+peripheral+nerve+tissue+and+cells+unravel+new+aspects+of+the+human+Schwann+cell+repair+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Proteomics and transcriptomics of peripheral nerve tissue and cells unravel new aspects of the human Schwann cell repair phenotype.</a> Glia. 64 (12), 2133-2153 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les deux principales populations cellulaires de nerfs périphériques comprenaient les SC et les fibroblastes. Les fibroblastes et SC principalement cultivés peuvent aider avec précision à modéliser la physiologie des fibroblastes et des SC pendant le développement et la régénération des nerfs périphériques. L’étude a montré que les cellules nerveuses sciatiques de rat P7 contenaient environ 85% des SC S100-positifs, 13% des fibroblastes OX7-positifs et seulement 1,5% des macrophages OX42-positifs13...

Dans le système nerveux périphérique, les fibres nerveuses se composent principalement d’axones, de cellules Schwann (SC) et de fibroblastes, et contient également un petit nombre de macrophages, de cellules endothéliales microvasculaires et de cellules immunitaires1. Les SC enveloppent les axones dans un rapport de 1:1 et sont entourés d’une couche de tissu conjonctif appelée endoneurium. Les axones sont ensuite regroupés pour former des groupes appelés fascicles, et chaque fascicle est enveloppé dans une couche de tissu conjonctif connue sous le nom de périneurium. Enfin, la fibre nerveuse entière est enveloppée dans une couche de tissu conjonctif, qui est appelé l’épineurium. Dans l’endoneurium, la population cellulaire entière est composée de 48% SC, et une partie substantielle des cellules restantes implique des fibroblastes2. En outre, les fibroblastes sont des composants importants de tous les compartiments nerveux, y compris l’épineurium, le périneurium, et l’endoneurium3. De nombreuses études ont indiqué que les SC et les fibroblastes jouent un rôle crucial dans le processus de régénération après les lésions nerveuses périphériques4,5,6. Après la transection du nerf périphérique, les fibroblastes périneuriaux régulent le tri cellulaire par l’intermédiaire de la voie de signalisation ephrin-B/Ephb2 entre les SC et les fibroblastes, guidant davantage la repousse axonale à travers les blessures5. Les fibroblastes périphériques de nerf sécrètent la protéine de tenascine-C et améliorent la migration des SC pendant la régénération de nerf par la voie de signalisation β1-intégrine7. Cependant, les SC et les fibroblastes utilisés dans les études ci-dessus ont été dérivés du nerf sciatique, qui inclut les nerfs sensoriels et moteurs.
Dans le système nerveux périphérique, les nerfs sensoriels (nerfs afférents) conduisent la signalisation sensorielle des récepteurs au système nerveux central (SNC), tandis que les nerfs moteurs (nerfs efferents) conduisent des signaux du SNC aux muscles. Des études antérieures ont indiqué que les SC expriment des phénotypes moteurs et sensoriels distincts et sécrètent des facteurs neurotrophiques pour soutenir la régénération périphérique du nerf8,9. Selon une étude récente, les fibroblastes expriment également différents phénotypes moteurs et sensoriels et affectent la migration des SC10. Ainsi, l’exploration des différences entre les fibroblastes/SC des nerfs moteurs et sensoriels nous permet d’étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents complexes de la régénération spécifique du nerf périphérique.
À l’heure actuelle, il existe de nombreuses façons de purifier les SC et les fibroblastes, y compris l’application d’agents antimitotiques, cytolyse à médiation d’anticorps11,12, immunopanning séquentiel13 et laminine substrat14. Cependant, toutes les méthodes ci-dessus éliminent les fibroblastes et ne préservent que les SC. Les SC et les fibroblastes hautement purifiés peuvent être obtenus par la technologie de tri de cytométrie de flux15, mais c’est une technique longue et coûteuse. Ainsi, dans cette étude, une simple méthode de digestion différentielle et d’adhérence différentielle pour purifier et isoler les fibroblastes et les SC des nerfs sensoriels et moteurs a été développée afin d’obtenir un grand nombre de fibroblastes et de SC plus rapidement.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 594 Chèvre Anti-Souris IgG(H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11005</td><td>Dilution : 1:400</td></tr><tr><td>CoraLite488-conjugué Affinipure Chèvre Anti-Souris IgG(H+L)</td><td>Proteintech</td><td>SA00013-1</td><td>Dilution : 1:400</td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Cell Quest</td><td>Becton Dickinson Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée de D-Hank</td><td>Gibco</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Corning</td><td></td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>Olympus</td><td>SZ2-ILST</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10099-141C</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F6886-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield Montage Medium</td><td>Abcam</td><td>ab104135</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de fixation/Milieu de perméabilisation</td><td>Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD</td><td>GAS005</td><td></td></tr><tr><td>Cytométrie en flux</td><td>Becton Dickinson Biosciences</td><td>FACS Calibur</td><td></td></tr><tr><td>Souris IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Contrôle des isotypes</td><td>Abcam</td><td>ab106163</td><td>Dilution : 1:400</td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal anti-CD90 de souris</td><td>Abcam</td><td>ab225</td><td>Dilution : 1:1000 pour ICC, 0,1 et micro ; g pour cellules 106 pour</td></tr> anticorps <tr><td>anti-S100 de souris</td> Flow Cyt <td>Abcam</td><td>ab212816</td><td>Dilution : 1:400</td></tr><tr><td>Polylysine (PLL)</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Humain recombinant NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 Domaine EGF Protéine R</td><td>& D Systems</td><td>396-HB-050</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % (p/v) trypsine</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr></tbody></table>

purification des fibroblastes et des cellules de schwann des nerfs sensoriels et moteurs in vitro

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

Les principales cellules du système nerveux périphérique sont les cellules Schwann (SC) et les fibroblastes. Ces deux cellules expriment distinctement les phénotypes sensoriels et moteurs impliqués dans différents modèles d’expression de gène de facteur neurotrophique et d’autres processus biologiques, affectant la régénération de nerf. La présente étude a établi un protocole pour obtenir des SCs et des fibroblastes hautement purifiés de rat sensoriels et moteurs plus rapidement. La racine ventrale (nerf moteur) et la racine dorsale (nerf sensoriel) des rats néonatals (7 jours) ont été dissociées et les cellules ont été cultivées pendant 4-5 jours, suivies par l’isolement des fibroblastes sensoriels et moteurs et des SC en combinant la digestion différentielle et les méthodes d’adhérence différentiellement. Les résultats des analyses d’immunocytochimie et de cytométrie de flux ont montré que la pureté des SC et des fibroblastes sensoriels et moteurs était de >90%. Ce protocole peut être utilisé pour obtenir un grand nombre de fibroblastes sensoriels et moteurs / SC plus rapidement, contribuant à l’exploration de la régénération sensorielle et motrice des nerfs.

Observation microscopique légère Les SC et les fibroblastes sont les deux principales populations cellulaires obtenues dans la culture cellulaire primaire à partir des tissus nerveux. Après l’inoculation pendant 1 h, la plupart des cellules ont adhéré au fond du plat, et la morphologie cellulaire est passée de ronde à ovale. Après avoir passé 24 h à cultiver, les SC ont présenté une morphologie bipolaire ou tripolaire et la longueur de ceux-ci variait de 100 à 200 μm. ...

Ici, nous présentons une méthode pour purifier les fibroblastes et les cellules de Schwann des nerfs sensoriels et moteurs in vitro.

Purification des fibroblastes et des cellules de Schwann des nerfs sensoriels et moteurs in vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...

Ce protocole peut être utilisé pour obtenir un grand nombre de capteurs et les cellules du moteur fibroblaste et Schwann rapidement. Les cellules obtenues grâce à ce message peuvent être utilisées dans l’étude de la régénération nerveuse et des maladies du système nerveux. Nous montrons que la démonstration peut représenter l’expérimental pour mieux contrôler le temps de l’étape digestive différentielle et rendre les étapes expérimentales plus faciles à comprendre.Pour éclater utiliser des ciseaux pour faire une incision de trois centimètres, dans la peau du dos. Retirer la colonne vertébrale. Ouvrez soigneusement le canal vertébral pour exposer la moelle épinière.Dentelle de la moelle épinière dans une boîte de Pétri de 60 millimètres, avec trois à quatre millilitres de glace froide D Hanks solution de sel équilibré sous un microscope disséquant, exciser la racine ventrale et la racine dorsale. Placez-les dans la solution de sel équilibré D Hanks glacée. Après avoir enlevé le HBSS, couper les nerfs en morceaux de trois à cinq millimètres, avec des ciseaux.Ajouter un millilitre de trypsine de 0,25 % et transférer les morceaux nerveux dans cinq tubes de centrifugeuse millilitres. In

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Cette vidéo montre une procédure permettant d’isoler les neurones du ganglion de la racine dorsale (DRG) à partir d’embryons de rats et de les co-cultiver avec des précurseurs de cellules de Schwann pour générer des cellules de Schwann matures. Les DRG isolés sont traités pour isoler les neurones et les cellules gliales. Les cellules isolées sont cultivées pour purifier les neurones, qui sont ensuite co-cultivés avec des cellules de type cellules de Schwann (SCLC) dans un milieu de co-culture.

Isolement de neurones DRG et coculture avec des précurseurs de cellules de Schwann pour générer des cellules de Schwann

Cette vidéo présente un protocole d’isolement et de culture de cellules de Schwann à partir de tissus dermiques humains. Le derme humain contient différents types de cellules, notamment des fibroblastes et des cellules de Schwann. Après l’isolement, les cellules sont traitées avec un agent antimitotique pour éliminer les fibroblastes proliférants, ce qui permet d’obtenir une culture pure de cellules de Schwann.

Isolement et culture de cellules de Schwann primaires à partir d’un derme humain

Cette vidéo décrit l’isolement et la culture de cellules de Schwann à partir de racines spinales de souris. Des cellules isolées sont ensuite cultivées dans des milieux spécifiques. Les cellules de Schwann sont isolées par digestion différentielle et par adhérence. Ils sont ensuite transférés sur des lamelles recouvertes d’une matrice extracellulaire pour être fixés et proliférer.

Isolement des cellules de Schwann à partir de racines vertébrales de souris

Cette vidéo montre le modèle de coculture d’un explant ganglionnaire de la racine dorsale et de cellules de Schwann. Dans des conditions de coculture, l’acide ascorbique favorise la différenciation des cellules de Schwann en formes myélinisantes. Les cellules de Schwann myélinisantes enveloppent les axones plusieurs fois pour créer une gaine de myéline, essentielle à la fonction nerveuse.

Co-culture d’un explant de ganglion de la racine dorsale avec des cellules de Schwann pour la myélinisation des neurones

Cette vidéo montre une méthode pour isoler les cellules de Schwann des fibres du nerf sciatique de souris.

Séparation magnétique des cellules de Schwann des nerfs sciatiques de souris

Source : Han, J., et.al. Régulation de la croissance des cellules de Schwann par champ électrique pulsé nanoseconde pour la régénération des nerfs périphériques in vitro. J. Vis. Exp. (2024)Cette vidéo démontre l’application de la technique du champ électrique pulsé nanoseconde (nsPEF) pour moduler la croissance des cellules de Schwann (SC). Les impulsions électriques rapides induisent des nanopores transitoires dans les membranes SC, facilitant l’afflux de calcium qui active les voies de...

Régulation de la croissance des cellules de Schwann in vitro à l’aide de la technique du champ électrique pulsé nanoseconde

Cet article décrit un système de culture neuronale qui peut être utilisé pour obtenir de grandes quantités d’échantillons axonaux purs pour des analyses biochimiques et immunocytochimiques. Cette technique permettra une meilleure compréhension de la physiologie axonale normale et des voies de signalisation menant à la neurodégénérescence.

La production et l&#39;isolement des axones de neurones sensoriels de l&#39;analyse biochimique Utilisation des filtres poreux

Les cellules stromales de la moelle (MSC) avec potentiel neuronal existent dans la moelle osseuse. Notre protocole enrichit cette population de cellules par un préconditionnement hypoxique et les dirige ensuite pour devenir des cellules Schwann matures.

Le préconditionnement hypoxique des cellules progénitrices dérivées de la moelle en tant que source pour la génération de cellules Schwann mûres

L’étude de la cicatrisation des plaies associée aux lésions musculo-squelettiques nécessite souvent l’évaluation des interactions in vitro entre les cellules de Schwann (SC), les kératinocytes et les fibroblastes. Ce protocole décrit l’isolement, la culture et la caractérisation de ces cellules primaires à partir du prépuce humain.

Isolement, culture et caractérisation des cellules de Schwann primaires, des kératinocytes et des fibroblastes du prépuce humain

Dans le système de coculture des ganglions de la racine dorsale et des cellules de Schwann, la myélinisation du système nerveux périphérique peut être étudiée. Ce modèle offre des possibilités expérimentales d’observer et de quantifier la myélinisation périphérique et d’étudier les effets des composés d’intérêt sur la gaine de myéline.

Myélinisation in vitro d’axones périphériques dans une coculture d’explants de ganglions radiculaires dorsaux de rat et de cellules de Schwann

Ici, nous présentons un protocole d’application d’un champ électrique à impulsions nanosecondes (nsPEF) pour stimuler les cellules de Schwann in vitro. La capacité de synthèse et de sécrétion des facteurs pertinents et les changements de comportement cellulaire ont validé la stimulation réussie à l’aide de nsPEF. L’étude donne une vision positive de la méthode de régénération des nerfs périphériques.

Régulation de la croissance des cellules de Schwann par un champ électrique pulsé nanoseconde pour la régénération des nerfs périphériques in vitro

Apprenez à purifier des fibroblastes et des cellules de Schwann à partir de nerfs sensitifs et moteurs in vitro. Cette méthode permet d'obtenir des cultures cellulaires de haute pureté pour étudier la régénération nerveuse.

Purification des fibroblastes et des cellules de Schwann des nerfs sensoriels et moteurs in vitro

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